Name: quantification of metal leaching in immobilized metal affinity chromatography
Uploaded: 2020-01-17T16:00:00
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Este material é baseado no trabalho apoiado pela National Science Foundation Grant MCB-1817448 e por um prêmio do Thomas F. e Kate Miller Jeffress Memorial Trust, Bank of America, Trustee e doador especificado Hazel Thorpe Carman e George Gay Carman Confiar.

1. Preparação de componentes de ensaio
<ol><li>Determine as frações de cromatografia a serem atentas usando absorção óptica a 280 nm ou métodos alternativos de quantificação de proteínapara identificar as frações enriquecidas com proteínas. NOTA: Para este trabalho, usamos uma matriz de diodo UV-Vis espectrômetro. Para aumentar a entrada, um leitor de placa capaz de medir a absorção UV-Vis pode ser usado.</li>
	<li>Preparação dos componentes necessários do ensaio<ol>
<li>Prepare ou obtenha 10-100...

<ol>
	<li>Porath, J., Carlsson, J. A. N., Olsson, I., Belfrage, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).</li><li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized-Metal+Affinity+Chromatography+(IMAC):+A+Review.">Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review.</a> Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).</li><li>Takeda, N., Matsuoka, T., Gotoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiality+of+IMAC+as+sample+pretreatment+tool+in+food+analysis+for+veterinary+drugs.">Potentiality of IMAC as sample pretreatment tool in food analysis for veterinary drugs.</a> Chromatographia. 72 (1/2), 127-131 (2010).</li><li>Felix, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+serum+proteins+involved+in+pancreatic+cancer+cachexia.">Identification of serum proteins involved in pancreatic cancer cachexia.</a> Life sciences. 88 (5-6), 218-225 (2011).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+enhanced+laser+desorption/ionization+profiling:+New+diagnostic+method+of+HBV-related+hepatocellular+carcinoma.">Surface enhanced laser desorption/ionization profiling: New diagnostic method of HBV-related hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (1), 55-62 (2009).</li><li>Goldsmith, J. O., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+bacterial+photosynthetic+reaction+centers+with+an+engineered+poly-histidine+tag.">Rapid isolation of bacterial photosynthetic reaction centers with an engineered poly-histidine tag.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1276 (3), 171-175 (1996).</li><li>Guergova-Kuras, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+one-step+purification+of+a+fully+active+polyhistidine-tagged+cytochrome+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides.">Expression and one-step purification of a fully active polyhistidine-tagged cytochrome bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides.</a> Protein Expression and Purification. 15 (3), 370-380 (1999).</li><li>Mitchell, D. M., Gennis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+wildtype+and+mutant+cytochrome+c+oxidase+from+Rhodobacter+sphaeroides+by+Ni(2+)-NTA+affinity+chromatography.">Rapid purification of wildtype and mutant cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides by Ni(2+)-NTA affinity chromatography.</a> FEBS Letters. 368 (1), 148-150 (1995).</li><li>Tian, H., White, S., Yu, L., Yu, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+head+domain+movement+of+the+rieske+iron-sulfur+protein+in+electron+transfer+reaction+of+the+cytochrome+bc1+complex.">Evidence for the head domain movement of the rieske iron-sulfur protein in electron transfer reaction of the cytochrome bc1 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (11), 7146-7152 (1999).</li><li>Tian, H., Yu, L., Mather, M. W., Yu, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexibility+of+the+neck+region+of+the+rieske+iron-sulfur+protein+is+functionally+important+in+the+cytochrome+bc1+complex.">Flexibility of the neck region of the rieske iron-sulfur protein is functionally important in the cytochrome bc1 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (43), 27953-27959 (1998).</li><li>Louie, A. Y., Meade, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+complexes+as+enzyme+inhibitors.">Metal complexes as enzyme inhibitors.</a> Chemical Reviews. 99 (9), 2711-2734 (1999).