Name: quantification of metal leaching in immobilized metal affinity chromatography
Uploaded: 2020-01-17T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography at JoVE.com

Dit materiaal is gebaseerd op het werk ondersteund door de National Science Foundation onder Grant MCB-1817448 en door een Award van de Thomas F. en Kate Miller Jeffress Memorial Trust, Bank of America, trustee en de gespecificeerde donor Hazel Thorpe Carman en George Gay Carman Vertrouwen.

1. preparaat van de test component
<ol><li>Bepaal de chromatografie fracties die moeten worden getest met optische extinctie bij 280 nm of alternatieve methoden voor eiwit kwantificering om de eiwit verrijkte fracties te identificeren. Opmerking: voor dit werk gebruikten we een diode array UV-VIS spectrofotometer. Om de doorvoer te verhogen, kan een plaat lezer worden gebruikt die geschikt is voor het meten van de UV/VIS-extinctie.</li>
	<li>Bereiding van de noodzakelijke assay componenten<ol>
<li>Bereid of verkrijg...

<ol>
	<li>Porath, J., Carlsson, J. A. N., Olsson, I., Belfrage, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).</li><li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized-Metal+Affinity+Chromatography+(IMAC):+A+Review.">Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review.</a> Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).</li><li>Takeda, N., Matsuoka, T., Gotoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiality+of+IMAC+as+sample+pretreatment+tool+in+food+analysis+for+veterinary+drugs.">Potentiality of IMAC as sample pretreatment tool in food analysis for veterinary drugs.</a> Chromatographia. 72 (1/2), 127-131 (2010).</li><li>Felix, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+serum+proteins+involved+in+pancreatic+cancer+cachexia.">Identification of serum proteins involved in pancreatic cancer cachexia.</a> Life sciences. 88 (5-6), 218-225 (2011).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+enhanced+laser+desorption/ionization+profiling:+New+diagnostic+method+of+HBV-related+hepatocellular+carcinoma.">Surface enhanced laser desorption/ionization profiling: New diagnostic method of HBV-related hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (1), 55-62 (2009).</li><li>Goldsmith, J. O., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+bacterial+photosynthetic+reaction+centers+with+an+engineered+poly-histidine+tag.">Rapid isolation of bacterial photosynthetic reaction centers with an engineered poly-histidine tag.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1276 (3), 171-175 (1996).</li><li>Guergova-Kuras, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+one-step+purification+of+a+fully+active+polyhistidine-tagged+cytochrome+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides.">Expression and one-step purification of a fully active polyhistidine-tagged cytochrome bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides.</a> Protein Expression and Purification. 15 (3), 370-380 (1999).</li><li>Mitchell, D. M., Gennis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+wildtype+and+mutant+cytochrome+c+oxidase+from+Rhodobacter+sphaeroides+by+Ni(2+)-NTA+affinity+chromatography.">Rapid purification of wildtype and mutant cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides by Ni(2+)-NTA affinity chromatography.</a> FEBS Letters. 368 (1), 148-150 (1995).</li><li>Tian, H., White, S., Yu, L., Yu, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+head+domain+movement+of+the+rieske+iron-sulfur+protein+in+electron+transfer+reaction+of+the+cytochrome+bc1+complex.">Evidence for the head domain movement of the rieske iron-sulfur protein in electron transfer reaction of the cytochrome bc1 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (11), 7146-7152 (1999).</li><li>Tian, H., Yu, L., Mather, M. W., Yu, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexibility+of+the+neck+region+of+the+rieske+iron-sulfur+protein+is+functionally+important+in+the+cytochrome+bc1+complex.">Flexibility of the neck region of the rieske iron-sulfur protein is functionally important in the cytochrome bc1 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (43), 27953-27959 (1998).</li><li>Louie, A. Y., Meade, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+complexes+as+enzyme+inhibitors.">Metal complexes as enzyme inhibitors.</a> Chemical Reviews. 99 (9), 2711-2734 (1999).