Name: quantification of metal leaching in immobilized metal affinity chromatography
Uploaded: 2020-01-17T16:00:00
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この資料は、グラントMCB-1817448の下で国立科学財団によってサポートされ、トーマスFとケイトミラージェフリーズ記念信託、バンクオブアメリカ、トラスティと指定ドナーヘーゼルソープカーマンとジョージゲイカーマンからの賞によってサポートされた作品に基づいています信頼。

1. アッセイ成分の準備
<ol><li>280 nmの光吸光度またはタンパク質定量の代替方法を使用してアッセイするクロマトグラフィー画分を決定し、タンパク質濃縮画分を同定します。 注:この作業では、ダイオードアレイUV-Vis分光度計を使用しました。スループットを高めるために、UV-Vis吸光度を測定できるプレートリーダーを使用できます。</li>
	<li>必要なアッセイ成分の調製<ol>
<li>7 ~ 12 の pH ?...

<ol>
	<li>Porath, J., Carlsson, J. A. N., Olsson, I., Belfrage, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).</li><li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized-Metal+Affinity+Chromatography+(IMAC):+A+Review.">Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review.</a> Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).</li><li>Takeda, N., Matsuoka, T., Gotoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiality+of+IMAC+as+sample+pretreatment+tool+in+food+analysis+for+veterinary+drugs.">Potentiality of IMAC as sample pretreatment tool in food analysis for veterinary drugs.</a> Chromatographia. 72 (1/2), 127-131 (2010).</li><li>Felix, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+serum+proteins+involved+in+pancreatic+cancer+cachexia.">Identification of serum proteins involved in pancreatic cancer cachexia.</a> Life sciences. 88 (5-6), 218-225 (2011).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+enhanced+laser+desorption/ionization+profiling:+New+diagnostic+method+of+HBV-related+hepatocellular+carcinoma.">Surface enhanced laser desorption/ionization profiling: New diagnostic method of HBV-related hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (1), 55-62 (2009).</li><li>Goldsmith, J. O., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+bacterial+photosynthetic+reaction+centers+with+an+engineered+poly-histidine+tag.">Rapid isolation of bacterial photosynthetic reaction centers with an engineered poly-histidine tag.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1276 (3), 171-175 (1996).</li><li>Guergova-Kuras, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+one-step+purification+of+a+fully+active+polyhistidine-tagged+cytochrome+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides.">Expression and one-step purification of a fully active polyhistidine-tagged cytochrome bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides.</a> Protein Expression and Purification. 15 (3), 370-380 (1999).</li><li>Mitchell, D. M., Gennis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+wildtype+and+mutant+cytochrome+c+oxidase+from+Rhodobacter+sphaeroides+by+Ni(2+)-NTA+affinity+chromatography.">Rapid purification of wildtype and mutant cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides by Ni(2+)-NTA affinity chromatography.</a> FEBS Letters. 368 (1), 148-150 (1995).</li><li>Tian, H., White, S., Yu, L., Yu, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+head+domain+movement+of+the+rieske+iron-sulfur+protein+in+electron+transfer+reaction+of+the+cytochrome+bc1+complex.">Evidence for the head domain movement of the rieske iron-sulfur protein in electron transfer reaction of the cytochrome bc1 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (11), 7146-7152 (1999).</li><li>Tian, H., Yu, L., Mather, M. W., Yu, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexibility+of+the+neck+region+of+the+rieske+iron-sulfur+protein+is+functionally+important+in+the+cytochrome+bc1+complex.">Flexibility of the neck region of the rieske iron-sulfur protein is functionally important in the cytochrome bc1 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (43), 27953-27959 (1998).</li><li>Louie, A. Y., Meade, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+complexes+as+enzyme+inhibitors.">Metal complexes as enzyme inhibitors.</a> Chemical Reviews. 99 (9), 2711-2734 (1999).</li><li>Tam&#225;s, M. J., Sharma, S. K., Ibstedt, S., Jacobson, T., Christen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heavy+Metals+and+Metalloids+As+a+Cause+for+Protein+Misfolding+and+Aggregation.">Heavy Metals and Metalloids As a Cause for Protein Misfolding and Aggregation.</a> Biomolecules. 4 (1), 252-267 (2014).