</li><li>Tam&#225;s, M. J., Sharma, S. K., Ibstedt, S., Jacobson, T., Christen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heavy+Metals+and+Metalloids+As+a+Cause+for+Protein+Misfolding+and+Aggregation.">Heavy Metals and Metalloids As a Cause for Protein Misfolding and Aggregation.</a> Biomolecules. 4 (1), 252-267 (2014).</li><li>Gerencser, L., Maroti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retardation+of+proton+transfer+caused+by+binding+of+the+transition+metal+ion+to+the+bacterial+reaction+center+is+due+to+pKa+shifts+of+key+protonatable+residues.">Retardation of proton transfer caused by binding of the transition metal ion to the bacterial reaction center is due to pKa shifts of key protonatable residues.</a> Biochemistry. 40 (6), 1850-1860 (2001).</li><li>Klishin, S. S., Junge, W., Mulkidjanian, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash-induced+turnover+of+the+cytochrome+bc1+complex+in+chromatophores+of+Rhodobacter+capsulatus:+binding+of+Zn2++decelerates+likewise+the+oxidation+of+cytochrome+b,+the+reduction+of+cytochrome+c1+and+the+voltage+generation.">Flash-induced turnover of the cytochrome bc1 complex in chromatophores of Rhodobacter capsulatus: binding of Zn2+ decelerates likewise the oxidation of cytochrome b, the reduction of cytochrome c1 and the voltage generation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1553 (3), 177-182 (2002).</li><li>Link, T. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+ions+inhibit+the+QP+center+of+bovine+heart+mitochondrial+bc1+complex+by+blocking+a+protonatable+group.">Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bc1 complex by blocking a protonatable group.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (42), 25001-25006 (1995).</li><li>Block, H., Kubicek, J., Labahn, J., Roth, U., Sch&#228;fer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+comprehensive+quality+control+of+recombinant+human+Interleukin-1beta:+a+case+study+for+a+process+development+strategy.">Production and comprehensive quality control of recombinant human Interleukin-1beta: a case study for a process development strategy.</a> Protein Expression and Purification. 57 (2), 244-254 (2008).</li><li>Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+imidazole+to+the+heme+of+cytochrome+c1+and+inhibition+of+the+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides:+II.+Kinetics+and+mechanism+of+binding.">Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: II. Kinetics and mechanism of binding.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22522-22531 (2010).</li><li>Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+imidazole+to+the+heme+of+cytochrome+c1+and+inhibition+of+the+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides:+I.+Equilibrium+and+modeling+studies.">Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: I. Equilibrium and modeling studies.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22513-22521 (2010).</li><li>Bornhorst, J. A., Falke, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins+using+polyhistidine+affinity+tags.">Purification of proteins using polyhistidine affinity tags.</a> Methods in Enzymology. 326, 245-254 (2000).</li><li>Kokhan, O., Marzolf, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+transition+metal+leaching+in+metal+affinity+chromatography+with+hydroxynaphthol+blue.">Detection and quantification of transition metal leaching in metal affinity chromatography with hydroxynaphthol blue.</a> Analytical Biochemistry. 582, 113347 (2019).</li><li>Doyle, C., Naser, D., Bauman, H., Rumfeldt, J., Meiering, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+method+for+simultaneous+measurement+of+zinc+and+copper+in+metalloproteins+using+4-(2-pyridylazo)resorcinol.">Spectrophotometric method for simultaneous measurement of zinc and copper in metalloproteins using 4-(2-pyridylazo)resorcinol.</a> Analytical Biochemistry. 579, 44-56 (2019).</li><li>Furrer, J., Smith, G. S., Therrien, B., Gasser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inorganic Chemical Biology. , (2014).</li><li>Hogeling, S. M., Cox, M. T., Bradshaw, R. M., Smith, D. P., Duckett, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+proteins+in+whole+blood,+plasma+and+DBS,+with+element-labelled+antibody+detection+by+ICP-MS.">Quantification of proteins in whole blood, plasma and DBS, with element-labelled antibody detection by ICP-MS.</a> Analytical Biochemistry. 575, 10-16 (2019).