Name: quantification of metal leaching in immobilized metal affinity chromatography
Uploaded: 2020-01-17T16:00:00
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Este material se basa en el trabajo apoyado por la National Science Foundation bajo Grant MCB-1817448 y por un premio de Thomas F. y Kate Miller Jeffress Memorial Trust, Bank of America, Trustee y donante especificado Hazel Thorpe Carman y George Gay Carman Confianza.

1. Preparación de componentes de ensayo
<ol><li>Determinar las fracciones de cromatografía que se deben ensayo utilizando absorbancia óptica a 280 nm o métodos alternativos de cuantificación de proteínas para identificar las fracciones enriquecidas con proteínas. NOTA: Para este trabajo, utilizamos un espectrofotómetro UV-Vis de matriz de diodos. Para aumentar el rendimiento, se puede utilizar un lector de placas capaz de medir la absorbancia UV-Vis.</li>
	<li>Preparación de los componentes de ensayo necesa...

<ol>
	<li>Porath, J., Carlsson, J. A. N., Olsson, I., Belfrage, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).</li><li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized-Metal+Affinity+Chromatography+(IMAC):+A+Review.">Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review.</a> Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).</li><li>Takeda, N., Matsuoka, T., Gotoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiality+of+IMAC+as+sample+pretreatment+tool+in+food+analysis+for+veterinary+drugs.">Potentiality of IMAC as sample pretreatment tool in food analysis for veterinary drugs.</a> Chromatographia. 72 (1/2), 127-131 (2010).</li><li>Felix, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+serum+proteins+involved+in+pancreatic+cancer+cachexia.">Identification of serum proteins involved in pancreatic cancer cachexia.</a> Life sciences. 88 (5-6), 218-225 (2011).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+enhanced+laser+desorption/ionization+profiling:+New+diagnostic+method+of+HBV-related+hepatocellular+carcinoma.">Surface enhanced laser desorption/ionization profiling: New diagnostic method of HBV-related hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (1), 55-62 (2009).</li><li>Goldsmith, J. O., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+bacterial+photosynthetic+reaction+centers+with+an+engineered+poly-histidine+tag.">Rapid isolation of bacterial photosynthetic reaction centers with an engineered poly-histidine tag.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1276 (3), 171-175 (1996).</li><li>Guergova-Kuras, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+one-step+purification+of+a+fully+active+polyhistidine-tagged+cytochrome+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides.">Expression and one-step purification of a fully active polyhistidine-tagged cytochrome bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides.</a> Protein Expression and Purification. 15 (3), 370-380 (1999).</li><li>Mitchell, D. M., Gennis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+wildtype+and+mutant+cytochrome+c+oxidase+from+Rhodobacter+sphaeroides+by+Ni(2+)-NTA+affinity+chromatography.">Rapid purification of wildtype and mutant cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides by Ni(2+)-NTA affinity chromatography.</a> FEBS Letters. 368 (1), 148-150 (1995).</li><li>Tian, H., White, S., Yu, L., Yu, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+head+domain+movement+of+the+rieske+iron-sulfur+protein+in+electron+transfer+reaction+of+the+cytochrome+bc1+complex.">Evidence for the head domain movement of the rieske iron-sulfur protein in electron transfer reaction of the cytochrome bc1 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (11), 7146-7152 (1999).</li><li>Tian, H., Yu, L., Mather, M. W., Yu, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexibility+of+the+neck+region+of+the+rieske+iron-sulfur+protein+is+functionally+important+in+the+cytochrome+bc1+complex.">Flexibility of the neck region of the rieske iron-sulfur protein is functionally important in the cytochrome bc1 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (43), 27953-27959 (1998).</li><li>Louie, A. Y., Meade, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+complexes+as+enzyme+inhibitors.">Metal complexes as enzyme inhibitors.</a> Chemical Reviews. 99 (9), 2711-2734 (1999).