</li><li>Tam&#225;s, M. J., Sharma, S. K., Ibstedt, S., Jacobson, T., Christen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heavy+Metals+and+Metalloids+As+a+Cause+for+Protein+Misfolding+and+Aggregation.">Heavy Metals and Metalloids As a Cause for Protein Misfolding and Aggregation.</a> Biomolecules. 4 (1), 252-267 (2014).</li><li>Gerencser, L., Maroti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retardation+of+proton+transfer+caused+by+binding+of+the+transition+metal+ion+to+the+bacterial+reaction+center+is+due+to+pKa+shifts+of+key+protonatable+residues.">Retardation of proton transfer caused by binding of the transition metal ion to the bacterial reaction center is due to pKa shifts of key protonatable residues.</a> Biochemistry. 40 (6), 1850-1860 (2001).</li><li>Klishin, S. S., Junge, W., Mulkidjanian, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash-induced+turnover+of+the+cytochrome+bc1+complex+in+chromatophores+of+Rhodobacter+capsulatus:+binding+of+Zn2++decelerates+likewise+the+oxidation+of+cytochrome+b,+the+reduction+of+cytochrome+c1+and+the+voltage+generation.">Flash-induced turnover of the cytochrome bc1 complex in chromatophores of Rhodobacter capsulatus: binding of Zn2+ decelerates likewise the oxidation of cytochrome b, the reduction of cytochrome c1 and the voltage generation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1553 (3), 177-182 (2002).</li><li>Link, T. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+ions+inhibit+the+QP+center+of+bovine+heart+mitochondrial+bc1+complex+by+blocking+a+protonatable+group.">Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bc1 complex by blocking a protonatable group.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (42), 25001-25006 (1995).</li><li>Block, H., Kubicek, J., Labahn, J., Roth, U., Sch&#228;fer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+comprehensive+quality+control+of+recombinant+human+Interleukin-1beta:+a+case+study+for+a+process+development+strategy.">Production and comprehensive quality control of recombinant human Interleukin-1beta: a case study for a process development strategy.</a> Protein Expression and Purification. 57 (2), 244-254 (2008).</li><li>Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+imidazole+to+the+heme+of+cytochrome+c1+and+inhibition+of+the+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides:+II.+Kinetics+and+mechanism+of+binding.">Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: II. Kinetics and mechanism of binding.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22522-22531 (2010).</li><li>Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+imidazole+to+the+heme+of+cytochrome+c1+and+inhibition+of+the+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides:+I.+Equilibrium+and+modeling+studies.">Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: I. Equilibrium and modeling studies.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22513-22521 (2010).</li><li>Bornhorst, J. A., Falke, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins+using+polyhistidine+affinity+tags.">Purification of proteins using polyhistidine affinity tags.</a> Methods in Enzymology. 326, 245-254 (2000).</li><li>Kokhan, O., Marzolf, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+transition+metal+leaching+in+metal+affinity+chromatography+with+hydroxynaphthol+blue.">Detection and quantification of transition metal leaching in metal affinity chromatography with hydroxynaphthol blue.</a> Analytical Biochemistry. 582, 113347 (2019).</li><li>Doyle, C., Naser, D., Bauman, H., Rumfeldt, J., Meiering, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+method+for+simultaneous+measurement+of+zinc+and+copper+in+metalloproteins+using+4-(2-pyridylazo)resorcinol.">Spectrophotometric method for simultaneous measurement of zinc and copper in metalloproteins using 4-(2-pyridylazo)resorcinol.</a> Analytical Biochemistry. 579, 44-56 (2019).</li><li>Furrer, J., Smith, G. S., Therrien, B., Gasser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inorganic Chemical Biology. , (2014).</li><li>Hogeling, S. M., Cox, M. T., Bradshaw, R. M., Smith, D. P., Duckett, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+proteins+in+whole+blood,+plasma+and+DBS,+with+element-labelled+antibody+detection+by+ICP-MS.">Quantification of proteins in whole blood, plasma and DBS, with element-labelled antibody detection by ICP-MS.</a> Analytical Biochemistry. 575, 10-16 (2019).