</li><li>Yamasaki, S., Tsumura, A., Takaku, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultratrace+Elements+in+Terrestrial+Water+as+Determined+by+High-Resolution+ICP-MS.">Ultratrace Elements in Terrestrial Water as Determined by High-Resolution ICP-MS.</a> Microchemical Journal. 49 (2), 305-318 (1994).</li><li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+Formation+Between+Hydroxy+Naphthol+Blue+and+First+Row+Transition+Metal+Cyanide+Complexes.">Complex Formation Between Hydroxy Naphthol Blue and First Row Transition Metal Cyanide Complexes.</a> Analytical Letters. 10 (13), 1105-1113 (1977).</li><li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Transition+Metal+Ions+by+the+Calcium+Indicator+Hydroxy+Naphthol+Blue.">Binding of Transition Metal Ions by the Calcium Indicator Hydroxy Naphthol Blue.</a> Analytical Letters. 11 (4), 355-362 (1978).</li><li>Temel, N. K., Sertakan, K., G&#252;rkan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preconcentration+and+Determination+of+Trace+Nickel+and+Cobalt+in+Milk-Based+Samples+by+Ultrasound-Assisted+Cloud+Point+Extraction+Coupled+with+Flame+Atomic+Absorption+Spectrometry.">Preconcentration and Determination of Trace Nickel and Cobalt in Milk-Based Samples by Ultrasound-Assisted Cloud Point Extraction Coupled with Flame Atomic Absorption Spectrometry.</a> Biological Trace Element Research. 186 (2), 597-607 (2018).</li><li>Ferreira, S. L. C., Santos, B. F., de Andrade, J. B., Costa, A. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+derivative+spectrophotometric+determination+of+nickel+with+hydroxynaphthol+blue.">Spectrophotometric and derivative spectrophotometric determination of nickel with hydroxynaphthol blue.</a> Microchimica Acta. 122 (1), 109-115 (1996).</li><li>Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Self-Assembly+of+Monodisperse+Phospholipid+Bilayer+Nanodiscs+with+Controlled+Size.">Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (11), 3477-3487 (2004).</li><li>Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+extended+membrane+scaffold+proteins+for+self-assembly+of+soluble+nanoscale+lipid+bilayers.">Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 23 (11), 843-848 (2010).</li><li>Bonta, M., Hegedus, B., Limbeck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+dried-droplets+deposited+on+pre-cut+filter+paper+disks+for+quantitative+LA-ICP-MS+imaging+of+biologically+relevant+minor+and+trace+elements+in+tissue+samples.">Application of dried-droplets deposited on pre-cut filter paper disks for quantitative LA-ICP-MS imaging of biologically relevant minor and trace elements in tissue samples.</a> Analytica Chimica Acta. 908, 54-62 (2016).</li><li>Olmedo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+method+to+quantify+chromium,+cadmium,+manganese,+nickel+and+lead+in+human+whole+blood,+urine,+saliva+and+hair+samples+by+electrothermal+atomic+absorption+spectrometry.">Validation of a method to quantify chromium, cadmium, manganese, nickel and lead in human whole blood, urine, saliva and hair samples by electrothermal atomic absorption spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 659 (1), 60-67 (2010).</li><li>Shyamal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Selective+Turn-On+Fluorogenic+Chemosensor+for+Robust+Quantification+of+Zn(II)+Based+on+Aggregation+Induced+Emission+Enhancement+Feature.">Highly Selective Turn-On Fluorogenic Chemosensor for Robust Quantification of Zn(II) Based on Aggregation Induced Emission Enhancement Feature.</a> ACS Sensors. 1 (6), 739-747 (2016).</li><li>Kudo, H., Yamada, K., Watanabe, D., Suzuki, K., Citterio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-Based+Analytical+Device+for+Zinc+Ion+Quantification+in+Water+Samples+with+Power-Free+Analyte+Concentration.">Paper-Based Analytical Device for Zinc Ion Quantification in Water Samples with Power-Free Analyte Concentration.</a> Micromachines. 8 (4), 127 (2017).</li><li>Liu, R., Zhang, P., Li, H., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-cloth+integrated+with+gravity/capillary+flow+chemiluminescence+(GCF-CL):+towards+simple,+inexpensive,+portable,+flow+system+for+measuring+trivalent+chromium+in+water.">Lab-on-cloth integrated with gravity/capillary flow chemiluminescence (GCF-CL): towards simple, inexpensive, portable, flow system for measuring trivalent chromium in water.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 236 (C), 35-43 (2016).</li></ol>

