Name: quantification of metal leaching in immobilized metal affinity chromatography
Uploaded: 2020-01-17T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography at JoVE.com

חומר זה מבוסס על העבודה הנתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע תחת גרנט MCB-1817448 ובפרס תומס פ' וקייט מילר ג ' וליד הזיכרון, בנק אוף אמריקה, הנאמן והתורם המצוין לוז ת'ורפ קרמן ו ג'ורג ' גיי Carman אמון.

1. שיטת ההכנה של רכיב
<ol><li>לקבוע את השברים הכרומטופיים באמצעות ספיגה אופטית ב-280 ננומטר או שיטות חלופיות של קוונפיקציה חלבונים כדי לזהות את החלבון שברים מועשרים. הערה: עבור עבודה זו, השתמשנו מערך דיודה UV-Vis ספקטרוסקופיה. כדי להגביר את תפוקת התפוקה, ניתן להשתמש בקורא צלחות המסוגל למדוד ספיג...

<ol>
	<li>Porath, J., Carlsson, J. A. N., Olsson, I., Belfrage, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).</li><li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized-Metal+Affinity+Chromatography+(IMAC):+A+Review.">Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review.</a> Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).</li><li>Takeda, N., Matsuoka, T., Gotoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiality+of+IMAC+as+sample+pretreatment+tool+in+food+analysis+for+veterinary+drugs.">Potentiality of IMAC as sample pretreatment tool in food analysis for veterinary drugs.</a> Chromatographia. 72 (1/2), 127-131 (2010).</li><li>Felix, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+serum+proteins+involved+in+pancreatic+cancer+cachexia.">Identification of serum proteins involved in pancreatic cancer cachexia.</a> Life sciences. 88 (5-6), 218-225 (2011).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+enhanced+laser+desorption/ionization+profiling:+New+diagnostic+method+of+HBV-related+hepatocellular+carcinoma.">Surface enhanced laser desorption/ionization profiling: New diagnostic method of HBV-related hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (1), 55-62 (2009).</li><li>Goldsmith, J. O., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+bacterial+photosynthetic+reaction+centers+with+an+engineered+poly-histidine+tag.">Rapid isolation of bacterial photosynthetic reaction centers with an engineered poly-histidine tag.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1276 (3), 171-175 (1996).</li><li>Guergova-Kuras, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+one-step+purification+of+a+fully+active+polyhistidine-tagged+cytochrome+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides.">Expression and one-step purification of a fully active polyhistidine-tagged cytochrome bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides.</a> Protein Expression and Purification. 15 (3), 370-380 (1999).</li><li>Mitchell, D. M., Gennis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+wildtype+and+mutant+cytochrome+c+oxidase+from+Rhodobacter+sphaeroides+by+Ni(2+)-NTA+affinity+chromatography.">Rapid purification of wildtype and mutant cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides by Ni(2+)-NTA affinity chromatography.</a> FEBS Letters. 368 (1), 148-150 (1995).</li><li>Tian, H., White, S., Yu, L., Yu, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+head+domain+movement+of+the+rieske+iron-sulfur+protein+in+electron+transfer+reaction+of+the+cytochrome+bc1+complex.">Evidence for the head domain movement of the rieske iron-sulfur protein in electron transfer reaction of the cytochrome bc1 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (11), 7146-7152 (1999).</li><li>Tian, H., Yu, L., Mather, M. W., Yu, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexibility+of+the+neck+region+of+the+rieske+iron-sulfur+protein+is+functionally+important+in+the+cytochrome+bc1+complex.">Flexibility of the neck region of the rieske iron-sulfur protein is functionally important in the cytochrome bc1 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (43), 27953-27959 (1998).</li><li>Louie, A. Y., Meade, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+complexes+as+enzyme+inhibitors.">Metal complexes as enzyme inhibitors.</a> Chemical Reviews. 99 (9), 2711-2734 (1999).</li><li>Tam&#225;s, M. J., Sharma, S. K., Ibstedt, S., Jacobson, T., Christen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heavy+Metals+and+Metalloids+As+a+Cause+for+Protein+Misfolding+and+Aggregation.">Heavy Metals and Metalloids As a Cause for Protein Misfolding and Aggregation.