</li><li>Gerencser, L., Maroti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retardation+of+proton+transfer+caused+by+binding+of+the+transition+metal+ion+to+the+bacterial+reaction+center+is+due+to+pKa+shifts+of+key+protonatable+residues.">Retardation of proton transfer caused by binding of the transition metal ion to the bacterial reaction center is due to pKa shifts of key protonatable residues.</a> Biochemistry. 40 (6), 1850-1860 (2001).</li><li>Klishin, S. S., Junge, W., Mulkidjanian, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash-induced+turnover+of+the+cytochrome+bc1+complex+in+chromatophores+of+Rhodobacter+capsulatus:+binding+of+Zn2++decelerates+likewise+the+oxidation+of+cytochrome+b,+the+reduction+of+cytochrome+c1+and+the+voltage+generation.">Flash-induced turnover of the cytochrome bc1 complex in chromatophores of Rhodobacter capsulatus: binding of Zn2+ decelerates likewise the oxidation of cytochrome b, the reduction of cytochrome c1 and the voltage generation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1553 (3), 177-182 (2002).</li><li>Link, T. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+ions+inhibit+the+QP+center+of+bovine+heart+mitochondrial+bc1+complex+by+blocking+a+protonatable+group.">Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bc1 complex by blocking a protonatable group.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (42), 25001-25006 (1995).</li><li>Block, H., Kubicek, J., Labahn, J., Roth, U., Sch&#228;fer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+comprehensive+quality+control+of+recombinant+human+Interleukin-1beta:+a+case+study+for+a+process+development+strategy.">Production and comprehensive quality control of recombinant human Interleukin-1beta: a case study for a process development strategy.</a> Protein Expression and Purification. 57 (2), 244-254 (2008).</li><li>Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+imidazole+to+the+heme+of+cytochrome+c1+and+inhibition+of+the+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides:+II.+Kinetics+and+mechanism+of+binding.">Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: II. Kinetics and mechanism of binding.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22522-22531 (2010).</li><li>Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+imidazole+to+the+heme+of+cytochrome+c1+and+inhibition+of+the+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides:+I.+Equilibrium+and+modeling+studies.">Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: I. Equilibrium and modeling studies.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22513-22521 (2010).</li><li>Bornhorst, J. A., Falke, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins+using+polyhistidine+affinity+tags.">Purification of proteins using polyhistidine affinity tags.</a> Methods in Enzymology. 326, 245-254 (2000).</li><li>Kokhan, O., Marzolf, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+transition+metal+leaching+in+metal+affinity+chromatography+with+hydroxynaphthol+blue.">Detection and quantification of transition metal leaching in metal affinity chromatography with hydroxynaphthol blue.</a> Analytical Biochemistry. 582, 113347 (2019).</li><li>Doyle, C., Naser, D., Bauman, H., Rumfeldt, J., Meiering, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+method+for+simultaneous+measurement+of+zinc+and+copper+in+metalloproteins+using+4-(2-pyridylazo)resorcinol.">Spectrophotometric method for simultaneous measurement of zinc and copper in metalloproteins using 4-(2-pyridylazo)resorcinol.</a> Analytical Biochemistry. 579, 44-56 (2019).</li><li>Furrer, J., Smith, G. S., Therrien, B., Gasser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inorganic Chemical Biology. , (2014).</li><li>Hogeling, S. M., Cox, M. T., Bradshaw, R. M., Smith, D. P., Duckett, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+proteins+in+whole+blood,+plasma+and+DBS,+with+element-labelled+antibody+detection+by+ICP-MS.">Quantification of proteins in whole blood, plasma and DBS, with element-labelled antibody detection by ICP-MS.</a> Analytical Biochemistry. 575, 10-16 (2019).</li><li>Yamasaki, S., Tsumura, A., Takaku, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultratrace+Elements+in+Terrestrial+Water+as+Determined+by+High-Resolution+ICP-MS.">Ultratrace Elements in Terrestrial Water as Determined by High-Resolution ICP-MS.