</li><li>Yamasaki, S., Tsumura, A., Takaku, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultratrace+Elements+in+Terrestrial+Water+as+Determined+by+High-Resolution+ICP-MS.">Ultratrace Elements in Terrestrial Water as Determined by High-Resolution ICP-MS.</a> Microchemical Journal. 49 (2), 305-318 (1994).</li><li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+Formation+Between+Hydroxy+Naphthol+Blue+and+First+Row+Transition+Metal+Cyanide+Complexes.">Complex Formation Between Hydroxy Naphthol Blue and First Row Transition Metal Cyanide Complexes.</a> Analytical Letters. 10 (13), 1105-1113 (1977).</li><li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Transition+Metal+Ions+by+the+Calcium+Indicator+Hydroxy+Naphthol+Blue.">Binding of Transition Metal Ions by the Calcium Indicator Hydroxy Naphthol Blue.</a> Analytical Letters. 11 (4), 355-362 (1978).</li><li>Temel, N. K., Sertakan, K., G&#252;rkan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preconcentration+and+Determination+of+Trace+Nickel+and+Cobalt+in+Milk-Based+Samples+by+Ultrasound-Assisted+Cloud+Point+Extraction+Coupled+with+Flame+Atomic+Absorption+Spectrometry.">Preconcentration and Determination of Trace Nickel and Cobalt in Milk-Based Samples by Ultrasound-Assisted Cloud Point Extraction Coupled with Flame Atomic Absorption Spectrometry.</a> Biological Trace Element Research. 186 (2), 597-607 (2018).</li><li>Ferreira, S. L. C., Santos, B. F., de Andrade, J. B., Costa, A. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+derivative+spectrophotometric+determination+of+nickel+with+hydroxynaphthol+blue.">Spectrophotometric and derivative spectrophotometric determination of nickel with hydroxynaphthol blue.</a> Microchimica Acta. 122 (1), 109-115 (1996).</li><li>Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Self-Assembly+of+Monodisperse+Phospholipid+Bilayer+Nanodiscs+with+Controlled+Size.">Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (11), 3477-3487 (2004).</li><li>Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+extended+membrane+scaffold+proteins+for+self-assembly+of+soluble+nanoscale+lipid+bilayers.">Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 23 (11), 843-848 (2010).</li><li>Bonta, M., Hegedus, B., Limbeck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+dried-droplets+deposited+on+pre-cut+filter+paper+disks+for+quantitative+LA-ICP-MS+imaging+of+biologically+relevant+minor+and+trace+elements+in+tissue+samples.">Application of dried-droplets deposited on pre-cut filter paper disks for quantitative LA-ICP-MS imaging of biologically relevant minor and trace elements in tissue samples.</a> Analytica Chimica Acta. 908, 54-62 (2016).</li><li>Olmedo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+method+to+quantify+chromium,+cadmium,+manganese,+nickel+and+lead+in+human+whole+blood,+urine,+saliva+and+hair+samples+by+electrothermal+atomic+absorption+spectrometry.">Validation of a method to quantify chromium, cadmium, manganese, nickel and lead in human whole blood, urine, saliva and hair samples by electrothermal atomic absorption spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 659 (1), 60-67 (2010).</li><li>Shyamal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Selective+Turn-On+Fluorogenic+Chemosensor+for+Robust+Quantification+of+Zn(II)+Based+on+Aggregation+Induced+Emission+Enhancement+Feature.">Highly Selective Turn-On Fluorogenic Chemosensor for Robust Quantification of Zn(II) Based on Aggregation Induced Emission Enhancement Feature.</a> ACS Sensors. 1 (6), 739-747 (2016).</li><li>Kudo, H., Yamada, K., Watanabe, D., Suzuki, K., Citterio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-Based+Analytical+Device+for+Zinc+Ion+Quantification+in+Water+Samples+with+Power-Free+Analyte+Concentration.">Paper-Based Analytical Device for Zinc Ion Quantification in Water Samples with Power-Free Analyte Concentration.</a> Micromachines. 8 (4), 127 (2017).</li><li>Liu, R., Zhang, P., Li, H., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-cloth+integrated+with+gravity/capillary+flow+chemiluminescence+(GCF-CL):+towards+simple,+inexpensive,+portable,+flow+system+for+measuring+trivalent+chromium+in+water.">Lab-on-cloth integrated with gravity/capillary flow chemiluminescence (GCF-CL): towards simple, inexpensive, portable, flow system for measuring trivalent chromium in water.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 236 (C), 35-43 (2016).</li></ol>

