Name: quantification of metal leaching in immobilized metal affinity chromatography
Uploaded: 2020-01-17T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography at JoVE.com

Этот материал основан на работе, поддерживаемой Национальным научным фондом при Гранте MCB-1817448 и наградой от Томаса Ф. и Кейт Миллер Джеффресс Мемориал Траст, Бэнк оф Америка, попечитель и указанный донор Хейзел Торп Карман и Джордж Гей Карман Доверять.

1. Подготовка компонента асссе
<ol><li>Определите фракции хроматографии, которые необходимо анализировать с помощью оптической абсорбции на уровне 280 нм или альтернативных методов количественной оценки белка для определения обогащенных белками фракций. ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой работы мы ?...

<ol>
	<li>Porath, J., Carlsson, J. A. N., Olsson, I., Belfrage, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).</li><li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized-Metal+Affinity+Chromatography+(IMAC):+A+Review.">Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review.</a> Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).</li><li>Takeda, N., Matsuoka, T., Gotoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiality+of+IMAC+as+sample+pretreatment+tool+in+food+analysis+for+veterinary+drugs.">Potentiality of IMAC as sample pretreatment tool in food analysis for veterinary drugs.</a> Chromatographia. 72 (1/2), 127-131 (2010).</li><li>Felix, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+serum+proteins+involved+in+pancreatic+cancer+cachexia.">Identification of serum proteins involved in pancreatic cancer cachexia.</a> Life sciences. 88 (5-6), 218-225 (2011).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+enhanced+laser+desorption/ionization+profiling:+New+diagnostic+method+of+HBV-related+hepatocellular+carcinoma.">Surface enhanced laser desorption/ionization profiling: New diagnostic method of HBV-related hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (1), 55-62 (2009).</li><li>Goldsmith, J. O., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+bacterial+photosynthetic+reaction+centers+with+an+engineered+poly-histidine+tag.">Rapid isolation of bacterial photosynthetic reaction centers with an engineered poly-histidine tag.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1276 (3), 171-175 (1996).</li><li>Guergova-Kuras, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+one-step+purification+of+a+fully+active+polyhistidine-tagged+cytochrome+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides.">Expression and one-step purification of a fully active polyhistidine-tagged cytochrome bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides.</a> Protein Expression and Purification. 15 (3), 370-380 (1999).</li><li>Mitchell, D. M., Gennis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+wildtype+and+mutant+cytochrome+c+oxidase+from+Rhodobacter+sphaeroides+by+Ni(2+)-NTA+affinity+chromatography.">Rapid purification of wildtype and mutant cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides by Ni(2+)-NTA affinity chromatography.</a> FEBS Letters. 368 (1), 148-150 (1995).</li><li>Tian, H., White, S., Yu, L., Yu, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+head+domain+movement+of+the+rieske+iron-sulfur+protein+in+electron+transfer+reaction+of+the+cytochrome+bc1+complex.">Evidence for the head domain movement of the rieske iron-sulfur protein in electron transfer reaction of the cytochrome bc1 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (11), 7146-7152 (1999).</li><li>Tian, H., Yu, L., Mather, M. W., Yu, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexibility+of+the+neck+region+of+the+rieske+iron-sulfur+protein+is+functionally+important+in+the+cytochrome+bc1+complex.">Flexibility of the neck region of the rieske iron-sulfur protein is functionally important in the cytochrome bc1 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (43), 27953-27959 (1998).</li><li>Louie, A. Y., Meade, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+complexes+as+enzyme+inhibitors.">Metal complexes as enzyme inhibitors.</a> Chemical Reviews. 99 (9), 2711-2734 (1999).</li><li>Tam&#225;s, M. J., Sharma, S. K., Ibstedt, S., Jacobson, T., Christen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heavy+Metals+and+Metalloids+As+a+Cause+for+Protein+Misfolding+and+Aggregation.">Heavy Metals and Metalloids As a Cause for Protein Misfolding and Aggregation.</a> Biomolecules. 4 (1), 252-267 (2014).</li><li>Gerencser, L., Maroti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retardation+of+proton+transfer+caused+by+binding+of+the+transition+metal+ion+to+the+bacterial+reaction+center+is+due+to+pKa+shifts+of+key+protonatable+residues.">Retardation of proton transfer caused by binding of the transition metal ion to the bacterial reaction center is due to pKa shifts of key protonatable residues.</a> Biochemistry. 40 (6), 1850-1860 (2001).</li><li>Klishin, S. S., Junge, W., Mulkidjanian, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash-induced+turnover+of+the+cytochrome+bc1+complex+in+chromatophores+of+Rhodobacter+capsulatus:+binding+of+Zn2++decelerates+likewise+the+oxidation+of+cytochrome+b,+the+reduction+of+cytochrome+c1+and+the+voltage+generation.">Flash-induced turnover of the cytochrome bc1 complex in chromatophores of Rhodobacter capsulatus: binding of Zn2+ decelerates likewise the oxidation of cytochrome b, the reduction of cytochrome c1 and the voltage generation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1553 (3), 177-182 (2002).</li><li>Link, T. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+ions+inhibit+the+QP+center+of+bovine+heart+mitochondrial+bc1+complex+by+blocking+a+protonatable+group.">Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bc1 complex by blocking a protonatable group.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (42), 25001-25006 (1995).</li><li>Block, H., Kubicek, J., Labahn, J., Roth, U., Sch&#228;fer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+comprehensive+quality+control+of+recombinant+human+Interleukin-1beta:+a+case+study+for+a+process+development+strategy.">Production and comprehensive quality control of recombinant human Interleukin-1beta: a case study for a process development strategy.</a> Protein Expression and Purification. 57 (2), 244-254 (2008).</li><li>Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+imidazole+to+the+heme+of+cytochrome+c1+and+inhibition+of+the+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides:+II.+Kinetics+and+mechanism+of+binding.">Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: II. Kinetics and mechanism of binding.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22522-22531 (2010).</li><li>Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+imidazole+to+the+heme+of+cytochrome+c1+and+inhibition+of+the+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides:+I.+Equilibrium+and+modeling+studies.">Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: I. Equilibrium and modeling studies.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22513-22521 (2010).</li><li>Bornhorst, J. A., Falke, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins+using+polyhistidine+affinity+tags.">Purification of proteins using polyhistidine affinity tags.</a> Methods in Enzymology. 326, 245-254 (2000).</li><li>Kokhan, O., Marzolf, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+transition+metal+leaching+in+metal+affinity+chromatography+with+hydroxynaphthol+blue.">Detection and quantification of transition metal leaching in metal affinity chromatography with hydroxynaphthol blue.</a> Analytical Biochemistry. 582, 113347 (2019).</li><li>Doyle, C., Naser, D., Bauman, H., Rumfeldt, J., Meiering, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+method+for+simultaneous+measurement+of+zinc+and+copper+in+metalloproteins+using+4-(2-pyridylazo)resorcinol.">Spectrophotometric method for simultaneous measurement of zinc and copper in metalloproteins using 4-(2-pyridylazo)resorcinol.</a> Analytical Biochemistry. 579, 44-56 (2019).</li><li>Furrer, J., Smith, G. S., Therrien, B., Gasser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inorganic Chemical Biology. , (2014).</li><li>Hogeling, S. M., Cox, M. T., Bradshaw, R. M., Smith, D. P., Duckett, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+proteins+in+whole+blood,+plasma+and+DBS,+with+element-labelled+antibody+detection+by+ICP-MS.">Quantification of proteins in whole blood, plasma and DBS, with element-labelled antibody detection by ICP-MS.</a> Analytical Biochemistry. 575, 10-16 (2019).