A detecção colorimétrica de metais usando HNB fornece uma maneira simples de quantificar o grau de contaminação por proteínas por íons metálicos de transição de resinas IMAC. Como estabelecemos em Ref. 20, o Ni2+ se liga à HNB com 1:1 stoichiometria e a constante de dissociação para as mudanças complexas de Ni-HNB com pH. No entanto, o complexo Kd está na faixa sub-nM para todos os valores recomendados (7-12) de pH. Em termos práticos, isso significa que todos os Ni2 + em ...

Desde a sua criação por Porath e colegas de trabalho1, a cromatografia de afinidade metálica imobilizada (IMAC) tornou-se um método de escolha para separar rapidamente as proteínas com base em sua capacidade de se relacionar com íons de metal de transição, como Zn2+, Ni2+,2+, e Co2+. Isso é mais comumente feito através de etiquetas de poli-histidina projetadas e agora é uma das técnicas de purificação cromatográfica mais comuns para o isolamento de proteínas recombinantes2. O IMAC também encontrou aplicações além da purificação de proteínarecombinante como uma forma de isolar quinolonas, tetraciclinas, aminoglicosídeos, macrolídeos e β-lacmas para análise de amostras alimentares3 e como um passo na identificação de marcadores de proteína sangue-soro para cânceres de fígado e pâncreas4,5. Não surpreendentemente, IMAC também se tornou um método de escolha para o isolamento de uma série de enzimas bioenergéticas nativas6,7,8,9,10. No entanto, a implementação bem-sucedida desses métodos de purificação para estudos sobre proteínas bioenergéticas enzimáticas ativas depende da presença de níveis insignificantes de caations metálicas lixiviadas da matriz da coluna para o eluate. As caations metálicas divalentes comumente usadas no IMAC têm significado biológico patológico conhecido, mesmo em baixas concentrações11,12. O efeito fisiológico desses metais é mais pronunciado em sistemas bioenergéticos, onde podem ser letais como inibidores da respiração celular ou fotossíntese13,14,15. Questões semelhantes são inevitáveis para a maioria das classes de proteínas onde metais contaminantes residuais podem interferir com as funções biológicas de uma proteína ou caracterização com técnicas bioquímicas e biofísicas.
Enquanto os níveis de contaminação de metal condições oxidantes e o uso de imidazol como eluante são tipicamente baixos16,os isolamentos proteicos realizados na presença de agentes redutores de cisteína (DTT, β-mercaptoethanol, etc.) ou com quelantes mais fortes como histidina17,18 ou ácido etilediátetraa (EDTA) resultam em níveis muito mais altos de contaminação de metal19,20. Da mesma forma, uma vez que os íons metálicos nas resinas iMAC são frequentemente coordenados por grupos carboxílicos, as eluções de proteínas realizadas em condições ácidas também são susceptíveis de ter níveis muito mais elevados de contaminação de metais. O conteúdo metálico em soluções pode ser avaliado usando espectroscopia de absorção atômica (AAS) e espectrometria de massa plasmática (ICP-MS) indutivamente acoplada até um limite de detecção na faixa ppb-ppt21,22,23,24. Infelizmente, a AAS e o ICP-MS não são meios realistas para detecção em um laboratório de bioquímica tradicional, pois esses métodos exigiriam acesso a equipamentos e treinamento especializados.
Trabalhos anteriores de Brittain25,26 investigaram o uso de hidroxinaphthol azul (HNB) como forma de identificar a presença de metais de transição em solução. No entanto, houve várias contradições internas nos dados20 e essas obras não ofereceram um protocolo adequado. Estudos de Temel et al.27 e Ferreira et al.28 expandiram o trabalho de Brittain com a HNB como um potencial indicador de metal. No entanto, Temel desenvolveu um protocolo que faz uso de AAS para análise de amostras, usando HNB apenas como agente quelante. O estudo de Ferreira utilizou a mudança nos espectros de absorção de HNB a 563 nm, região dos espectros HNB de corlivre que se sobrepõe fortemente aos espectros de complexos de metais HNB no pH 5.7, tornando a sensibilidade ao ensaio bastante baixa, bem como resultando em afinidade de ligação metálica relativamente fraca20. Para abordar problemas em nosso próprio laboratório com a lixiviação Ni2+ da IMAC, expandimos o trabalho feito pela Brittain25,26 e Ferreria28 para desenvolver um ensaio fácil capaz de detectar níveis de nanomolar de vários metais de transição. Mostramos que a HNB liga níquel e outros comuns para metais IMAC com afinidades de ligação subnamolar e formam 1:1 complexo em uma ampla gama de valores de pH20. O ensaio aqui relatado é baseado nestes resultados e utiliza mudanças do absorveance no espectro de HNB em 647 nm para o quantification do metal. O ensaio pode ser realizado na faixa de pH fisiológico usando amortecedores comuns e instrumentação encontrada em um laboratório típico de bioquímica usando detecção colorimétrica e quantificação de complexos de corante metálico e a mudança associada na absorção do corante livre quando se liga ao metal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9743-500</td>
			<td>media for E.coli growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, free acid</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxynaphthol blue disoidum salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>219916-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>IB0277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, free acid</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB0360</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>T870-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of metal leaching in immobilized metal affinity chromatography