</a> Biomolecules. 4 (1), 252-267 (2014).</li><li>Gerencser, L., Maroti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retardation+of+proton+transfer+caused+by+binding+of+the+transition+metal+ion+to+the+bacterial+reaction+center+is+due+to+pKa+shifts+of+key+protonatable+residues.">Retardation of proton transfer caused by binding of the transition metal ion to the bacterial reaction center is due to pKa shifts of key protonatable residues.</a> Biochemistry. 40 (6), 1850-1860 (2001).</li><li>Klishin, S. S., Junge, W., Mulkidjanian, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash-induced+turnover+of+the+cytochrome+bc1+complex+in+chromatophores+of+Rhodobacter+capsulatus:+binding+of+Zn2++decelerates+likewise+the+oxidation+of+cytochrome+b,+the+reduction+of+cytochrome+c1+and+the+voltage+generation.">Flash-induced turnover of the cytochrome bc1 complex in chromatophores of Rhodobacter capsulatus: binding of Zn2+ decelerates likewise the oxidation of cytochrome b, the reduction of cytochrome c1 and the voltage generation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1553 (3), 177-182 (2002).</li><li>Link, T. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+ions+inhibit+the+QP+center+of+bovine+heart+mitochondrial+bc1+complex+by+blocking+a+protonatable+group.">Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bc1 complex by blocking a protonatable group.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (42), 25001-25006 (1995).</li><li>Block, H., Kubicek, J., Labahn, J., Roth, U., Sch&#228;fer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+comprehensive+quality+control+of+recombinant+human+Interleukin-1beta:+a+case+study+for+a+process+development+strategy.">Production and comprehensive quality control of recombinant human Interleukin-1beta: a case study for a process development strategy.</a> Protein Expression and Purification. 57 (2), 244-254 (2008).</li><li>Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+imidazole+to+the+heme+of+cytochrome+c1+and+inhibition+of+the+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides:+II.+Kinetics+and+mechanism+of+binding.">Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: II. Kinetics and mechanism of binding.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22522-22531 (2010).</li><li>Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+imidazole+to+the+heme+of+cytochrome+c1+and+inhibition+of+the+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides:+I.+Equilibrium+and+modeling+studies.">Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: I. Equilibrium and modeling studies.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22513-22521 (2010).</li><li>Bornhorst, J. A., Falke, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins+using+polyhistidine+affinity+tags.">Purification of proteins using polyhistidine affinity tags.</a> Methods in Enzymology. 326, 245-254 (2000).</li><li>Kokhan, O., Marzolf, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+transition+metal+leaching+in+metal+affinity+chromatography+with+hydroxynaphthol+blue.">Detection and quantification of transition metal leaching in metal affinity chromatography with hydroxynaphthol blue.</a> Analytical Biochemistry. 582, 113347 (2019).</li><li>Doyle, C., Naser, D., Bauman, H., Rumfeldt, J., Meiering, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+method+for+simultaneous+measurement+of+zinc+and+copper+in+metalloproteins+using+4-(2-pyridylazo)resorcinol.">Spectrophotometric method for simultaneous measurement of zinc and copper in metalloproteins using 4-(2-pyridylazo)resorcinol.</a> Analytical Biochemistry. 579, 44-56 (2019).</li><li>Furrer, J., Smith, G. S., Therrien, B., Gasser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inorganic Chemical Biology. , (2014).</li><li>Hogeling, S. M., Cox, M. T., Bradshaw, R. M., Smith, D. P., Duckett, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+proteins+in+whole+blood,+plasma+and+DBS,+with+element-labelled+antibody+detection+by+ICP-MS.">Quantification of proteins in whole blood, plasma and DBS, with element-labelled antibody detection by ICP-MS.</a> Analytical Biochemistry. 575, 10-16 (2019).