</a> Microchemical Journal. 49 (2), 305-318 (1994).</li><li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+Formation+Between+Hydroxy+Naphthol+Blue+and+First+Row+Transition+Metal+Cyanide+Complexes.">Complex Formation Between Hydroxy Naphthol Blue and First Row Transition Metal Cyanide Complexes.</a> Analytical Letters. 10 (13), 1105-1113 (1977).</li><li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Transition+Metal+Ions+by+the+Calcium+Indicator+Hydroxy+Naphthol+Blue.">Binding of Transition Metal Ions by the Calcium Indicator Hydroxy Naphthol Blue.</a> Analytical Letters. 11 (4), 355-362 (1978).</li><li>Temel, N. K., Sertakan, K., G&#252;rkan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preconcentration+and+Determination+of+Trace+Nickel+and+Cobalt+in+Milk-Based+Samples+by+Ultrasound-Assisted+Cloud+Point+Extraction+Coupled+with+Flame+Atomic+Absorption+Spectrometry.">Preconcentration and Determination of Trace Nickel and Cobalt in Milk-Based Samples by Ultrasound-Assisted Cloud Point Extraction Coupled with Flame Atomic Absorption Spectrometry.</a> Biological Trace Element Research. 186 (2), 597-607 (2018).</li><li>Ferreira, S. L. C., Santos, B. F., de Andrade, J. B., Costa, A. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+derivative+spectrophotometric+determination+of+nickel+with+hydroxynaphthol+blue.">Spectrophotometric and derivative spectrophotometric determination of nickel with hydroxynaphthol blue.</a> Microchimica Acta. 122 (1), 109-115 (1996).</li><li>Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Self-Assembly+of+Monodisperse+Phospholipid+Bilayer+Nanodiscs+with+Controlled+Size.">Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (11), 3477-3487 (2004).</li><li>Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+extended+membrane+scaffold+proteins+for+self-assembly+of+soluble+nanoscale+lipid+bilayers.">Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 23 (11), 843-848 (2010).</li><li>Bonta, M., Hegedus, B., Limbeck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+dried-droplets+deposited+on+pre-cut+filter+paper+disks+for+quantitative+LA-ICP-MS+imaging+of+biologically+relevant+minor+and+trace+elements+in+tissue+samples.">Application of dried-droplets deposited on pre-cut filter paper disks for quantitative LA-ICP-MS imaging of biologically relevant minor and trace elements in tissue samples.</a> Analytica Chimica Acta. 908, 54-62 (2016).</li><li>Olmedo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+method+to+quantify+chromium,+cadmium,+manganese,+nickel+and+lead+in+human+whole+blood,+urine,+saliva+and+hair+samples+by+electrothermal+atomic+absorption+spectrometry.">Validation of a method to quantify chromium, cadmium, manganese, nickel and lead in human whole blood, urine, saliva and hair samples by electrothermal atomic absorption spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 659 (1), 60-67 (2010).</li><li>Shyamal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Selective+Turn-On+Fluorogenic+Chemosensor+for+Robust+Quantification+of+Zn(II)+Based+on+Aggregation+Induced+Emission+Enhancement+Feature.">Highly Selective Turn-On Fluorogenic Chemosensor for Robust Quantification of Zn(II) Based on Aggregation Induced Emission Enhancement Feature.</a> ACS Sensors. 1 (6), 739-747 (2016).</li><li>Kudo, H., Yamada, K., Watanabe, D., Suzuki, K., Citterio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-Based+Analytical+Device+for+Zinc+Ion+Quantification+in+Water+Samples+with+Power-Free+Analyte+Concentration.">Paper-Based Analytical Device for Zinc Ion Quantification in Water Samples with Power-Free Analyte Concentration.</a> Micromachines. 8 (4), 127 (2017).</li><li>Liu, R., Zhang, P., Li, H., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-cloth+integrated+with+gravity/capillary+flow+chemiluminescence+(GCF-CL):+towards+simple,+inexpensive,+portable,+flow+system+for+measuring+trivalent+chromium+in+water.">Lab-on-cloth integrated with gravity/capillary flow chemiluminescence (GCF-CL): towards simple, inexpensive, portable, flow system for measuring trivalent chromium in water.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 236 (C), 35-43 (2016).</li></ol>