A contaminação de enzimas com metais lixiviadas a partir de colunas de cromatografia de afinidade metálica imobilizada (IMAC) representa uma grande preocupação para os enzimologistas, já que muitas das cações comuns de di e trivalente usadas em resinas iMAC têm um efeito inibitório sobre as enzimas. No entanto, a extensão da lixiviação metálica e o impacto de vários reagentes de eluting e redução são mal compreendidos em grande parte devido à ausência de protocolos simples e práticos de quantificação metálica de transição que usam equipamentos normalmente disponíveis laboratórios de bioquímica. Para resolver esse problema, desenvolvemos um protocolo para quantificar rapidamente a quantidade de contaminação de metal em amostras preparadas usando imac como uma etapa de purificação. O método utiliza o azul hidroxinaphthol (HNB) como um indicador colorimétrico para o conteúdo de caminação metálica em uma solução de amostra e espectroscopia UV-Vis como um meio de quantificar a quantidade de metal presente, na faixa de nanomolar, com base na mudança no espectro HNB em 647 nm. Embora o conteúdo metálico em uma solução tenha sido historicamente determinado usando espectroscopia de absorção atômica ou técnicas de plasma indutivamente acopladas, esses métodos exigem equipamentos especializados e treinamento fora do escopo de um laboratório típico de bioquímica. O método proposto aqui fornece uma maneira simples e rápida para que os bioquímicos determinem o índice do metal das amostras que usam o equipamento e o conhecimento existentes sem sacrificar a exatidão.

O espectro de HNB livre em pH neutro (linha preta) e espectros representativos de frações afiguradas para Ni2+ do isolamento de MSP1E3D129 são mostrados na Figura 2. Uma série bem-sucedida do ensaio deve demonstrar uma absorção diminuída em 647 nm comparado ao controle de HNB, que corresponde à formação de complexos de HNB na presença de um metal da transição. Um ensaio falhado seria indicado por um aumento na absorção em 647 nm. Alternativam...

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Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography

Apresentamos um ensaio para a fácil quantificação de metais introduzidos em amostras preparadas usando cromatografia de afinidade metálica imobilizada. O método utiliza hidroxinaphthol azul como o indicador de metal colorimétrico e um espectrômetro UV-Vis como o detector.

Quantificação da lixiviação metálica na cromatografia imobilizada da afinidade metálica

Contamination of enzymes with metals leached from immobilized metal affinity chromatography (IMAC) columns poses a major concern for enzymologists, as ...