</li><li>Yamasaki, S., Tsumura, A., Takaku, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultratrace+Elements+in+Terrestrial+Water+as+Determined+by+High-Resolution+ICP-MS.">Ultratrace Elements in Terrestrial Water as Determined by High-Resolution ICP-MS.</a> Microchemical Journal. 49 (2), 305-318 (1994).</li><li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+Formation+Between+Hydroxy+Naphthol+Blue+and+First+Row+Transition+Metal+Cyanide+Complexes.">Complex Formation Between Hydroxy Naphthol Blue and First Row Transition Metal Cyanide Complexes.</a> Analytical Letters. 10 (13), 1105-1113 (1977).</li><li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Transition+Metal+Ions+by+the+Calcium+Indicator+Hydroxy+Naphthol+Blue.">Binding of Transition Metal Ions by the Calcium Indicator Hydroxy Naphthol Blue.</a> Analytical Letters. 11 (4), 355-362 (1978).</li><li>Temel, N. K., Sertakan, K., G&#252;rkan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preconcentration+and+Determination+of+Trace+Nickel+and+Cobalt+in+Milk-Based+Samples+by+Ultrasound-Assisted+Cloud+Point+Extraction+Coupled+with+Flame+Atomic+Absorption+Spectrometry.">Preconcentration and Determination of Trace Nickel and Cobalt in Milk-Based Samples by Ultrasound-Assisted Cloud Point Extraction Coupled with Flame Atomic Absorption Spectrometry.</a> Biological Trace Element Research. 186 (2), 597-607 (2018).</li><li>Ferreira, S. L. C., Santos, B. F., de Andrade, J. B., Costa, A. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+derivative+spectrophotometric+determination+of+nickel+with+hydroxynaphthol+blue.">Spectrophotometric and derivative spectrophotometric determination of nickel with hydroxynaphthol blue.</a> Microchimica Acta. 122 (1), 109-115 (1996).</li><li>Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Self-Assembly+of+Monodisperse+Phospholipid+Bilayer+Nanodiscs+with+Controlled+Size.">Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (11), 3477-3487 (2004).</li><li>Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+extended+membrane+scaffold+proteins+for+self-assembly+of+soluble+nanoscale+lipid+bilayers.">Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 23 (11), 843-848 (2010).</li><li>Bonta, M., Hegedus, B., Limbeck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+dried-droplets+deposited+on+pre-cut+filter+paper+disks+for+quantitative+LA-ICP-MS+imaging+of+biologically+relevant+minor+and+trace+elements+in+tissue+samples.">Application of dried-droplets deposited on pre-cut filter paper disks for quantitative LA-ICP-MS imaging of biologically relevant minor and trace elements in tissue samples.</a> Analytica Chimica Acta. 908, 54-62 (2016).</li><li>Olmedo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+method+to+quantify+chromium,+cadmium,+manganese,+nickel+and+lead+in+human+whole+blood,+urine,+saliva+and+hair+samples+by+electrothermal+atomic+absorption+spectrometry.">Validation of a method to quantify chromium, cadmium, manganese, nickel and lead in human whole blood, urine, saliva and hair samples by electrothermal atomic absorption spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 659 (1), 60-67 (2010).</li><li>Shyamal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Selective+Turn-On+Fluorogenic+Chemosensor+for+Robust+Quantification+of+Zn(II)+Based+on+Aggregation+Induced+Emission+Enhancement+Feature.">Highly Selective Turn-On Fluorogenic Chemosensor for Robust Quantification of Zn(II) Based on Aggregation Induced Emission Enhancement Feature.</a> ACS Sensors. 1 (6), 739-747 (2016).</li><li>Kudo, H., Yamada, K., Watanabe, D., Suzuki, K., Citterio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-Based+Analytical+Device+for+Zinc+Ion+Quantification+in+Water+Samples+with+Power-Free+Analyte+Concentration.">Paper-Based Analytical Device for Zinc Ion Quantification in Water Samples with Power-Free Analyte Concentration.</a> Micromachines. 8 (4), 127 (2017).</li><li>Liu, R., Zhang, P., Li, H., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-cloth+integrated+with+gravity/capillary+flow+chemiluminescence+(GCF-CL):+towards+simple,+inexpensive,+portable,+flow+system+for+measuring+trivalent+chromium+in+water.">Lab-on-cloth integrated with gravity/capillary flow chemiluminescence (GCF-CL): towards simple, inexpensive, portable, flow system for measuring trivalent chromium in water.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 236 (C), 35-43 (2016).</li></ol>

