Name: quantification of metal leaching in immobilized metal affinity chromatography
Uploaded: 2020-01-17T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography at JoVE.com

Dette materiale er baseret på arbejde støttet af National Science Foundation under Grant MCB-1817448 og ved en pris fra Thomas F. og Kate Miller Jeffress Memorial Trust, Bank of America, trustee og den specificerede donor Hazel Thorpe Carman og George Gay Carman Tillid.

1. klargøring af analyse komponenten
<ol><li>De kromatografi fraktioner, der skal vurderes ved hjælp af optisk absorbans, bestemmes ved 280 Nm eller alternative metoder til protein kvantificering for at identificere de proteinberigede fraktioner. Bemærk: til dette arbejde brugte vi en diodearray UV-Vis Spektrofotometer. For at øge dataoverførselshastigheden kan der anvendes en plade læser, som er i stand til at måle UV-Vis-absorbans.</li>
	<li>Klargøring af nødvendige analysekomponenter<ol>
<li>Forbered ell...

<ol>
	<li>Porath, J., Carlsson, J. A. N., Olsson, I., Belfrage, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).</li><li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized-Metal+Affinity+Chromatography+(IMAC):+A+Review.">Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review.</a> Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).</li><li>Takeda, N., Matsuoka, T., Gotoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiality+of+IMAC+as+sample+pretreatment+tool+in+food+analysis+for+veterinary+drugs.">Potentiality of IMAC as sample pretreatment tool in food analysis for veterinary drugs.</a> Chromatographia. 72 (1/2), 127-131 (2010).</li><li>Felix, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+serum+proteins+involved+in+pancreatic+cancer+cachexia.">Identification of serum proteins involved in pancreatic cancer cachexia.</a> Life sciences. 88 (5-6), 218-225 (2011).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+enhanced+laser+desorption/ionization+profiling:+New+diagnostic+method+of+HBV-related+hepatocellular+carcinoma.">Surface enhanced laser desorption/ionization profiling: New diagnostic method of HBV-related hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (1), 55-62 (2009).</li><li>Goldsmith, J. O., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+bacterial+photosynthetic+reaction+centers+with+an+engineered+poly-histidine+tag.">Rapid isolation of bacterial photosynthetic reaction centers with an engineered poly-histidine tag.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1276 (3), 171-175 (1996).</li><li>Guergova-Kuras, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+one-step+purification+of+a+fully+active+polyhistidine-tagged+cytochrome+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides.">Expression and one-step purification of a fully active polyhistidine-tagged cytochrome bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides.</a> Protein Expression and Purification. 15 (3), 370-380 (1999).</li><li>Mitchell, D. M., Gennis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+wildtype+and+mutant+cytochrome+c+oxidase+from+Rhodobacter+sphaeroides+by+Ni(2+)-NTA+affinity+chromatography.">Rapid purification of wildtype and mutant cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides by Ni(2+)-NTA affinity chromatography.</a> FEBS Letters. 368 (1), 148-150 (1995).</li><li>Tian, H., White, S., Yu, L., Yu, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+head+domain+movement+of+the+rieske+iron-sulfur+protein+in+electron+transfer+reaction+of+the+cytochrome+bc1+complex.">Evidence for the head domain movement of the rieske iron-sulfur protein in electron transfer reaction of the cytochrome bc1 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (11), 7146-7152 (1999).</li><li>Tian, H., Yu, L., Mather, M. W., Yu, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexibility+of+the+neck+region+of+the+rieske+iron-sulfur+protein+is+functionally+important+in+the+cytochrome+bc1+complex.">Flexibility of the neck region of the rieske iron-sulfur protein is functionally important in the cytochrome bc1 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (43), 27953-27959 (1998).</li><li>Louie, A. Y., Meade, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+complexes+as+enzyme+inhibitors.">Metal complexes as enzyme inhibitors.</a> Chemical Reviews. 99 (9), 2711-2734 (1999).