Nosso método é significativo, pois permite que o bioquímico médio determine rapidamente se amostras isoladas usando cromatografia de afinidade metálica imobilizada estão contaminadas com metais de transição. A principal vantagem é a facilidade pela qual o ensaio pode ser realizado. O ensaio usa instrumentação e técnicas comuns à maioria dos laboratórios de bioquímica, e pode ser implementado de forma fácil e rápida.Enquanto neste artigo aplicamos este método para amostras isoladas com uma coluna níquel-NTA, o método pode ser usado com qualquer outra resina de afinidade metálica. Primeira vez que os usuários devem experimentar este método com uma solução de níquel estoque de concentração conhecida. Isso irá familiarizá-los com o fluxo de trabalho, cores de amostra e resinas mostradas em alterações espectrais.Demonstrando o procedimento será Cole Swain, um técnico do meu laboratório. Para começar, ligue e aqueça o espectrômetro UV-Vis. Determine as frações de cromatografia a serem avaliadas usando um espectrofotômetro UV-Vis com absorvção óptica a 280 nanômetros para quantificar a proteína.Obtenha tampão amostral de 10 a 100 mililitros com um PH entre 7 e 12, como Tris, HEPES, MOPS e tampão fosfato. Prepare uma solução de 12% de peso por volume de dispersão HNB no buffer de amostra usando 120 miligramas de reagente HNB para cada mililitro de solução de estoque preparada. Defina o espectótmetro para coletar dados em 647 nanômetros.Use uma cuvette de quartzo preenchida com o tampão de amostra para passar o espaço espectotúmetro. Prepare uma solução de controle em uma cuvette contendo 50 microliters de estoque HNB por mililitro de volume total de ensaios. Deixe o controle incubar por um mínimo de três minutos em temperatura ambiente.Meça e regisse a absorvância em 647 nanômetros para a amostra de controle. Prepare as amostras de ensaio misturando 150 microliters de estoque HNB com 2850 microliters de frações proteicas adequadamente diluídas com o tampão amostral. Deixe a amostra incubar por um mínimo de três minutos em temperatura ambiente.Repita o registro de espectro para que cada fração seja medida. No caso de diluição insuficiente, toda a banda espectral a 647 nanômetros se foi. Embora com diluição muito forte, a amostra é indissistível do controle.Para determinar a concentração de metal em cada amostra, primeiro encontre a diferença de cada absorvimento amostral a 647 nanômetros do controle HNB. Determine a concentração metálica em micromolar usando a fórmula onde DF é o fator de diluição para a fração de ensaio, delta A-B-S 647 é a mudança de absorvância em 647 nanômetros, 3,65 vezes 10 para o negativo 2 representa o coeficiente de extinção do HNB, e l é o caminho óptico de Cuvette em centímetros. Neste estudo, o espectro de HNB livre em PH neutro em espectro representativo de frações avaliadas para íon níquel a partir do isolamento do MSP1E3D1 são mostrados aqui.Observou-se uma diminuição da absorvância em 647 nanômetros em relação ao controle hnb, o que correspondeu à formação de complexos HNB na presença de um metal de transição. Para demonstrar a aplicação deste ensaio, foram analisadas duas proteínas de espeto de membrana marcadas, MSP1E3D1, MSP2N2, e um novo, citocromo c-tipo C GSU0105, de enxofre geobacter, foram analisados. O teor de íons de proteína e níquel de cada fração para GSU0105 foi significativamente deslocado um do outro, enquanto as frações para MSP1E3D1 e MSP2N2 que continham mais proteínas também apresentaram o maior teor de níquel.Também é ilustrado que o conteúdo metálico pode não ser distribuído uniformemente entre frações coletadas por meio de uma cromatografia de afinidade metálica mobilizada. É mais importante misturar adequadamente e consistentemente o branco em todas as amostras e permitir tempos iguais de incubação para o branco em todas as amostras. Frações proteicas de interesse especial poderiam ser analisadas com espectrometria de absorção atômica ou ICPMS para confirmar a contaminação metálica e testar íons metálicos de proteínas quequeadas ou fortemente ligadas.Além da detecção de lixiviação metálica de transição, essa técnica pode ser usada para medir afinidades vinculantes em íons metálicos de transição para proteínas. HNB e qualquer níquel presente nas amostras são irritantes para os olhos e pele, respectivamente. Epi padrão, incluindo luvas e proteção ocular devem ser usados durante o método.

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