Colorimetrische detectie van metalen met behulp van HNB biedt een eenvoudige manier om de mate van eiwit verontreiniging te kwantificeren door overgangsmetalen ionen van IMAC-harsen. Zoals we gevestigd in Ref. 20, ni2 + bindt aan hnb met 1:1 Stoichiometrie en de dissociatieconstante voor de ni-hnb complex veranderingen met pH. Het complex Kd bevindt zich echter in het Sub-nm-bereik voor alle aanbevolen (7-12) pH-waarden. Praktisch gezien betekent dit dat alle ni2 + in alle geteste fractie...

Sinds de oprichting door Porath en co-workers1, geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie (iMac) is uitgegroeid tot een methode van keuze om snel te scheiden van eiwitten op basis van hun vermogen om te binden met overgangsmetalen ionen zoals Zn2 +, ni2 +, Cu2 +, en co2 +. Dit wordt meestal gedaan via engineered poly-histidine Tags en is nu een van de meest voorkomende chromatografische zuivering technieken voor de isolatie van recombinant eiwitten2. IMac heeft ook toepassingen gevonden die verder gaan dan recombinant-eiwit zuivering als een manier om quinolonen, tetracyclines, aminoglycosiden, macroliden en β-lactams voor voedsel monsteranalyse3 te isoleren en als een stap in het identificeren van bloed-serumeiwit markers voor lever-en pancreaskanker4,5. Niet verrassend, iMac is ook uitgegroeid tot een methode van keuze voor de isolatie van een aantal inheemse Bioenergetics enzymen6,7,8,9,10. De succesvolle toepassing van deze zuiverings methoden voor studies op enzymatisch actieve bioenergetische eiwitten is echter afhankelijk van de aanwezigheid van verwaarloosbare metaal kationen uit de kolom matrix in het eluaat. De divalente metaal kationen die gewoonlijk in iMac worden gebruikt, hebben een pathologisch biologisch belang, zelfs bij lage concentraties11,12. Het fysiologische effect van deze metalen is het meest uitgesproken in bioenergetische systemen, waar ze dodelijk kunnen blijken als remmers van cellulaire ademhaling of fotosynthese13,14,15. Vergelijkbare problemen zijn onvermijdelijk voor de meerderheid van de eiwit klassen waar rest verontreiniging metalen kunnen interfereren met de biologische functies van een eiwit of karakterisering met biochemische en biofysische technieken.
Terwijl het gehalte aan metaalverontreiniging onder oxiderende omstandigheden en het gebruik van imidazol als eluant doorgaans laag is16, eiwit isolaties uitgevoerd in de aanwezigheid van cysteïne reducerende agentia (DTT, β-mercaptoethanol, enz.) of met sterkere chelatoren zoals histidine17,18 of ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) resulteren in veel hogere niveaus van metaalverontreiniging19,20. Evenzo, aangezien metaalionen in IMAC-harsen vaak worden gecoördineerd door Carbon groepen, hebben eiwit eluties die onder zure omstandigheden worden uitgevoerd waarschijnlijk ook veel hogere niveaus van metaalverontreiniging. Metaalgehalte in oplossingen kan worden beoordeeld met behulp van atomische Absorptie spectroscopie (aas) en inductief gekoppeld plasma-massaspectrometrie (ICP-MS) tot een aantoonbaarheidsgrens in het ppb-ppt-bereik21,22,23,24. Helaas, AAS en ICP-MS zijn niet realistisch middelen voor detectie in een traditionele biochemie Lab omdat deze methoden toegang tot gespecialiseerde apparatuur en training zou vereisen.
Vorig werk van Brittain25,26 onderzocht het gebruik van hydroxynaphthol Blue (hnb) als een manier om de aanwezigheid van overgangsmetalen in oplossing te identificeren. Er waren echter verschillende interne contradicties in de data20 en die werken hebben geen adequaat protocol kunnen bieden. Studies van Temel et al.27 en Ferreira et al.28 verbreiden het werk van Brittain met hnb als een potentiële metalen indicator. Echter, Temel ontwikkelde een protocol dat gebruik maakt van AAS voor monsteranalyse, met behulp van HNB alleen als een chelerende agent. De studie van Ferreira gebruikte de verandering in het HNB extinctie Spectra bij 563 nm, een gebied van de Free-Dye HNB spectra die zwaar overlapt met de spectra van HNB-Metal complexen bij pH 5,7, waardoor de gevoeligheid van de assay vrij laag is en ook resulteert in relatief zwakke metaalbinding affiniteit20. Om problemen in ons eigen lab met ni2 + uitspoeling van iMac aan te pakken, hebben we het werk van Brittain25,26 en Ferreria28 uitgebreid om een eenvoudige assay te ontwikkelen die in staat is om nanomolaire niveaus van verschillende overgangsmetalen te detecteren. We toonden aan dat HNB nikkel bindt en andere vaak voor IMAC-metalen met sub-nanomolaire bindende affiniteiten en Form 1:1 complex over een breed scala aan pH-waarden20. De hier gerapporteerde assay is gebaseerd op deze bevindingen en maakt gebruik van absorptie veranderingen in het HNB-spectrum bij 647 nm voor metaal kwantificering. De test kan worden uitgevoerd in de fysiologische pH-reeks met behulp van gemeenschappelijke buffers en instrumentatie gevonden in een typische biochemie Lab met behulp van colorimetrische detectie en kwantificering van metaal-Dye complexen en de bijbehorende verandering in de extinctie van de vrije-kleurstof wanneer het bindt aan metaal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9743-500</td>
			<td>media for E.coli growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, free acid</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxynaphthol blue disoidum salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>219916-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>IB0277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, free acid</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB0360</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>T870-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of metal leaching in immobilized metal affinity chromatography