</li><li>Tam&#225;s, M. J., Sharma, S. K., Ibstedt, S., Jacobson, T., Christen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heavy+Metals+and+Metalloids+As+a+Cause+for+Protein+Misfolding+and+Aggregation.">Heavy Metals and Metalloids As a Cause for Protein Misfolding and Aggregation.</a> Biomolecules. 4 (1), 252-267 (2014).</li><li>Gerencser, L., Maroti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retardation+of+proton+transfer+caused+by+binding+of+the+transition+metal+ion+to+the+bacterial+reaction+center+is+due+to+pKa+shifts+of+key+protonatable+residues.">Retardation of proton transfer caused by binding of the transition metal ion to the bacterial reaction center is due to pKa shifts of key protonatable residues.</a> Biochemistry. 40 (6), 1850-1860 (2001).</li><li>Klishin, S. S., Junge, W., Mulkidjanian, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash-induced+turnover+of+the+cytochrome+bc1+complex+in+chromatophores+of+Rhodobacter+capsulatus:+binding+of+Zn2++decelerates+likewise+the+oxidation+of+cytochrome+b,+the+reduction+of+cytochrome+c1+and+the+voltage+generation.">Flash-induced turnover of the cytochrome bc1 complex in chromatophores of Rhodobacter capsulatus: binding of Zn2+ decelerates likewise the oxidation of cytochrome b, the reduction of cytochrome c1 and the voltage generation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1553 (3), 177-182 (2002).</li><li>Link, T. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+ions+inhibit+the+QP+center+of+bovine+heart+mitochondrial+bc1+complex+by+blocking+a+protonatable+group.">Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bc1 complex by blocking a protonatable group.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (42), 25001-25006 (1995).</li><li>Block, H., Kubicek, J., Labahn, J., Roth, U., Sch&#228;fer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+comprehensive+quality+control+of+recombinant+human+Interleukin-1beta:+a+case+study+for+a+process+development+strategy.">Production and comprehensive quality control of recombinant human Interleukin-1beta: a case study for a process development strategy.</a> Protein Expression and Purification. 57 (2), 244-254 (2008).</li><li>Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+imidazole+to+the+heme+of+cytochrome+c1+and+inhibition+of+the+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides:+II.+Kinetics+and+mechanism+of+binding.">Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: II. Kinetics and mechanism of binding.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22522-22531 (2010).</li><li>Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+imidazole+to+the+heme+of+cytochrome+c1+and+inhibition+of+the+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides:+I.+Equilibrium+and+modeling+studies.">Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: I. Equilibrium and modeling studies.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22513-22521 (2010).</li><li>Bornhorst, J. A., Falke, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins+using+polyhistidine+affinity+tags.">Purification of proteins using polyhistidine affinity tags.</a> Methods in Enzymology. 326, 245-254 (2000).</li><li>Kokhan, O., Marzolf, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+transition+metal+leaching+in+metal+affinity+chromatography+with+hydroxynaphthol+blue.">Detection and quantification of transition metal leaching in metal affinity chromatography with hydroxynaphthol blue.</a> Analytical Biochemistry. 582, 113347 (2019).</li><li>Doyle, C., Naser, D., Bauman, H., Rumfeldt, J., Meiering, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+method+for+simultaneous+measurement+of+zinc+and+copper+in+metalloproteins+using+4-(2-pyridylazo)resorcinol.">Spectrophotometric method for simultaneous measurement of zinc and copper in metalloproteins using 4-(2-pyridylazo)resorcinol.</a> Analytical Biochemistry. 579, 44-56 (2019).</li><li>Furrer, J., Smith, G. S., Therrien, B., Gasser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inorganic Chemical Biology. , (2014).</li><li>Hogeling, S. M., Cox, M. T., Bradshaw, R. M., Smith, D. P., Duckett, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+proteins+in+whole+blood,+plasma+and+DBS,+with+element-labelled+antibody+detection+by+ICP-MS.">Quantification of proteins in whole blood, plasma and DBS, with element-labelled antibody detection by ICP-MS.</a> Analytical Biochemistry. 575, 10-16 (2019).</li><li>Yamasaki, S., Tsumura, A., Takaku, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultratrace+Elements+in+Terrestrial+Water+as+Determined+by+High-Resolution+ICP-MS.">Ultratrace Elements in Terrestrial Water as Determined by High-Resolution ICP-MS.</a> Microchemical Journal. 49 (2), 305-318 (1994).</li><li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+Formation+Between+Hydroxy+Naphthol+Blue+and+First+Row+Transition+Metal+Cyanide+Complexes.">Complex Formation Between Hydroxy Naphthol Blue and First Row Transition Metal Cyanide Complexes.</a> Analytical Letters. 10 (13), 1105-1113 (1977).</li><li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Transition+Metal+Ions+by+the+Calcium+Indicator+Hydroxy+Naphthol+Blue.">Binding of Transition Metal Ions by the Calcium Indicator Hydroxy Naphthol Blue.</a> Analytical Letters. 11 (4), 355-362 (1978).</li><li>Temel, N. K., Sertakan, K., G&#252;rkan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preconcentration+and+Determination+of+Trace+Nickel+and+Cobalt+in+Milk-Based+Samples+by+Ultrasound-Assisted+Cloud+Point+Extraction+Coupled+with+Flame+Atomic+Absorption+Spectrometry.">Preconcentration and Determination of Trace Nickel and Cobalt in Milk-Based Samples by Ultrasound-Assisted Cloud Point Extraction Coupled with Flame Atomic Absorption Spectrometry.</a> Biological Trace Element Research. 186 (2), 597-607 (2018).</li><li>Ferreira, S. L. C., Santos, B. F., de Andrade, J. B., Costa, A. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+derivative+spectrophotometric+determination+of+nickel+with+hydroxynaphthol+blue.">Spectrophotometric and derivative spectrophotometric determination of nickel with hydroxynaphthol blue.</a> Microchimica Acta. 122 (1), 109-115 (1996).</li><li>Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Self-Assembly+of+Monodisperse+Phospholipid+Bilayer+Nanodiscs+with+Controlled+Size.">Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (11), 3477-3487 (2004).</li><li>Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+extended+membrane+scaffold+proteins+for+self-assembly+of+soluble+nanoscale+lipid+bilayers.">Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 23 (11), 843-848 (2010).</li><li>Bonta, M., Hegedus, B., Limbeck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+dried-droplets+deposited+on+pre-cut+filter+paper+disks+for+quantitative+LA-ICP-MS+imaging+of+biologically+relevant+minor+and+trace+elements+in+tissue+samples.">Application of dried-droplets deposited on pre-cut filter paper disks for quantitative LA-ICP-MS imaging of biologically relevant minor and trace elements in tissue samples.</a> Analytica Chimica Acta. 908, 54-62 (2016).</li><li>Olmedo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+method+to+quantify+chromium,+cadmium,+manganese,+nickel+and+lead+in+human+whole+blood,+urine,+saliva+and+hair+samples+by+electrothermal+atomic+absorption+spectrometry.">Validation of a method to quantify chromium, cadmium, manganese, nickel and lead in human whole blood, urine, saliva and hair samples by electrothermal atomic absorption spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 659 (1), 60-67 (2010).</li><li>Shyamal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Selective+Turn-On+Fluorogenic+Chemosensor+for+Robust+Quantification+of+Zn(II)+Based+on+Aggregation+Induced+Emission+Enhancement+Feature.">Highly Selective Turn-On Fluorogenic Chemosensor for Robust Quantification of Zn(II) Based on Aggregation Induced Emission Enhancement Feature.</a> ACS Sensors. 1 (6), 739-747 (2016).</li><li>Kudo, H., Yamada, K., Watanabe, D., Suzuki, K., Citterio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-Based+Analytical+Device+for+Zinc+Ion+Quantification+in+Water+Samples+with+Power-Free+Analyte+Concentration.">Paper-Based Analytical Device for Zinc Ion Quantification in Water Samples with Power-Free Analyte Concentration.</a> Micromachines. 8 (4), 127 (2017).</li><li>Liu, R., Zhang, P., Li, H., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-cloth+integrated+with+gravity/capillary+flow+chemiluminescence+(GCF-CL):+towards+simple,+inexpensive,+portable,+flow+system+for+measuring+trivalent+chromium+in+water.">Lab-on-cloth integrated with gravity/capillary flow chemiluminescence (GCF-CL): towards simple, inexpensive, portable, flow system for measuring trivalent chromium in water.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 236 (C), 35-43 (2016).</li></ol>

Kolorimetrisk detektion af metaller ved hjælp af HNB giver en enkel måde at kvantificere graden af protein forurening ved overgangs metalioner fra IMAC-harpiks. Som vi etablerede i Ref. 20 binder ni2 + til hnb med 1:1 støkiometri og dissociationskonstant for ni-HNB-komplekse ændringer med ph. Men den komplekse Kd er i sub-nm-intervallet for alle anbefalede (7-12) pH-værdier. I praksis betyder det, at alle ni2 + i alle testede fraktioner vil binde sig til HNB, så længe der ikke er a...

Siden starten af Porath og kollegaer1, er immobiliseret metal affinitets kromatografi (iMac) blevet en metode til valg til hurtigt at adskille proteiner baseret på deres evne til at binde sig med overgangs metalioner som Zn2 +, ni2 +, cu2 +og co2 +. Dette er mest almindeligt gjort via manipuleret poly-histidin Tags og er nu en af de mest almindelige kromatografiske rensningsteknikker til isolering af rekombinante proteiner2. IMac har også fundet applikationer ud over rekombinant protein rensning som en måde at isolere quinoloner, tetracykliner, aminoglycosider, makrolider, og β-lactamer til fødevare prøveanalyse3 og som et skridt i at identificere blod-serumprotein markører for lever og bugspytkirtelkræft4,5. Ikke overraskende, iMac er også blevet en metode til valg til isolering af en række indfødte bioenergetika enzymer6,7,8,9,10. En vellykket gennemførelse af disse rensningsmetoder for undersøgelser af enzymatisk aktive bioenergiske proteiner afhænger imidlertid af tilstedeværelsen af ubetydelige niveauer af metalkationer, der er udvasket fra kolonne matricen til eluatet. De Divalente metalkationer, der almindeligvis anvendes i iMac, har kendt patologisk biologisk signifikans, selv ved lave koncentrationer på11,12. Den fysiologiske virkning af disse metaller er mest udtalt i bioenergiske systemer, hvor de kan vise sig dødelige som hæmmere af cellulære respiration eller fotosyntese13,14,15. Lignende problemer er uundgåelige for de fleste protein klasser, hvor rester af kontaminerende metaller kan forstyrre et proteinets biologiske funktioner eller karakterisering med biokemiske og biofysiske teknikker.
Mens niveauerne af metalkontaminering under oxiderende betingelser og ved hjælp af imidazol som et eluant typisk er lave16, protein isoleringer udført i nærværelse af cystein reducerende agenter (DTT, β-mercaptoethanol, etc.) eller med stærkere chelatorer som histidin17,18 eller Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) resultere i meget højere niveauer af metalforurening19,20. Da metalioner i IMAC-harpiks ofte koordineres af carboxylgrupper, er det også sandsynligt, at proteinelutioner, der udføres under sure forhold, har meget højere niveauer af metalkontaminering. Metal indhold i opløsninger kan vurderes ved hjælp af atomabsorptionsspektroskopi (AAS) og indutivt koblet plasma-massespektrometri (ICP-MS) ned til en detektionsgrænse i PPB-PPT-området21,22,23,24. Desværre er AAS og ICP-MS ikke realistiske midler til påvisning i et traditionelt biokemi laboratorium, da disse metoder ville kræve adgang til specialiseret udstyr og uddannelse.
Tidligere arbejde af Brittain25,26 undersøgt brugen af hydroxynaphthol blå (HNB) som en måde at identificere tilstedeværelsen af overgangsmetaller i opløsning. Der var imidlertid flere interne modsætninger i data20 , og disse værker undlod at tilbyde en passende protokol. Studier af Temel et al.27 og Ferreira et al.28 udvidede på BRITTAIN arbejde med HNB som en potentiel metal indikator. Temel udarbejdede imidlertid en protokol, der gør brug af AAS til analyse af prøver, og som kun anvender HNB som Chelat agent. Ferreiras undersøgelse anvendte ændringen i HNB absorbans Spectra ved 563 nm, en region af Free-Dye HNB Spectra, der overlapper kraftigt med Spectra af HNB-metal komplekser ved pH 5,7, hvilket gør analysen følsomhed forholdsvis lav samt resulterer i relativt svage metal binding affinitet20. For at løse problemer i vores eget laboratorium med ni2 + udvaskning fra iMac har vi udvidet det arbejde, som Brittain25,26 og ferreria28 har udført for at udvikle en nem analyse, som kan detektere nanomolære niveauer af flere overgangsmetaller. Vi viste, at HNB binder nikkel og andre fælles for IMAC metaller med sub-nanomolar binding tilhørsforhold og form 1:1 kompleks over en bred vifte af pH-værdier20. Analysen rapporteres her er baseret på disse fund og udnytter absorbans ændringer i HNB spektrum ved 647 nm for metal kvantificering. Analysen kan udføres i det fysiologiske pH-område ved hjælp af fælles buffere og instrumentering fundet i en typisk biokemi Lab ved hjælp af kolorimetrisk detektion og kvantificering af metal-farvestoffer komplekser og den dermed forbundne ændring i absorbans af den frie farve, når det binder sig til metal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9743-500</td>
			<td>media for E.coli growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, free acid</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxynaphthol blue disoidum salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>219916-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>IB0277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, free acid</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB0360</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>T870-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of metal leaching in immobilized metal affinity chromatography

Kontaminering af enzymer med metaller udvasket fra immobiliseret metalaffinitets kromatografi (IMAC) søjler giver anledning til stor bekymring for enzymologer, da mange af de fælles di-og trivalente kationer, der anvendes i IMAC-harpiks, har en hæmmende virkning på enzymer. Omfanget af udvaskning af metal og virkningen af forskellige eluering-og reduktions reagenser er imidlertid dårligt forstået i vid udstrækning på grund af fraværet af enkle og praktiske overgangs protokoller til bestemmelse af metallet, der anvender udstyr, som typisk er tilgængeligt i biokemiske laboratorier. For at løse dette problem har vi udviklet en protokol til hurtigt at kvantificere mængden af metalforurening i prøver tilberedt med IMAC som et rensningstrin. Metoden bruger hydroxynaphthol Blue (HNB) som en kolorimetrisk indikator for metal kation indhold i en prøveopløsning og UV-Vis spektroskopi som et middel til at kvantificere mængden af metal til stede, i nanomolær området, baseret på ændringen i HNB spektrum ved 647 nm. Mens metalindhold i en opløsning historisk set er blevet bestemt ved hjælp af atomabsorptionsspektroskopi eller industivt koblede plasma teknikker, kræver disse metoder specialiseret udstyr og træning uden for rammerne af et typisk biokemisk laboratorium. Den metode, der foreslås her, giver en enkel og hurtig måde for biokemikere at bestemme metalindholdet af prøver ved hjælp af eksisterende udstyr og viden uden at ofre nøjagtighed.

Spektret af fri HNB ved neutral pH (Black Line) og repræsentative spektre af fraktioner, der er analyseret for ni2 + fra ISOLATIONEN af MSP1E3D129 , er vist i figur 2. En vellykket analyseserie bør påvise en nedsat absorbans ved 647 nm sammenlignet med HNB-kontrol, hvilket svarer til dannelsen af HNB-komplekser i nærværelse af et Overgangsmetal. En mislykket analyse ville blive indikeret ved en stigning i absorbans ved 647 nm. Alternativt, mere end 90%...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography at JoVE.com

Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography

Vi præsenterer en analyse for nem kvantificering af metaller introduceret til prøver tilberedt ved hjælp af immobiliseret metalaffinitets kromatografi. Metoden bruger hydroxynaphthol blå som den kolorimetriske metal indikator og et UV-Vis Spektrofotometer som detektoren.

Kvantificering af metal udvaskning i immobiliseret Metalaffinitets kromatografi

Contamination of enzymes with metals leached from immobilized metal affinity chromatography (IMAC) columns poses a major concern for enzymologists, as ...

Vores metode er betydelig, da det gør det muligt for den gennemsnitlige biokemiker til hurtigt at afgøre, om prøver isoleret ved hjælp af immobiliseret metal affinitet kromatografi er forurenet med overgang metaller. Den største fordel er den lethed, hvormed analysen kan udføres. Analysen bruger instrumentering og teknikker fælles for de fleste biokemi labs, og det kan nemt og hurtigt gennemføres.Mens der i denne artikel anvender vi denne metode til prøver isoleret med en nikkel-NTA kolonne, kan metoden bruges med enhver anden metal affinitet harpiks. Første gang brugere bør prøve denne metode med en nikkel lager opløsning af kendt koncentration. Dette vil gøre dem fortrolige med arbejdsprocessen, eksempelfarver og harpikser, der vises i spektrale ændringer.At demonstrere proceduren vil være Cole Swain, en tekniker fra mit laboratorium. Til at begynde, tænde og varme op UV-Vis spektrofotometer. De kromatografifraktioner, der skal analyseres, bestemmes ved hjælp af et diodearray UV-Vis-spektrofotometer med optisk absorbans ved 280 nanometer for at kvantificere proteinet.Ansk af 10 til 100 millimolarprøvebuffer med en PH mellem 7 og 12, f.eks. Der fremstilles en opløsning på 12 % volumen af HNB-dispersion i prøvebufferen ved hjælp af 120 mg HNB-reagens for hver ml lageropløsning, der er fremstillet. Indstil spektrofotometeret til at indsamle data til 647 nanometer.Brug en kvartsknudjævning fyldt med prøvebufferen til at tømme spektrofotometeret. Der klargøres en kontrolopløsning i en kuvette, der indeholder 50 mikroliter HNB-lak pr. milliliter samlet analysevolumen. Lad styringen inkubere i mindst tre minutter ved stuetemperatur.Absorbansen måles og registreres ved 647 nanometer for kontrolprøven. Analyseprøverne klargøres ved at blande 150 mikroliter HNB-lager med 2850 mikroliter af passende fortyndede proteinfraktioner med prøvebufferen. Lad prøven inkuberes i mindst tre minutter ved stuetemperatur.Gentag spektret optagelse for hver fraktion, der skal måles. I tilfælde, hvor der opnås utilstrækkelig fortynding, er hele spektralbåndet ved 647 nanometer væk. Mens prøven med for stærk fortynding kan skelnes fra kontrolelementet.For at bestemme koncentrationen af metal i hver prøve skal der først findes forskellen mellem hver prøveabsorbance ved 647 nanometer fra HNB-kontrollen. Metalkoncentrationen i mikromolar bestemmes ved hjælp af formlen, hvor DF er fortyndingsfaktoren for analysefraktionen, delta A-B-S 647 er absorbansændringen ved 647 nanometer, 3,65 gange 10 til den negative 2 repræsenterer HNB's udryddelseskoefficient, og l er cuvettes optiske vej i centimeter. I denne undersøgelse vises spektret af frit HNB ved neutral PH i repræsentativ spektre af fraktioner, der er analyseret for nikkelion fra isoleringen af MSP1E3D1, her.Der blev observeret en nedsat absorbans ved 647 nanometer sammenlignet med HNB-kontrollen, hvilket svarede til dannelsen af HNB-komplekser i overværelse af et overgangsmetal. For at demonstrere anvendelsen af denne analyse, to hans-mærkede membran stillads proteiner, MSP1E3D1, MSP2N2, og en roman, tre-heme, c-type cytokrom GSU0105, fra geobacter svovlreducens, blev analyseret. Protein- og nikkelionindholdet i hver fraktion for GSU0105 blev ændret betydeligt fra hinanden, mens fraktionerne for MSP1E3D1 og MSP2N2, der indeholdt mest protein, også havde det højeste nikkelindhold.Det er også illustreret, at metalindholdet ikke kan fordeles jævnt mellem fraktioner, der er indsamlet ved hjælp af en mobiliseret metalaffæritetskromatografi. Det er vigtigst at blande det tomme felt i alle prøver og give mulighed for lige inkubationstid for det tomme i alle prøver. Proteinfraktioner af særlig interesse kan analyseres yderligere med atomabsorptionsspektrometri eller ICPMS for at bekræfte metalforurening og for at teste for chelaterede eller stærkt bundne proteinmetalioner.Ud over overgangs metaludvaskning kan denne teknik bruges til at måle bindende tilhørsforhold i overgangsmetalioner til proteiner. HNB og eventuel nikkel i prøver er irriterende for henholdsvis øjne og hud. Standard PV, herunder handsker og øjenbeskyttelse, bør anvendes under metoden.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Periodic Properties of the Elements

SCIENTISTS IN ACTION

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

Anticancer metalkomplekser: Syntese og cytotoksicitet Evaluering af MTT Assay

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Syntese og karakterisering af funktionaliserede Metal-organisk Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radioaktiv mærkning og kvantificering af cellulære niveauer af phosphoinositider af højtryksvæskekromatografi-koblede Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Synthesis of a Water-soluble Metal&#8211;Organic Complex Array

Synthesis of a Water-soluble MetalÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œOrganic Complex Array

Syntese af en Vandopløseligt Metal-Organic Complex Array

We demonstrate a method for the synthesis of a water-soluble multimetallic peptidic array containing a predetermined sequence of metal centers such as ...

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Påvisning og enkelt celle kvantificering af Metal metaloxid bruger nukleare Microprobe analyse

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

Ligand-medieret Nukleering og vækst af Palladium Metal nanopartikler

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Surface Functionalization of Metal-Organic Frameworks for Improved Moisture Resistance

Overflade Functionalization af Metal-økologiske rammer for forbedret fugt modstand

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. ...

Electrophoretic Crystallization of Ultrathin High-performance Metal-organic Framework Membranes

Elektroforetisk krystallisering af ultratynde højtydende Metal-økologiske rammer membraner

We report the synthesis of thin, highly intergrown, polycrystalline metal-organic framework (MOF) membranes on a wide range of unmodified porous and ...

Molten-Salt Synthesis of Complex Metal Oxide Nanoparticles

Smeltet Salt syntese af komplekse metaloxid nanopartikler

The development of feasible synthesis methods is critical for the successful exploration of novel properties and potential applications of nanomaterials. ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Ion Mobility-massespektrometri teknikker til bestemmelse af strukturen og mekanismerne for metal Iongenkendelse og Redoxaktivitet af metal bindende oligopeptider