HNBを用いた金属の比色検出は、IMAC樹脂からの金属イオンの遷移によるタンパク質汚染の程度を定量化する簡単な方法を提供します。Ref. 20で確立したように、Ni2+は1:1のストイチオメトリーとpHによるNi-HNB複合体の解離定数を用いてHNBに結合します。ただし、複素 Kdは、すべての推奨 (7-12) pH 値に対してサブ nM 範囲内にあります。実用的には、EDTAのような他の強力なキレート試...

ポラスと同僚1による創業以来、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)は、Zn2+、Ni2+、Cu2+、Co2+などの遷移金属イオンと結合する能力に基づいてタンパク質を迅速に分離する方法となっています。これは、最も一般的に設計されたポリヒスチジンタグを介して行われ、現在、組換えタンパク質2の分離のための最も一般的なクロマトグラフィー精製技術の一つです。IMACはまた、食品サンプル分析3のためのキノロン、テトラサイクリン、アミノグリコシド、マクロライド、およびβラクタムを単離する方法として組換えタンパク質精製を超えるアプリケーションを発見し、肝臓および膵臓癌のための血清タンパク質マーカーを同定するステップとして4、5.当然のことながら、IMACはまた、多くの天然生物エネルギー酵素6、7、8、9、10の単離のための選択の方法となっている。しかしながら、酵素活性バイオエネルギータンパク質に関する研究のためのこれらの精製方法の成功した実施は、カラムマトリックスから溶出物に浸出した金属カチオンのごくわずかなレベルの存在に依存する。IMACで一般的に使用される二価金属陽イオンは、低濃度11、12であっても病理学的生物学的意義を知っている。これらの金属の生理学的効果は、細胞呼吸または光合成13、14、15の阻害剤として致死性を証明することができる生物エネルギー系で最も顕著である。同様の問題は、残留汚染物質金属がタンパク質の生物学的機能や生化学的および生物物理学的手法による特徴付けを妨げる可能性のあるタンパク質クラスの大半では避けられない。
酸化条件下での金属汚染のレベルとイミダゾールを溶出剤として使用することは一般的に低い16ですが、システイン還元剤(DTT、β-メルカプトエタノールなど)の存在下で行われるタンパク質分離、またはヒスチジン17、18またはエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)のようなより強いキレート剤を用いて行われるタンパク質分離は、金属汚染のはるかに高いレベルをもたらす。同様に、IMAC樹脂中の金属イオンはカルボン酸基によって頻繁に協調するため、酸性条件下で行われるタンパク質溶離物も、はるかに高いレベルの金属汚染を有する可能性が高い。溶液中の金属含有量は、ppb-ppt範囲21、22、23、24における検出限界まで原子吸光分析(AAS)および誘導結合プラズマ質量分析(ICP-MS)を用いて評価することができる。残念ながら、AASとICP-MSは、これらの方法は、特殊な機器やトレーニングへのアクセスを必要とするので、従来の生化学ラボで検出するための現実的な手段ではありません。
Brittain25,26による以前の研究は、溶液中の遷移金属の存在を同定する方法としてヒドロキシナフトールブルー(HNB)の使用を調査した。しかし、データ20にはいくつかの内部矛盾があり、それらの作品は適切なプロトコルを提供できませんでした。Temel et al.27および Ferreiraら28による研究は、潜在的な金属指標として HNB とのブリタインの研究に拡大しました。.しかし、Temel は、HNB をキレート剤としてのみ使用して、サンプル分析に AAS を使用するプロトコルを開発しました。フェレイラの研究は、563nmにおけるHNB吸光度スペクトルの変化を用いて、pH5.7におけるHNB金属錯体のスペクトルと重なり合う自由色素HNBスペクトルの領域であり、アッセイ感受性をかなり低くし、比較的弱い金属結合親和性20をもたらした。IMACからNi 2+浸出を行うNi2+のラボの問題に対処するために、我々はブリタイン25、26、フェレリア28によって行われた作業を拡大し、いくつかの遷移金属のナノモルレベルを検出することができる簡単なアッセイを開発しました。HNBは、IMAC金属に対してニッケルおよびその他の一般的な結合を亜ナノモル結合親和性と結合し、pH値20の広い範囲にわたって1:1複合体を形成することを示した。ここで報告されるアッセイは、これらの知見に基づいており、金属定量のために647nmのHNBスペクトルの吸光度変化を利用する。このアッセイは、金属色素錯体の比色検出と定量、および金属に結合する際の遊離色素の吸光度の変化を用いて、典型的な生化学ラボで見られる一般的な緩衝液および計装を用いて生理学的pH範囲で行うことができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9743-500</td>
			<td>media for E.coli growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, free acid</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxynaphthol blue disoidum salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>219916-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>IB0277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, free acid</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB0360</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>T870-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of metal leaching in immobilized metal affinity chromatography