Besmetting van enzymen met metalen uit geïmmobiliseerde metalen affiniteits chromatografie (IMAC) kolommen vormt een belangrijke zorg voor enzymologen, omdat veel van de gemeenschappelijke di-en trivalente kationen die worden gebruikt in IMAC-harsen een remmende werking op enzymen hebben. De omvang van het uitlogen van metaal en de impact van verschillende eluering-en reducerende reagentia zijn echter slecht begrepen voor een groot deel vanwege de afwezigheid van eenvoudige en praktische overgangs metaalkwantificerings protocollen die gebruikmaken van apparatuur die gewoonlijk beschikbaar is in Biochemie Labs. Om dit probleem aan te pakken, hebben we een protocol ontwikkeld om snel de hoeveelheid metaalverontreiniging te kwantificeren in monsters die worden bereid met behulp van IMAC als zuiveringsstap. De methode maakt gebruik van hydroxynaphthol Blue (HNB) als een colorimetrische indicator voor metaal CATIE-inhoud in een monsteroplossing en UV-VIS-spectroscopie als middel om de hoeveelheid metaal aanwezig te kwantificeren, in het nanomolair-bereik, gebaseerd op de verandering in het HNB-spectrum bij 647 nm. Hoewel het metaalgehalte in een oplossing historisch is bepaald met behulp van atomische Absorptie spectroscopie of inductief gekoppelde plasma technieken, vereisen deze methoden gespecialiseerde apparatuur en training buiten het bereik van een typisch biochemie laboratorium. De hier voorgestelde methode biedt een eenvoudige en snelle manier voor biochemici om het metaalgehalte van monsters te bepalen met behulp van bestaande apparatuur en kennis, zonder in te boeten op nauwkeurigheid.