גילוי מטרי הזיהוי של מתכות באמצעות HNB מספק דרך פשוטה לכמת את מידת הזיהום של חלבון על ידי מעבר יוני מתכת מ שרפים IMAC. כפי שקבענו בשופט 20, Ni2 + נקשר ל-hnb עם 1:1 סטויכמטריה וקבוע הדיסוציאציה עבור שינויים מורכבים NI-Hnb עם pH. עם זאת, ה- K המורכב נמצא בטווח ה-nM עבור כל ערכי ה-pH המומלצים (7-12). במונח...

מאז הקמתה על ידי Porath ועמיתים לעבודה1, כרומטוגרפיה של זיקה מתכת כרומטוגרפית (IMAC) הפך לשיטה של בחירה כדי להפריד במהירות חלבונים בהתבסס על יכולתם להתחבר עם יוני מתכת מעבר כגון zn2 +, Ni2 +, Cu2 +, ו-co2 +. זה נעשה בדרך כלל באמצעות הנדסה התגים פולי-histidine והוא כיום אחד שיטות הטיהור הנפוצות ביותר כרומטוגרפי לבידוד של חלבונים רקומביננטי2. IMAC יש גם מצאו יישומים מעבר לטיהור חלבון רקומביננטי כדרך לבודד quinolones, טטרציקווים, קוגליקוצידי, macrolides, ו β-lactams עבור ניתוח לדוגמה מזון3 וכצעד בזיהוי חלבון סרום דם סמנים לכבד וסרטן הלבלב4,5. לא באופן מפתיע, IMAC יש גם להיות שיטה של בחירה עבור בידוד של מספר אנזימים ביואנרגיה יליד6,7,8,9,10. עם זאת, יישום מוצלח של שיטות טיהור אלה למחקרים על חלבונים ביו-אנרגטיים פעילים ומותנים בנוכחות של רמות זניח של מתכות מתכתיות מתוך מטריצת הטור אל החומק. מתכות דיגרפיות המשמשות בדרך כלל ב-IMAC מוכרות משמעות ביולוגית פתולוגית, אפילו בריכוזים נמוכים11,12. ההשפעה הפיזיולוגית של מתכות אלה מודגשת ביותר במערכות bioenergetic, שם הם יכולים להוכיח קטלני כמו מעכבי של נשימה תאית או הפוטוסינתזה13,14,15. בעיות דומות הן בלתי נמנעת עבור רוב שיעורי החלבונים שבהם מתכות שיורית מזהם יכול להפריע לפונקציות ביולוגיות של חלבון או לאפיון עם טכניקות ביולוגיות והביופיסיים.
בעוד הרמות של זיהום מתכת תחת תנאים אוקסיגון ושימוש בסרמדול כמו הימנעות הם בדרך כלל נמוך16, חלבון בדלנים שבוצעו בנוכחות של ציסטאין מפחיתה סוכנים (dtt, β-mercaptoethanol, וכו ') או עם מכשירי כלים חזקים כמו היסטידין17,18 או ethylenediamiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii באופן דומה, מאז יוני מתכת ב שרפים IMAC מתואמים לעתים קרובות על ידי קבוצות קרבוקסילית חלבון שבוצעו בתנאים חומציים צפויים גם להיות רמות גבוהות בהרבה של זיהום מתכת. תוכן מתכת בפתרונות ניתן להעריך באמצעות ספקטרוסקופיית קליטת האטום (AAS) ומצמידים באופן משולב פלזמה המוני הספקטרומטריה (הקאמרי-MS) עד למגבלה של זיהוי ב-ppb-ppt טווח21,22,23,24. למרבה הצער, AAS ו הקאמרי-MS אינם אמצעי מציאותי לאיתור במעבדה ביוכימיה מסורתית כמו שיטות אלה ידרוש גישה לציוד והדרכה מיוחדים.
העבודה הקודמת של בריטני25,26 חקרה את השימוש בהידרוינאפיול כחול (hnb) כדרך לזיהוי נוכחות של מתכות מעבר בתמיסה. עם זאת, היו כמה סתירות פנימיות בנתונים20 ועבודות אלה לא הציעו פרוטוקול הולם. מחקרים של Temel ואח '27 ופרטי ואח '28 הורחב על עבודתה של בריטני עם hnb כמחוון מתכת פוטנציאלי. עם זאת, Temel פיתח פרוטוקול שעושה שימוש AAS עבור ניתוח לדוגמה, באמצעות HNB רק כסוכן מכלפת. המחקר של פרטי השתמשו בשינוי בספקטרום של HNB בשנת 563 nm, אזור של ספקטרום הצבע החופשי HNB החופף בכבדות עם הספקטרום של מכלולי מתכת של HNB ב-pH 5.7, מה שהופך את רגישות הגישה נמוכה למדי, וכתוצאה מכך מתכת חלשה יחסית מחייבת זיקה20. כדי לטפל בבעיות במעבדה שלנו עם Ni2 + טיפת מ-IMAC, הרחבנו את העבודה שנעשתה על ידי בריטני25,26 ו ferreria28 לפתח שיטת קל מסוגל לזהות את רמות nanomolar של מספר מתכות מעבר. הראנו כי HNB נקשר ניקל ומשותף אחרים עבור מתכות IMAC עם כריכת משנה-nanomolar איגוד וטופס 1:1 מורכבות מעל מגוון רחב של ערכי pH20. הבקשה שדווחה כאן מבוססת על ממצאים אלה ומנצלת שינויי ספיגה בספקטרום HNB ב-647 ננומטר לצורך כימות מתכת. ניתן לבצע את השינוי בטווח ה-pH הפיזיולוגי באמצעות מאגרים ומכשור משותפים, המצויים במעבדת ביוכימיה טיפוסית באמצעות איתור וככמת של מכלולי מתכות לצביעת מתכת והשינוי הקשור בספיגת הצבע החופשי כאשר הוא נקשר למתכת.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9743-500</td>
			<td>media for E.coli growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, free acid</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxynaphthol blue disoidum salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>219916-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>IB0277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, free acid</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB0360</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>T870-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of metal leaching in immobilized metal affinity chromatography