</li><li>Yamasaki, S., Tsumura, A., Takaku, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultratrace+Elements+in+Terrestrial+Water+as+Determined+by+High-Resolution+ICP-MS.">Ultratrace Elements in Terrestrial Water as Determined by High-Resolution ICP-MS.</a> Microchemical Journal. 49 (2), 305-318 (1994).</li><li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+Formation+Between+Hydroxy+Naphthol+Blue+and+First+Row+Transition+Metal+Cyanide+Complexes.">Complex Formation Between Hydroxy Naphthol Blue and First Row Transition Metal Cyanide Complexes.</a> Analytical Letters. 10 (13), 1105-1113 (1977).</li><li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Transition+Metal+Ions+by+the+Calcium+Indicator+Hydroxy+Naphthol+Blue.">Binding of Transition Metal Ions by the Calcium Indicator Hydroxy Naphthol Blue.</a> Analytical Letters. 11 (4), 355-362 (1978).</li><li>Temel, N. K., Sertakan, K., G&#252;rkan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preconcentration+and+Determination+of+Trace+Nickel+and+Cobalt+in+Milk-Based+Samples+by+Ultrasound-Assisted+Cloud+Point+Extraction+Coupled+with+Flame+Atomic+Absorption+Spectrometry.">Preconcentration and Determination of Trace Nickel and Cobalt in Milk-Based Samples by Ultrasound-Assisted Cloud Point Extraction Coupled with Flame Atomic Absorption Spectrometry.</a> Biological Trace Element Research. 186 (2), 597-607 (2018).</li><li>Ferreira, S. L. C., Santos, B. F., de Andrade, J. B., Costa, A. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+derivative+spectrophotometric+determination+of+nickel+with+hydroxynaphthol+blue.">Spectrophotometric and derivative spectrophotometric determination of nickel with hydroxynaphthol blue.</a> Microchimica Acta. 122 (1), 109-115 (1996).</li><li>Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Self-Assembly+of+Monodisperse+Phospholipid+Bilayer+Nanodiscs+with+Controlled+Size.">Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (11), 3477-3487 (2004).</li><li>Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+extended+membrane+scaffold+proteins+for+self-assembly+of+soluble+nanoscale+lipid+bilayers.">Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 23 (11), 843-848 (2010).</li><li>Bonta, M., Hegedus, B., Limbeck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+dried-droplets+deposited+on+pre-cut+filter+paper+disks+for+quantitative+LA-ICP-MS+imaging+of+biologically+relevant+minor+and+trace+elements+in+tissue+samples.">Application of dried-droplets deposited on pre-cut filter paper disks for quantitative LA-ICP-MS imaging of biologically relevant minor and trace elements in tissue samples.</a> Analytica Chimica Acta. 908, 54-62 (2016).</li><li>Olmedo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+method+to+quantify+chromium,+cadmium,+manganese,+nickel+and+lead+in+human+whole+blood,+urine,+saliva+and+hair+samples+by+electrothermal+atomic+absorption+spectrometry.">Validation of a method to quantify chromium, cadmium, manganese, nickel and lead in human whole blood, urine, saliva and hair samples by electrothermal atomic absorption spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 659 (1), 60-67 (2010).</li><li>Shyamal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Selective+Turn-On+Fluorogenic+Chemosensor+for+Robust+Quantification+of+Zn(II)+Based+on+Aggregation+Induced+Emission+Enhancement+Feature.">Highly Selective Turn-On Fluorogenic Chemosensor for Robust Quantification of Zn(II) Based on Aggregation Induced Emission Enhancement Feature.</a> ACS Sensors. 1 (6), 739-747 (2016).</li><li>Kudo, H., Yamada, K., Watanabe, D., Suzuki, K., Citterio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-Based+Analytical+Device+for+Zinc+Ion+Quantification+in+Water+Samples+with+Power-Free+Analyte+Concentration.">Paper-Based Analytical Device for Zinc Ion Quantification in Water Samples with Power-Free Analyte Concentration.</a> Micromachines. 8 (4), 127 (2017).</li><li>Liu, R., Zhang, P., Li, H., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-cloth+integrated+with+gravity/capillary+flow+chemiluminescence+(GCF-CL):+towards+simple,+inexpensive,+portable,+flow+system+for+measuring+trivalent+chromium+in+water.">Lab-on-cloth integrated with gravity/capillary flow chemiluminescence (GCF-CL): towards simple, inexpensive, portable, flow system for measuring trivalent chromium in water.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 236 (C), 35-43 (2016).</li></ol>

Колориметрическое обнаружение металлов с помощью HNB обеспечивает простой способ количественной оценки степени загрязнения белка переходными ионами металла из ресинов IMAC. Как мы установили в Ref. 20, Ni2' связывается с HNB с 1:1 stoichiometry и постоянной диссоциации для ni-HNB комплексных измене...

С момента своего создания Порат и коллег1, обездвиженный хроматографии сродства металла (IMAC) стал методом выбора, чтобы быстро отделить белки на основе их способности связываться с переходными ионами металла, такими как «n2», Ni2 ,Cu2 »,и Co2 . Это чаще всего делается с помощью инженерии поли-гистидин теги и в настоящее время является одним из наиболее распространенных методов хроматографической очистки для изоляции рекомбинантных белков2. IMAC также нашел применения за рекомбинантных белков очистки как способ изолировать хинолоны, тетрациклины, аминогликозиды, макролиды, и лактамы для анализа образца пищи3 и в качестве шага в выявлении маркеров белка сыворотки крови для печени и рака поджелудочнойжелезы4. Неудивительно, что IMAC также стал методом выбора для изоляции ряда местных ферментов биоэнергетики6,7,8,9,10. Однако успешная реализация этих методов очистки для исследований на ферментативно активных биоэнергетических белках зависит от наличия незначительного уровня металлических катионов, выщелачиваемых из колонки матрицы в элюат. Divalent металлические катионы, широко используемые в IMAC, имеют известное патологическое биологическое значение, даже при низких концентрациях11,12. Физиологический эффект этих металлов наиболее выражен в биоэнергетических системах, где они могут оказаться смертельными в качестве ингибиторов клеточного дыхания или фотосинтеза13,14,15. Подобные проблемы неизбежны для большинства белковых классов, где остаточные загрязняющие металлы могут вмешиваться в биологические функции белка или характеристики с биохимическими и биофизическими методами.
В то время как уровни загрязнения металла в условиях окисления и использования имидазола в качестве элуанта, как правило,низкие16, белковые изоляции выполняются в присутствии цистеина снижения агентов (DTT, й-меркаптоэтанол и т.д.) или с сильными хелаторами, как гистидин17,18 или этилэнедиаминироватьететраацетической кислоты (EDTA) привести к гораздо выше . Аналогичным образом, поскольку ионы металла в ясных ясниках Часто координируются карбоксильными группами, эмуции белка, выполняемые в кислых условиях, также могут иметь гораздо более высокие уровни загрязнения металла. Содержание металла в растворах можно оценить с помощью атомной спектроскопии поглощения (ААС) и индуктивно соединенных плазменно-массовой спектрометрии (ICP-MS) до предела обнаружения в диапазоне ppb-ppt21,22,23,24. К сожалению, ААС и МСП-МС не являются реальнымсредством для обнаружения в традиционной лаборатории биохимии, поскольку эти методы потребуют доступа к специализированному оборудованию и обучению.
Предыдущая работа Brittain25,26 исследовалиспользование использование гидроксинафтола синего (HNB) как способ определить наличие переходных металлов в растворе. Однако в данных20 было несколько внутренних противоречий, и эти работы не дали адекватного протокола. Исследования, проведенные Temel et al.27 и Ferreira et al.28, расширили работу Бриттена с HNB в качестве потенциального металлического индикатора. Тем не менее, Темель разработал протокол, который использует AAS для анализа выборки, используя HNB только в качестве хелатирующего агента. Изучение Ferreira использовало изменение в спектре абсорбции HNB на 563 nm, зоне спектра HNB свободного красителя HNB которое перекрывает тяжело с спектрами комплексов HNB-металла на pH 5.7, делая чувствительность анализа справедливо низка, также, как приводящ к в относительно слабом сродстве связывания металла20. Для решения проблем в нашей собственной лаборатории с Выщелачивание Ni2 "от IMAC, мы расширили работу, проделанную Brittain25,26 и Ferreria28 разработать простой анализ, способный обнаруживать наномолярные уровни нескольких переходных металлов. Мы показали, что HNB связывает никель и другие общие для IMAC металлы с субнаномоллярной связывания сродства и образуют 1:1 комплекс в широком диапазоне значений рН20. Ассаи, представленный здесь, основан на этих выводах и использует абсорбционные изменения в спектре HNB на уровне 647 нм для количественной оценки металла. Анализ может быть выполнен в физиологическом диапазоне рН с использованием общих буферов и приборов, найденных в типичной лаборатории биохимии с помощью колориметрического обнаружения и количественной оценки металлоочистительных комплексов и связанных с этим изменений в абсорбции свободного красителя, когда он связывается с металлом.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9743-500</td>
			<td>media for E.coli growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, free acid</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxynaphthol blue disoidum salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>219916-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>IB0277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, free acid</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB0360</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>T870-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of metal leaching in immobilized metal affinity chromatography

Загрязнение ферментов металлами, выщелачиваемыми из обездвиженных металлических хроматографии (IMAC), представляет собой серьезную проблему для энзимологов, так как многие из распространенных ди-и тровалентных катионов, используемых в смолах IMAC, оказывают ингибирующее воздействие на ферменты. Однако масштабы выщелачивания металла и воздействие различных элютирующих и уменьшающихся реагентов плохо понимаются в значительной степени из-за отсутствия простых и практических протоколов количественной оценки перехода, которые используют оборудование, обычно имеющееся в лаборатории биохимии. Для решения этой проблемы мы разработали протокол для быстрой количественной оценки количества загрязнения металлом в образцах, подготовленных с использованием IMAC в качестве шага очистки. Метод использует гидроксинафтоль синий (HNB) в качестве колориметрического индикатора содержания металлических катионов в выборочном растворе и спектроскопии УФ-Виз как средство количественной оценки количества присутствуютх металла в наномолярном диапазоне, основанном на изменении спектра HNB на уровне 647 нм. В то время как содержание металла в растворе исторически определялось с помощью атомной спектроскопии поглощения или индуктивно соединенных плазменных методов, эти методы требуют специализированного оборудования и обучения вне сферы действия типичной лаборатории биохимии. Предложенный здесь метод обеспечивает простой и быстрый способ для биохимиков определить содержание металла образцов с использованием существующего оборудования и знаний без ущерба для точности.

Спектр свободного HNB при нейтральном рН (черная линия) и репрезентативные спектры фракций, анализированных для Ni2 "от изоляции MSP1E3D129 показаны на рисунке 2. Успешная серия асса должна продемонстрировать снижение абсорбции на 647 нм по сравнению с контрол?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography at JoVE.com

Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography

Мы представляем асссдля для легкой количественной оценки металлов, введенных в образцы, подготовленные с использованием иммобилизованной хроматографии сродства металла. Метод использует гидроксинафтоль синий в качестве индикатора колориметрического металла и УФ-Vis спектрофотометра в качестве детектора.

Количественная оценка металлоизмов в иммобилизованной хроматографии сродства металла

Contamination of enzymes with metals leached from immobilized metal affinity chromatography (IMAC) columns poses a major concern for enzymologists, as ...