Het spectrum van vrije HNB bij neutrale pH (zwarte lijn) en representatieve spectra van fracties die zijn aangevallen voor ni2 + uit de isolatie van MSP1E3D129 zijn weergegeven in Figuur 2. Een succesvolle assay-serie moet een verminderde extinctie vertonen bij 647 nm in vergelijking met de HNB-controle, die overeenkomt met de vorming van HNB-complexen in de aanwezigheid van een overgangsmetaal. Een mislukte test zou worden aangegeven door een toename van d...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography at JoVE.com

Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography

We presenteren een assay voor eenvoudige kwantificering van metalen geïntroduceerd voor monsters bereid met behulp van geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie. De methode maakt gebruik van hydroxynaphthol blauw als de colorimetrische metalen indicator en een UV-VIS-spectrofotometer als de detector.

Kwantificering van metaal uitspoeling in geïmmobiliseerde metaal Affiniteits chromatografie

Contamination of enzymes with metals leached from immobilized metal affinity chromatography (IMAC) columns poses a major concern for enzymologists, as ...

Onze methode is significant, omdat het de gemiddelde biochemicus in staat stelt om snel te bepalen of monsters geïsoleerd met behulp van geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie zijn besmet met overgang metalen. Het belangrijkste voordeel is het gemak waarmee de test kan worden uitgevoerd. De test maakt gebruik van instrumentatie en technieken gemeenschappelijk voor de meeste biochemie laboratoria, en het kan gemakkelijk en snel worden geïmplementeerd.Terwijl in dit artikel passen we deze methode toe voor monsters geïsoleerd met een nikkel-NTA kolom, kan de methode worden gebruikt met een andere metaal affiniteit hars. Eerste keer gebruikers moeten proberen deze methode met een nikkel voorraad oplossing van bekende concentratie. Hiermee worden ze vertrouwd gemaakt met de werkstroom, voorbeeldkleuren en harsen die in spectrale wijzigingen worden weergegeven.Het aantonen van de procedure zal Cole Swain zijn, een technicus van mijn laboratorium. Om te beginnen schakelt u de UV-Vis spectrofotometer in en warm u deze op. Bepaal de chromatografiefracties die moeten worden getest met behulp van een diodearray UV-Vis spectrofotometer met optische absorptie op 280 nanometer om het eiwit te kwantificeren.Verkrijg een monsterbuffer van 10 tot 100 millimolar met een PH tussen 7 en 12, zoals Tris, HEPES, MOPS en fosfaatbuffer. Bereid een volumeoplossing van 12% van de HNB-dispersie in de monsterbuffer voor met behulp van 120 milligram HNB-reagens voor elke bereide milliliter voorraadoplossing. Stel de spectrofotometer in om gegevens te verzamelen op 647 nanometer.Gebruik een kwarts cuvette gevuld met de monsterbuffer om de spectrofotometer leeg te maken. Bereid een controleoplossing voor in een cuvette met 50 microliter HNB-voorraad per milliliter van het totale testvolume. Laat de bediening minimaal drie minuten bij kamertemperatuur uitbroeden.Meet en noteer de absorptie op 647 nanometer voor het controlemonster. Bereid de testmonsters voor door 150 microliter HNB-bouillon te mengen met 2850 microliter van op de juiste manier verdunde eiwitfracties met de monsterbuffer. Laat het monster minimaal drie minuten incuberen bij kamertemperatuur.Herhaal de spectrumopname voor elke te meten fractie. In het geval dat onvoldoende verdunning wordt verkregen, is de gehele spectrale band op 647 nanometer verdwenen. Terwijl met een te sterke verdunning, het monster is niet te onderscheiden van de controle.Om de concentratie van metaal in elk monster te bepalen, vindt u eerst het verschil van elke monsterabsorptie op 647 nanometer van de HNB-regeling. Bepaal de metaalconcentratie in micromolar met behulp van de formule waarbij DF de verdunningsfactor is voor de testfractie, delta A-B-S 647 is de absorptieverandering op 647 nanometer, 3,65 keer 10 tot negatief 2 de extinctiecoëfficiënt van HNB en ik is het optische pad van Cuvette in centimeters. In deze studie wordt hier het spectrum van vrije HNB bij neutrale PH in representatieve spectra van fracties getoond die voor nikkelion uit de isolatie van MSP1E3D1 worden gessayd.Een verminderde absorptie op 647 nanometer ten opzichte van de HNB-controle werd waargenomen, wat overeenkwam met de vorming van HNB-complexen in aanwezigheid van een overgangsmetaal. Om de toepassing van deze test aan te tonen, werden twee met zijn getagde membraansteiwitten, MSP1E3D1, MSP2N2 en een roman, drie-heme, c-type cytochrome GSU0105, uit geobacterulfuren, geanalyseerd. Het eiwit- en nikkeliongehalte van elke fractie voor GSU0105 werd aanzienlijk van elkaar verschoven, terwijl de fracties voor MSP1E3D1 en MSP2N2 die het meeste eiwit bevatten ook het hoogste nikkelgehalte hadden.Het is ook geïllustreerd dat het metaalgehalte niet gelijkmatig kan worden verdeeld over fracties verzameld met behulp van een gemobiliseerde metaal affiniteit chromatografie. Het is het belangrijkste om adequaat en consequent meng de blanco in alle monsters en zorgen voor gelijke incubatietijden voor de blanco in alle monsters. Eiwitfracties van bijzonder belang kunnen verder worden geanalyseerd met atomaire absorptiespectrometrie of ICPMS om metaalverontreiniging te bevestigen en te testen op gechelated of sterk gebonden eiwitmetaalionen.Naast overgangsmetaaluitlogingsdetectie kan deze techniek worden gebruikt om bindende affiniteiten in overgangmetaalionen naar eiwitten te meten. HNB en eventuele nikkel aanwezig in monsters zijn irriterend voor de ogen en de huid respectievelijk. Tijdens de methode moet standaard beschermingsmiddelen worden gebruikt, met inbegrip van handschoenen en oogbescherming.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Periodic Properties of the Elements