זיהום של אנזימים עם מתכות מחורץ מתוך כרומטוגרפיה של זיקה מתכת כרומטוגרפית (IMAC) מהווה דאגה מרכזית עבור אנזימוולוגים, כמו רבים של הקטניות di-ו שולש משותף המשמש שרפים IMAC יש השפעה מעכבות על אנזימים. עם זאת, את היקף המתכת מפחיתה את ההשפעה של משחררי שונים והפחתת הריאגנטים מובנים באופן גרוע בחלק הגדול בשל העדר מתכת פשוטה ומעשית פרוטוקולי קוונפיקציה השימוש בציוד זמין בדרך כלל . מעבדות ביוכימיה כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו פרוטוקול כדי לכמת במהירות את כמות זיהום המתכת בדגימות שהוכנו באמצעות IMAC כצעד טיהור. השיטה משתמשת הידרוyn, כחול (HNB) כמו מחוון מטרי צביעה עבור תוכן הקטיון מתכת בפתרון מדגם UV-Vis ספקטרוסקופיה כאמצעי לכמת את כמות הקיים של המתכת, לתוך טווח nanomolar, מבוסס על השינוי בספקטרום HNB ב 647 nm. בעוד תכולת המתכת בתמיסה הייתה מבחינה היסטורית, באמצעות ספקטרוסקופיית ספיגה אטומית או בשילוב טכניקות פלזמה, שיטות אלה דורשות ציוד מיוחד והדרכה מחוץ להיקף של מעבדת ביוכימיה טיפוסית. השיטה המוצעת כאן מספקת דרך פשוטה ומהירה לביו-כימאים כדי לקבוע את תוכן המתכת של דגימות באמצעות ציוד וידע קיימים מבלי להתפשר על דיוק.