固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)カラムから浸出した金属を含む酵素の汚染は、IMAC樹脂に使用される一般的な二価陽イオンの多くが酵素に対する阻害効果を有するので、酵素学者にとって大きな懸念事項です。しかし、金属浸出の程度と種々の溶出および還元試薬の影響は、一般的に利用可能な機器を使用するシンプルで実用的な遷移金属定量プロトコルがないため、大部分は十分に理解されていません。生化学研究室この問題に対処するために、精製工程としてIMACを用いて調製したサンプル中の金属汚染量を迅速に定量化するプロトコルを開発しました。この方法は、647nmにおけるHNBスペクトルの変化に基づいて、サンプル溶液中の金属カチオン含有量の比色指標としてヒドロキシナフトールブルー(HNB)を使用し、UV-Vis分光法を使用して、存在する金属の量を定量する手段として、ナノモル範囲に含まれる。溶液中の金属含有量は、原子吸光分光法または誘導結合プラズマ技術を使用して歴史的に決定されてきましたが、これらの方法は、典型的な生化学研究所の範囲外の特殊な機器とトレーニングを必要とします。ここで提案される方法は、生化学者が正確性を犠牲にすることなく、既存の装置と知識を使用してサンプルの金属含有量を決定するための簡単かつ迅速な方法を提供します。

中性pH(黒線)における遊離HNBのスペクトルと、MSP1E3D129の単離からNi2+に対してアッセイされた分画の代表的なスペクトルを図2に示す。成功したアッセイシリーズは、遷移金属の存在下でHNB複合体の形成に対応するHNB制御と比較して647nmでの吸光度の低下を実証すべきである。失敗したアッセイは、647 nmでの吸光度の増加によって示されるであろ?...

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Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography

固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて調製した試料に導入した金属を容易に定量するためのアッセイを提示する。この方法は、比色金属指標としてヒドロキシナフトールブルーを使用し、UV-Vis分光光度計を検出器として使用する。

固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにおける金属浸出の定量

Contamination of enzymes with metals leached from immobilized metal affinity chromatography (IMAC) columns poses a major concern for enzymologists, as ...

我々の方法は、平均的な生化学者が固定化された金属親和性クロマトグラフィーを使用して分離されたサンプルが遷移金属で汚染されているかどうかを迅速に判断することを可能にするので、重要である。主な利点は、アッセイを行うことができる容易さです。このアッセイは、ほとんどの生化学ラボに共通する計器と技術を使用しており、簡単かつ迅速に実装できます。この記事では、ニッケル NTA カラムで分離されたサンプルにこの方法を適用しますが、この方法は他の金属アフィニティ樹脂と共に使用できます。初めてユーザーは、既知の濃度のニッケルストック溶液でこの方法を試してみてください。これにより、スペクトルの変化に示されたワークフロー、サンプルカラー、および樹脂に慣れ親しみます。手順を実証するには、私の研究室の技術者コール・スウェインです。まず、UV-Vis分光光度計をオンにしてウォームアップします。280ナノメートルの光吸光度を有するダイオードアレイUV-Vis分光光度計を用いて、タンパク質を定量化する測定対象のクロマトグラフィー画を決定する。トリス、HEPES、MOPS、リン酸緩衝液など、7~12の間のPHを有する10~100ミリモルのサンプルバッファーを得る。調製したストック溶液の1ミリリットルごとに120ミリグラムのHNB試薬を用いて、サンプルバッファー内のHNB分散液の体積分量で12%の重量を調製する。647ナノメートルでデータを収集するために分光光度計を設定します。サンプルバッファーで満たされたクベットを使用して、分光光度計をブランクにします。合計アッセイ量のミリリットル当たり50マイクロリットルのHNBストックを含むキュベットで制御溶液を調製します。コントロールを室温で最低3分間インキュベートします。コントロールサンプルの吸光度を647ナノメートルで測定し、記録します。サンプルバッファーと適切に希釈したタンパク質画分の 2850 マイクロリットルと HNB ストックの 150 マイクロリットルを混合することによってアッセイサンプルを準備します。サンプルを室温で最低3分間インキュベートします。測定する各分数について、スペクトル記録を繰り返します。希釈が不十分な場合には、647ナノメートルでの全スペクトルバンドがなくなっている。あまりにも強い希釈を伴いながら、サンプルはコントロールと区別できません。各サンプル中の金属の濃度を決定するために、まずHNB制御から647ナノメートルで各サンプル吸光度の差を見つける。DFがアッセイ画分の希釈因子である式を用いてマイクロモル中の金属濃度を決定し、デルタA-B-S 647は647ナノメートルでの吸光度変化、負の2に対する3.65倍の10倍はHNBの絶滅係数を表し、lはクベットの光学経路をセンチメートルで表す。本研究では、MSP1E3D1の単離からニッケルイオンに対してアッセイされた画分の代表的スペクトルにおける中性PHにおける遊離HNBのスペクトルをここに示す。HNB制御と比較して647ナノメートルでの吸光度の低下が観察され、これは遷移金属の存在下でのHNB複合体の形成に対応した。このアッセイの応用を実証するために、2つのタグ付き膜足場タンパク質、MSP1E3D1、MSP2N2、およびジオバクター硫黄減少から、新規の3ヘム、c型シトクロムGSU0105を分析した。GSU0105の各画分のタンパク質とニッケルイオン含有量は互いに有意にシフトし、最もタンパク質を含むMSP1E3D1およびMSP2N2の画分もニッケル含有量が最も高かった。また、動員された金属親和クロマトグラフィーを用いて収集した分画の中で金属含有量が均等に分布しないことも示した。すべてのサンプルでブランクを適切かつ一貫して混合し、すべてのサンプルでブランクのインキュベーション時間を均等にすることが最も重要です。特に関心のあるタンパク質の分画は、原子吸光分析またはICPMSでさらに分析して、金属汚染を確認し、キレートまたは強結合タンパク質金属イオンを検査することができます。遷移金属浸出検出以外にも、この技術は、タンパク質への遷移金属イオンの結合親和性を測定するために使用することができます。試料中に存在するHNBおよび任意のニッケルは、それぞれ眼および皮膚に刺激を与える。手袋と目の保護を含む標準PPEは、方法の間に使用する必要があります。

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