</li><li>Tam&#225;s, M. J., Sharma, S. K., Ibstedt, S., Jacobson, T., Christen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heavy+Metals+and+Metalloids+As+a+Cause+for+Protein+Misfolding+and+Aggregation.">Heavy Metals and Metalloids As a Cause for Protein Misfolding and Aggregation.</a> Biomolecules. 4 (1), 252-267 (2014).</li><li>Gerencser, L., Maroti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retardation+of+proton+transfer+caused+by+binding+of+the+transition+metal+ion+to+the+bacterial+reaction+center+is+due+to+pKa+shifts+of+key+protonatable+residues.">Retardation of proton transfer caused by binding of the transition metal ion to the bacterial reaction center is due to pKa shifts of key protonatable residues.</a> Biochemistry. 40 (6), 1850-1860 (2001).</li><li>Klishin, S. S., Junge, W., Mulkidjanian, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash-induced+turnover+of+the+cytochrome+bc1+complex+in+chromatophores+of+Rhodobacter+capsulatus:+binding+of+Zn2++decelerates+likewise+the+oxidation+of+cytochrome+b,+the+reduction+of+cytochrome+c1+and+the+voltage+generation.">Flash-induced turnover of the cytochrome bc1 complex in chromatophores of Rhodobacter capsulatus: binding of Zn2+ decelerates likewise the oxidation of cytochrome b, the reduction of cytochrome c1 and the voltage generation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1553 (3), 177-182 (2002).</li><li>Link, T. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+ions+inhibit+the+QP+center+of+bovine+heart+mitochondrial+bc1+complex+by+blocking+a+protonatable+group.">Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bc1 complex by blocking a protonatable group.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (42), 25001-25006 (1995).</li><li>Block, H., Kubicek, J., Labahn, J., Roth, U., Sch&#228;fer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+comprehensive+quality+control+of+recombinant+human+Interleukin-1beta:+a+case+study+for+a+process+development+strategy.">Production and comprehensive quality control of recombinant human Interleukin-1beta: a case study for a process development strategy.</a> Protein Expression and Purification. 57 (2), 244-254 (2008).</li><li>Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+imidazole+to+the+heme+of+cytochrome+c1+and+inhibition+of+the+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides:+II.+Kinetics+and+mechanism+of+binding.">Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: II. Kinetics and mechanism of binding.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22522-22531 (2010).</li><li>Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+imidazole+to+the+heme+of+cytochrome+c1+and+inhibition+of+the+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides:+I.+Equilibrium+and+modeling+studies.">Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: I. Equilibrium and modeling studies.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22513-22521 (2010).</li><li>Bornhorst, J. A., Falke, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins+using+polyhistidine+affinity+tags.">Purification of proteins using polyhistidine affinity tags.</a> Methods in Enzymology. 326, 245-254 (2000).</li><li>Kokhan, O., Marzolf, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+transition+metal+leaching+in+metal+affinity+chromatography+with+hydroxynaphthol+blue.">Detection and quantification of transition metal leaching in metal affinity chromatography with hydroxynaphthol blue.</a> Analytical Biochemistry. 582, 113347 (2019).</li><li>Doyle, C., Naser, D., Bauman, H., Rumfeldt, J., Meiering, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+method+for+simultaneous+measurement+of+zinc+and+copper+in+metalloproteins+using+4-(2-pyridylazo)resorcinol.">Spectrophotometric method for simultaneous measurement of zinc and copper in metalloproteins using 4-(2-pyridylazo)resorcinol.</a> Analytical Biochemistry. 579, 44-56 (2019).</li><li>Furrer, J., Smith, G. S., Therrien, B., Gasser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inorganic Chemical Biology. , (2014).</li><li>Hogeling, S. M., Cox, M. T., Bradshaw, R. M., Smith, D. P., Duckett, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+proteins+in+whole+blood,+plasma+and+DBS,+with+element-labelled+antibody+detection+by+ICP-MS.">Quantification of proteins in whole blood, plasma and DBS, with element-labelled antibody detection by ICP-MS.</a> Analytical Biochemistry. 575, 10-16 (2019).</li><li>Yamasaki, S., Tsumura, A., Takaku, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultratrace+Elements+in+Terrestrial+Water+as+Determined+by+High-Resolution+ICP-MS.">Ultratrace Elements in Terrestrial Water as Determined by High-Resolution ICP-MS.</a> Microchemical Journal. 49 (2), 305-318 (1994).</li><li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+Formation+Between+Hydroxy+Naphthol+Blue+and+First+Row+Transition+Metal+Cyanide+Complexes.">Complex Formation Between Hydroxy Naphthol Blue and First Row Transition Metal Cyanide Complexes.</a> Analytical Letters. 10 (13), 1105-1113 (1977).</li><li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Transition+Metal+Ions+by+the+Calcium+Indicator+Hydroxy+Naphthol+Blue.">Binding of Transition Metal Ions by the Calcium Indicator Hydroxy Naphthol Blue.</a> Analytical Letters. 11 (4), 355-362 (1978).</li><li>Temel, N. K., Sertakan, K., G&#252;rkan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preconcentration+and+Determination+of+Trace+Nickel+and+Cobalt+in+Milk-Based+Samples+by+Ultrasound-Assisted+Cloud+Point+Extraction+Coupled+with+Flame+Atomic+Absorption+Spectrometry.">Preconcentration and Determination of Trace Nickel and Cobalt in Milk-Based Samples by Ultrasound-Assisted Cloud Point Extraction Coupled with Flame Atomic Absorption Spectrometry.</a> Biological Trace Element Research. 186 (2), 597-607 (2018).</li><li>Ferreira, S. L. C., Santos, B. F., de Andrade, J. B., Costa, A. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+derivative+spectrophotometric+determination+of+nickel+with+hydroxynaphthol+blue.">Spectrophotometric and derivative spectrophotometric determination of nickel with hydroxynaphthol blue.</a> Microchimica Acta. 122 (1), 109-115 (1996).</li><li>Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Self-Assembly+of+Monodisperse+Phospholipid+Bilayer+Nanodiscs+with+Controlled+Size.">Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (11), 3477-3487 (2004).</li><li>Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+extended+membrane+scaffold+proteins+for+self-assembly+of+soluble+nanoscale+lipid+bilayers.">Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 23 (11), 843-848 (2010).</li><li>Bonta, M., Hegedus, B., Limbeck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+dried-droplets+deposited+on+pre-cut+filter+paper+disks+for+quantitative+LA-ICP-MS+imaging+of+biologically+relevant+minor+and+trace+elements+in+tissue+samples.">Application of dried-droplets deposited on pre-cut filter paper disks for quantitative LA-ICP-MS imaging of biologically relevant minor and trace elements in tissue samples.</a> Analytica Chimica Acta. 908, 54-62 (2016).</li><li>Olmedo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+method+to+quantify+chromium,+cadmium,+manganese,+nickel+and+lead+in+human+whole+blood,+urine,+saliva+and+hair+samples+by+electrothermal+atomic+absorption+spectrometry.">Validation of a method to quantify chromium, cadmium, manganese, nickel and lead in human whole blood, urine, saliva and hair samples by electrothermal atomic absorption spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 659 (1), 60-67 (2010).</li><li>Shyamal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Selective+Turn-On+Fluorogenic+Chemosensor+for+Robust+Quantification+of+Zn(II)+Based+on+Aggregation+Induced+Emission+Enhancement+Feature.">Highly Selective Turn-On Fluorogenic Chemosensor for Robust Quantification of Zn(II) Based on Aggregation Induced Emission Enhancement Feature.</a> ACS Sensors. 1 (6), 739-747 (2016).</li><li>Kudo, H., Yamada, K., Watanabe, D., Suzuki, K., Citterio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-Based+Analytical+Device+for+Zinc+Ion+Quantification+in+Water+Samples+with+Power-Free+Analyte+Concentration.">Paper-Based Analytical Device for Zinc Ion Quantification in Water Samples with Power-Free Analyte Concentration.</a> Micromachines. 8 (4), 127 (2017).</li><li>Liu, R., Zhang, P., Li, H., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-cloth+integrated+with+gravity/capillary+flow+chemiluminescence+(GCF-CL):+towards+simple,+inexpensive,+portable,+flow+system+for+measuring+trivalent+chromium+in+water.">Lab-on-cloth integrated with gravity/capillary flow chemiluminescence (GCF-CL): towards simple, inexpensive, portable, flow system for measuring trivalent chromium in water.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 236 (C), 35-43 (2016).</li></ol>

La detección colorimétrica de metales mediante HNB proporciona una forma sencilla de cuantificar el grado de contaminación de proteínas mediante la transición de iones metálicos de resinas IMAC. Como establecimos en la Ref. 20, Ni2+ se une a HNB con estequiometría 1:1 y la constante de disociación para los cambios complejos de Ni-HNB con pH. Sin embargo, el complejo Kd está en el rango sub-nM para todos los valores de pH recomendados (7-12). En términos prácticos, significa que todos los ...

Desde sus inicios por Porath y sus compañeros de trabajo1, la cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) se ha convertido en un método de elección para separar rápidamente las proteínas en función de su capacidad de unirse con iones metálicos de transición como Zn2+,Ni2+,Cu2+y Co2+. Esto se hace más comúnmente a través de etiquetas de polihistidina de ingeniería y ahora es una de las técnicas de purificación cromatográfica más comunes para el aislamiento de proteínas recombinantes2. IMAC también ha encontrado aplicaciones más allá de la purificación de proteínas recombinantes como una forma de aislar quinolonas, tetraciclinas, aminoglucósidos, macrólidos y lactams para el análisis de muestras de alimentos3 y como un paso en la identificación de marcadores de proteínas de suero sanguíneo para cánceres de hígado y páncreas4,5. No es de extrañar que IMAC también se haya convertido en un método de elección para el aislamiento de una serie de enzimas bioenergéticas nativas6,7,8,9,10. Sin embargo, la implementación exitosa de estos métodos de purificación para estudios sobre proteínas bioenergéticas enzimáticamente activas depende de la presencia de niveles insignificantes de cationes metálicos lixiviados de la matriz de columna en el eluido. Los cationes metálicos divalentes comúnmente utilizados en IMAC han conocido significación biológica patológica, incluso a bajas concentraciones11,12. El efecto fisiológico de estos metales es más pronunciado en los sistemas bioenergéticos, donde pueden resultar letales como inhibidores de la respiración celular o fotosíntesis13,14,15. Problemas similares son inevitables para la mayoría de las clases de proteínas donde los metales contaminantes residuales pueden interferir con las funciones biológicas de una proteína o la caracterización con técnicas bioquímicas y biofísicas.
Mientras que los niveles de contaminación de metales en condiciones oxidantes y el uso de imidazol como eluyente son típicamentebajos16, los aislamientos proteicos realizados en presencia de agentes reductores de cisteína (TDT, é-mercaptoetanol, etc.) o con queladores más fuertes como la histidina17,18 o ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) dan como resultado niveles mucho más altos de contaminación metálica19. Del mismo modo, dado que los iones metálicos en las resinas IMAC son frecuentemente coordinados por grupos carboxílicos, también es probable que las eluciones de proteínas realizadas en condiciones ácidas tengan niveles mucho más altos de contaminación metálica. El contenido de metal en soluciones se puede evaluar utilizando espectroscopía de absorción atómica (AAS) y espectrometría de masas plasmáticas acopladas inductivamente (ICP-MS) hasta un límite de detección en el rango ppb-ppt21,22,23,24. Desafortunadamente, AAS y ICP-MS no son medios realistas para la detección en un laboratorio de bioquímica tradicional, ya que esos métodos requerirían acceso a equipos especializados y capacitación.
Trabajo anterior de Brittain25,26 investigó el uso de azul hidroxinaphthol (HNB) como una manera de identificar la presencia de metales de transición en solución. Sin embargo, hubo varias contradicciones internas en los datos20 y esas obras no ofrecieron un protocolo adecuado. 27 y Ferreira et al.28 ampliaron el trabajo de Brittain con HNB como un indicador de metal potencial. Sin embargo, Temel desarrolló un protocolo que hace uso de AAS para el análisis de muestras, utilizando HNB sólo como agente quelante. El estudio de Ferreira utilizó el cambio en los espectros de absorbancia HNB a 563 nm, una región de los espectros HNB de tinte libre que se superpone en gran medida con los espectros de complejos de metal HNB a pH 5.7, haciendo que la sensibilidad del ensayo sea bastante baja, así como dando como resultado una afinidad de unión de metales relativamente débil20. Para abordar problemas en nuestro propio laboratorio con Ni2+ lixiviación de IMAC, hemos ampliado el trabajo realizado por Brittain25,26 y Ferreria28 para desarrollar un ensayo fácil capaz de detectar niveles nanomolares de varios metales de transición. Mostramos que HNB une níquel y otros comunes para los metales IMAC con afinidades de unión sub-nanomolar y forma 1:1 complejo en una amplia gama de valores de pH20. El ensayo aquí indicado se basa en estos hallazgos y utiliza cambios de absorbancia en el espectro HNB a 647 nm para la cuantificación de metales. El ensayo se puede realizar en el rango de pH fisiológico utilizando tampones e instrumentación comunes que se encuentran en un laboratorio de bioquímica típico mediante la detección colorimétrica y cuantificación de complejos de tinte metálico y el cambio asociado en la absorbancia del tinte libre cuando se une al metal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9743-500</td>
			<td>media for E.coli growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, free acid</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxynaphthol blue disoidum salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>219916-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>IB0277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, free acid</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB0360</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>T870-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of metal leaching in immobilized metal affinity chromatography

La contaminación de enzimas con metales lixiviados a partir de columnas de cromatografía de afinidad de metales inmovilizadas (IMAC) plantea una preocupación importante para los enzimólogos, ya que muchos de los cationes di y trivalentes comunes utilizados en las resinas IMAC tienen un efecto inhibitorio sobre las enzimas. Sin embargo, el alcance de la lixiviación de metales y el impacto de varios reactivos de elución y reducción se entienden mal en gran parte debido a la ausencia de protocolos de cuantificación de metales de transición simples y prácticos que utilizan equipos típicamente disponibles en laboratorios de bioquímica. Para abordar este problema, hemos desarrollado un protocolo para cuantificar rápidamente la cantidad de contaminación metálica en muestras preparadas utilizando IMAC como paso de purificación. El método utiliza el azul hidroxinaphthol (HNB) como indicador colorimétrico para el contenido de catión de metal en una solución de muestra y la espectroscopia UV-Vis como medio para cuantificar la cantidad de metal presente, en el rango nanomolar, basado en el cambio en el espectro HNB a 647 nm. Mientras que el contenido de metal en una solución se ha determinado históricamente utilizando espectroscopia de absorción atómica o técnicas de plasma acoplado inductivamente, estos métodos requieren equipos especializados y entrenamiento fuera del alcance de un laboratorio de bioquímica típico. El método propuesto aquí proporciona una manera sencilla y rápida para que los bioquímicos determinen el contenido de metal de las muestras utilizando el equipo y el conocimiento existentes sin sacrificar la precisión.

El espectro de HNB libre a pH neutro (línea negra) y espectros representativos de fracciones saysaying para Ni2+ desde el aislamiento de MSP1E3D129 se muestran en la Figura 2. Una serie de ensayos exitosa debe demostrar una disminución de la absorbancia a 647 nm en comparación con el control HNB, que corresponde a la formación de complejos HNB en presencia de un metal de transición. Un ensayo fallido se indicaría mediante un aumento de la absorbancia ...

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Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography

Presentamos un ensayo para una fácil cuantificación de metales introducidos en muestras preparadas mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizadas. El método utiliza el azul hidroxinaphthol como indicador de metal colorimétrico y un espectrofotómetro UV-Vis como detector.

Cuantificación de la lixiviación de metal en la cromatografía de afinidad de metal inmovilizada

Contamination of enzymes with metals leached from immobilized metal affinity chromatography (IMAC) columns poses a major concern for enzymologists, as ...

Nuestro método es significativo, ya que permite al bioquímico promedio determinar rápidamente si las muestras aisladas mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizadas están contaminadas con metales de transición. La principal ventaja es la facilidad con la que se puede realizar el ensayo. El ensayo utiliza instrumentación y técnicas comunes a la mayoría de los laboratorios de bioquímica, y se puede implementar fácil y rápidamente.Mientras que en este artículo aplicamos este método para muestras aisladas con una columna de níquel-NTA, el método se puede utilizar con cualquier otra resina de afinidad de metal. Los usuarios por primera vez deben probar este método con una solución de material de níquel de concentración conocida. Esto los familiarizará con el flujo de trabajo, los colores de la muestra y las resinas que se muestran en los cambios espectrales.Demostrando el procedimiento estará Cole Swain, un técnico de mi laboratorio. Para empezar, encienda y caliente el espectrofotómetro UV-Vis. Determinar las fracciones de cromatografía a ensayo utilizando un espectrofotómetro UV-Vis de matriz de diodos con absorbancia óptica a 280 nanómetros para cuantificar la proteína.Obtenga de 10 a 100 tampón de muestra milimiolar con un PH entre 7 y 12, como Tris, HEPES, MOPS y tampón de fosfato. Preparar una solución de 12% de peso por volumen de dispersión de HNB en el tampón de muestra utilizando 120 miligramos de reactivo HNB para cada mililitro de solución de stock preparado. Establezca el espectrofotómetro para recopilar datos en 647 nanómetros.Utilice una cubeta de cuarzo llena con el búfer de muestra para dejar en blanco el espectrofotómetro. Preparar una solución de control en una cubeta que contenga 50 microlitros de HNB por mililitro del volumen total del ensayo. Deje que el control se incuba durante un mínimo de tres minutos a temperatura ambiente.Mida y registre la absorbancia en 647 nanómetros para la muestra de control. Prepare las muestras de ensayo mezclando 150 microlitros de caldo HNB con 2850 microlitros de fracciones de proteínas adecuadamente diluidas con el tampón de muestra. Dejar incubar la muestra durante un mínimo de tres minutos a temperatura ambiente.Repita la grabación de espectro para cada fracción a medir. En el caso de que no se obtenga suficiente dilución, toda la banda espectral a 647 nanómetros ha desaparecido. Mientras que con una dilución demasiado fuerte, la muestra es indistinguible del control.Para determinar la concentración de metal en cada muestra, primero encuentre la diferencia de cada absorbancia de muestra a 647 nanómetros del control HNB. Determinar la concentración de metal en micromolar utilizando la fórmula donde el DF es el factor de dilución para la fracción de ensayo, delta A-B-S 647 es el cambio de absorbancia a 647 nanómetros, 3.65 veces 10 a la negativa 2 representa el coeficiente de extinción de HNB, y l es la trayectoria óptica de la cuvette en centímetros. En este estudio, aquí se muestra el espectro de HNB libre en PH neutro en espectros representativos de fracciones ensayadas para ion de níquel del aislamiento de MSP1E3D1.Se observó una disminución de la absorbancia en 647 nanómetros en comparación con el control HNB, que correspondía a la formación de complejos HNB en presencia de un metal de transición. Para demostrar la aplicación de este ensayo, se analizaron dos proteínas de andamios de membrana etiquetadas, MSP1E3D1, MSP2N2, y un novedoso citocromo de tipo C de tres hemo, de geobacter sulfurreducens. El contenido de iones de proteína y níquel de cada fracción para GSU0105 se desplazó significativamente entre sí, mientras que las fracciones para MSP1E3D1 y MSP2N2 que contenían la mayor cantidad de proteína también tenían el mayor contenido de níquel.También se ilustra que el contenido del metal puede no distribuirse uniformemente entre las fracciones recogidas mediante una cromatografía de afinidad de metal movilizada. Es más importante mezclar adecuadamente y consistentemente el espacio en blanco en todas las muestras y permitir tiempos de incubación iguales para el espacio en blanco en todas las muestras. Las fracciones proteicas de especial interés podrían analizarse más a fondo con espectrometría de absorción atómica o ICPMS para confirmar la contaminación por metales y probar iones metálicos proteicos quelados o fuertemente unidos.Además de la detección de lixiviación de metales de transición, esta técnica se puede utilizar para medir las afines de unión en iones metálicos de transición a proteínas. HNB y cualquier níquel presente en las muestras son irritantes para los ojos y la piel respectivamente. Durante el método se debe utilizar EPI estándar, incluidos guantes y protección para los ojos.

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