הספקטרום של HNB חינם ב-pH ניטרלי (קו שחור) ואת הספקטרום המייצג של שברים מאסף עבור Ni2 + מן הבידוד של MSP1E3D129 מוצגים באיור 2. סדרת שינוי מוצלחת צריכה להפגין ספיגה מצומצמת ב 647 ננומטר בהשוואה לבקרת HNB, המתאימה להיווצרות מתחמי HNB בנוכחות מתכת מעבר. שיטת הפעולה הכושל ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography at JoVE.com

Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography

אנו מציגים שיטת כימות קלה של מתכות הציגו דגימות שהוכנו באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה מתכת ללא קיבוע. השיטה משתמשת הידרוקסילנול כחול מחוון הצבע מתכת וספקטרוסקופיה UV-Vis כמו הגלאי.

קוונפיקציה של מתכת Leaching ב קיבוע מתכת זיקה כרומטוגרפיה

Contamination of enzymes with metals leached from immobilized metal affinity chromatography (IMAC) columns poses a major concern for enzymologists, as ...

השיטה שלנו היא משמעותית, כפי שהוא מאפשר הביוכימאי הממוצע במהירות לקבוע אם דגימות מבודדות באמצעות כרומטוגרפיה זיקה מתכת משותק מזוהמים עם מתכות מעבר. היתרון העיקרי הוא הקלות שבה ניתן לבצע את ההתנצלות. ההתמדה משתמשת מכשור וטכניקות משותפות לרוב מעבדות הביוכימיה, וזה יכול להיות מיושם בקלות ובמהירות.בעוד במאמר זה אנו מיישמים שיטה זו עבור דגימות מבודדות עם עמודת ניקל-NTA, השיטה יכולה לשמש עם כל שרפין זיקה מתכת אחר. משתמשים בפעם הראשונה צריך לנסות שיטה זו עם פתרון מלאי ניקל של ריכוז ידוע. פעולה זו תכיר להם את זרימת העבודה, הצבעים לדוגמה וההיפנים המוצגים בשינויים ספקטרליים.הדגימה של ההליך תהיה קול סוויין, טכנאי מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, הפעל וחימום ספקטרופוטומטר UV-Vis. לקבוע את שברי הכרומטוגרפיה להיות assayed באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis מערך דיודה עם ספיגה אופטית ב 280 ננומטר לכמת את החלבון.השג חיץ מדגם של 10 עד 100 מילימולרים עם PH בין 7 ל- 12, כגון טריס, HEPES, MOPS ומאגר פוספט. הכן 12% משקל לפי פתרון נפח של פיזור HNB במאגר מדגם באמצעות 120 מיליגרם של HNB reagent עבור כל מיליליטר של פתרון מלאי מוכן. הגדר את הספקטרופוטומטר לאיסוף נתונים ב-647 ננומטר.השתמש בקובט קוורץ מלא במאגר הדגימה כדי לרוקן את הספקטרופוטומטר. הכן פתרון בקרה ב cuvette המכיל 50 microliters של מלאי HNB למיליליטר של נפח בדיקה הכולל. אפשר לפקד דגירה למשך שלוש דקות לפחות בטמפרטורת החדר.למדוד ולתזמן את הספיגה ב 647 ננומטר עבור מדגם הבקרה. הכינו את דגימות ההתזה על ידי ערבוב של 150 מיקרוליטרים של מלאי HNB עם 2850 מיקרוליטרים של שברי חלבון מדוללים כראוי עם מאגר הדגימה. אפשר לדגימה להדגור במשך שלוש דקות לפחות בטמפרטורת החדר.חזור על הקלטת הספקטרום כדי שכל שבר יימדד. במקרה שבו דילול לא מספיק מתקבל, הלהקה הספקטרלית כולה ב 647 ננומטר נעלם. בעוד עם דילול חזק מדי, המדגם אינו ניתן להתוות מהפקד.כדי לקבוע את ריכוז המתכת בכל מדגם, מצא תחילה את ההבדל של כל ספיגת מדגם ב 647 ננומטרים מהבקרה HNB. לקבוע את ריכוז המתכת micromolar באמצעות הנוסחה שבה DF הוא גורם הדילול עבור שבר האשכים, דלתא A-B-S 647 הוא שינוי הספיגה ב 647 ננומטר, 3.65 פעמים 10 כדי שלילי 2 מייצג את מקדם ההכחדה של HNB, ואני הוא הנתיב האופטי של cuvette בסנטימטרים. במחקר זה, הספקטרום של HNB חינם ב PH ניטרלי בספקטרום מייצג של שברים שהושלאו עבור יון ניקל מהבידוד של MSP1E3D1 מוצגים כאן.ירידה בספיגה ב-647 ננומטר בהשוואה לבקרת ה-HNB נצפתה, אשר התאים להיווצרות מתחמי HNB בנוכחות מתכת מעבר. כדי להדגים את היישום של הראי הזה, שני חלבוני פיגום קרום מתויג שלו, MSP1E3D1, MSP2N2, ורומן, שלושה heme, c-סוג ציטוכרום GSU0105, מ geobacter sulfurreducens, נותחו. תוכן החלבון וניקל יון של כל שבר עבור GSU0105 הועברו באופן משמעותי אחד מהשני, בעוד שברי MSP1E3D1 ו MSP2N2 שהכילו את החלבון ביותר היו גם את התוכן הניקל הגבוה ביותר.זה גם מאויר כי תוכן המתכת לא יכול להיות מופץ באופן שווה בין שברים שנאספו באמצעות כרומטוגרפיה זיקה מתכת מגויסת. חשוב ביותר לערבב כראוי ובעקביות את הריק בכל הדגימות ולאפשר זמני דגירה שווים עבור הריק בכל הדגימות. שברי חלבון בעלי עניין מיוחד יכולים להיות מנותחים עוד יותר עם ספקטרומטריית ספיגה אטומית או ICPMS כדי לאשר זיהום מתכת ולבדוק יונים מתכת חלבון chelated או קשור בחוזקה.מלבד זיהוי קשירת מתכות מעבר, טכניקה זו יכולה לשמש למדידת זיקה מחייבת ליוני מתכת מעבר לחלבונים. HNB וכל ניקל נוכח דגימות הם מגרים לעיניים ולעור בהתאמה. PPE סטנדרטי כולל כפפות והגנה על העיניים יש להשתמש במהלך השיטה.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Periodic Properties of the Elements