Наш метод имеет важное значение, так как позволяет среднему биохимику быстро определить, загрязнены ли образцы, изолированные с помощью иммобилизованной хроматографии сродства металла, переходными металлами. Основным преимуществом является легкость, с помощью которой анализ может быть выполнен. Анализ использует приборы и методы, общие для большинства биохимических лабораторий, и он может быть легко и быстро реализован.В то время как в этой статье мы применяем этот метод для образцов, изолированных с колонкой никель-NTA, метод может быть использован с любой другой смолы сродства металла. Впервые пользователи должны попробовать этот метод с никелевое решение запасов известной концентрации. Это позволит ознакомить их с рабочим процессом, цветами образцов и смолами, показанным в спектральных изменениях.Демонстрацией процедуры будет Коул Суэйн, техник из моей лаборатории. Для начала включите и разогреете спектрофотометр UV-Vis. Определите фракции хроматографии, которые будут просасываться с помощью диодного массива УФ-vis спектрофотометр с оптическим абсорбционом на 280 нанометров для количественной оценки белка.Получить от 10 до 100 миллимоляров буфер выборки с PH между 7 и 12, таких как Tris, HEPES, MOPS, и фосфатный буфер. Подготовь 12%-вес по объему раствор дисперсии HNB в буфере выборки с использованием 120 миллиграммов реагента HNB для каждого подготовленного миллилитра запасного раствора. Установите спектрофотометр для сбора данных на 647 нанометров.Используйте кварцевый кювет, наполненный буфером образца, чтобы очистить спектрофотометр. Подготовье контрольного раствора в кювете, содержащем 50 микролитров запасов HNB на миллилитр общего объема анализа. Разрешить контроль инкубировать в течение как минимум трех минут при комнатной температуре.Измерьте и замитьте абсорбанс на 647 нанометров для контрольного образца. Подготовь анализ образцов, смешивая 150 микролитров запасов HNB с 2850 микролитров надлежащим образом разбавленных белковых фракций с буфером образца. Разрешить инкубации образца в течение как минимум трех минут при комнатной температуре.Повторите запись спектра для каждой фракции, которая будет измерена. В случае недостаточного разбавления вся спектральная полоса на 647 нанометров исчезла. Хотя при слишком сильном разбавлении образец неотличим от управления.Чтобы определить концентрацию металла в каждом образце, сначала найдите разницу в поглощении каждого образца на 647 нанометров от контроля HNB. Определите концентрацию металла в микромоларе, используя формулу, где DF является фактором разбавления для фракции анализа, дельта A-B-S 647 является изменением абсорбции на 647 нанометров, 3,65 раза 10 к отрицательному 2 представляет собой коэффициент вымирания HNB, и l является оптическим путем cuvette в сантиметрах. В этом исследовании показан спектр свободного HNB при нейтральном PH в репрезентативных спектрах фракций, анализированных на ион никеля из изоляции MSP1E3D1.Наблюдалось снижение абсорбции на 647 нанометров по сравнению с контролем HNB, что соответствовало образованию комплексов HNB при наличии переходного металла. Чтобы продемонстрировать применение этого анализа, были проанализированы два его помеченных мембранных леса белков, MSP1E3D1, MSP2N2, и роман, три-гем, c-типа цитохром GSU0105, от геобактерий серы, были проанализированы. Содержание белка и никеля в каждой фракции для GSU0105 было значительно сдвинуто друг от друга, в то время как фракции для MSP1E3D1 и MSP2N2, которые содержали наибольшее количество белка, также имели самое высокое содержание никеля.Иллюстрируется также, что содержание металла не может быть равномерно распределено между фракциями, собранными с помощью мобилизованной металлоконструкций хроматографии. Наиболее важно адекватно и последовательно смешивать пробел во всех образцах и обеспечить равное время инкубации для пробела во всех образцах. Белковые фракции, представляющие особый интерес, могут быть дополнительно проанализированы с помощью атомной спектрометрии поглощения или ICPMS для подтверждения загрязнения металла и для проверки на хелатированные или сильно связанные ионы белкового металла.Помимо обнаружения выщелачивания переходного металла, этот метод может быть использован для измерения связывающих сродства при переходе металлических ионов к белкам. HNB и любой никель, присутствующий в образцах, являются раздражителями для глаз и кожи соответственно. Стандартный СИЗ, включая перчатки и защиту глаз, следует использовать во время метода.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Periodic Properties of the Elements

SCIENTISTS IN ACTION

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

Противоопухолевые комплексы металлов: синтез и цитотоксичности оценка по методу МТТ-анализ

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Синтеза и характеристики функционализированным Металл-органические каркасы

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Радиоактивной и Количественная клеточном уровнях фосфоинозитидов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании-Flow мерцаний

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Synthesis of a Water-soluble Metal&#8211;Organic Complex Array

Synthesis of a Water-soluble MetalÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œOrganic Complex Array

Синтез растворимой в воде металлоорганические сложный комплекс

We demonstrate a method for the synthesis of a water-soluble multimetallic peptidic array containing a predetermined sequence of metal centers such as ...

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

На месте Выявление и количественная оценка одноклеточного наночастиц оксидов металлов, с использованием ядерных рентгенофлуоресцентного анализа

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

Лиганд опосредованной зарождения и роста наночастиц металла палладия

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Surface Functionalization of Metal-Organic Frameworks for Improved Moisture Resistance

Функционализация поверхности металлоорганических рамок для улучшения влагостойкости

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. ...

Electrophoretic Crystallization of Ultrathin High-performance Metal-organic Framework Membranes

Электрофоретическая кристаллизации ультратонкий высокопроизводительный металлоорганических Framework мембран

We report the synthesis of thin, highly intergrown, polycrystalline metal-organic framework (MOF) membranes on a wide range of unmodified porous and ...

Molten-Salt Synthesis of Complex Metal Oxide Nanoparticles

Расплавленной соли синтеза наночастиц сложных оксидов металлов

The development of feasible synthesis methods is critical for the successful exploration of novel properties and potential applications of nanomaterials. ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Ионная мобильность-массовая спектрометрия Методы для определения структуры и механизмов распознавания ионов металла и Redox деятельности металлических связывая олигопептиды