SCIENTISTS IN ACTION

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

Anticancer Metal Complexen: Synthese en cytotoxiciteit Evaluatie door de MTT-test

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Synthese en karakterisering van gefunctionaliseerde metaal-organische roosters

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radioactief en kwantificering van cellulaire niveaus van fosfoinositiden door High Performance Liquid Chromatography-gekoppeld Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Synthesis of a Water-soluble Metal&#8211;Organic Complex Array

Synthesis of a Water-soluble MetalÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œOrganic Complex Array

Synthese van een water-oplosbaar metaal-organisch complex Array

We demonstrate a method for the synthesis of a water-soluble multimetallic peptidic array containing a predetermined sequence of metal centers such as ...

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Detectie en eencellige kwantificering van metaaloxide nanodeeltjes met behulp van nucleaire Microprobe analyse

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

Ligand-gemedieerde nucleatie en groei van Palladium metalen nanodeeltjes

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Surface Functionalization of Metal-Organic Frameworks for Improved Moisture Resistance

Oppervlakte Functionalization van metaal-organische kaders voor verbeterde vochtbestendigheid

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. ...

Electrophoretic Crystallization of Ultrathin High-performance Metal-organic Framework Membranes

Elektroforetische kristallisatie van ultradunne High-performance metaal-organische kader membranen

We report the synthesis of thin, highly intergrown, polycrystalline metal-organic framework (MOF) membranes on a wide range of unmodified porous and ...

Molten-Salt Synthesis of Complex Metal Oxide Nanoparticles

Gesmolten-zout synthese van complexe metaaloxide nanodeeltjes

The development of feasible synthesis methods is critical for the successful exploration of novel properties and potential applications of nanomaterials. ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Ion Mobility-massaspectrometrie technieken voor het bepalen van de structuur en de mechanismen van metaalionen herkenning en redox activiteit van metaal bindende Oligopeptides