SCIENTISTS IN ACTION

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

מכלולים נגד סרטן מתכת: סינתזה וCytotoxicity הערכה על ידי assay MTT

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

מסגרות סינתזה ואפיון של פונקציונליות מתכת אורגנית

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radiolabeling וכימות של רמות סלולריות של Phosphoinositides ידי נצנץ זרימה מצמיד כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Synthesis of a Water-soluble Metal&#8211;Organic Complex Array

Synthesis of a Water-soluble MetalÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œOrganic Complex Array

סינתזה של מערך מורכב מתכת-אורגנית נמס במים

We demonstrate a method for the synthesis of a water-soluble multimetallic peptidic array containing a predetermined sequence of metal centers such as ...

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

בחיי עיר זיהוי, כימות תא בודד של תחמוצת מתכת חלקיקים באמצעות ניתוח Microprobe גרעיני

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

התגרענות בתיווך ליגנד והצמיחה של חלקיקי מתכת פלדיום

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Surface Functionalization of Metal-Organic Frameworks for Improved Moisture Resistance

Functionalization פני השטח של מסגרות מתכת-אורגנית להתנגדות לחות משופר

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. ...

Electrophoretic Crystallization of Ultrathin High-performance Metal-organic Framework Membranes

התגבשות electrophoretic של ממברנות זגוגית ביצועים גבוהים מסגרת מתכת-אורגני

We report the synthesis of thin, highly intergrown, polycrystalline metal-organic framework (MOF) membranes on a wide range of unmodified porous and ...

Molten-Salt Synthesis of Complex Metal Oxide Nanoparticles

מלח מותכת סינתזה של חלקיקי תחמוצת מתכת מורכבים

The development of feasible synthesis methods is critical for the successful exploration of novel properties and potential applications of nanomaterials. ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides