Name: quantification of metal leaching in immobilized metal affinity chromatography
Uploaded: 2020-01-17T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography at JoVE.com

Detta material är baserat på arbete som stöds av National Science Foundation under Grant MCB-1817448 och av en utmärkelse från Thomas F. och Kate Miller Jeffress Memorial Trust, Bank of America, förvaltare och specificerade givare Hazel Thorpe Carman och George gay Carman Förtroende.

1. förberedelse av komponent analys
<ol><li>Bestäm vilka kromatografifraktioner som ska analyseras med optisk absorbans vid 280 nm eller alternativa metoder för proteinkvantifiering för att identifiera de proteinberikade fraktionerna. Obs: för detta arbete använde vi en diodarray UV-VIS spektrofotometer. För att öka genomströmningen kan en Plattläsare som klarar mätning av UV-VIS-absorbans användas.</li>
	<li>Beredning av nödvändiga analys komponenter<ol>
<li>Bered eller Erhåll 10-100 mM buffert ("pro...

<ol>
	<li>Porath, J., Carlsson, J. A. N., Olsson, I., Belfrage, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).</li><li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized-Metal+Affinity+Chromatography+(IMAC):+A+Review.">Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review.</a> Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).</li><li>Takeda, N., Matsuoka, T., Gotoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiality+of+IMAC+as+sample+pretreatment+tool+in+food+analysis+for+veterinary+drugs.">Potentiality of IMAC as sample pretreatment tool in food analysis for veterinary drugs.</a> Chromatographia. 72 (1/2), 127-131 (2010).</li><li>Felix, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+serum+proteins+involved+in+pancreatic+cancer+cachexia.">Identification of serum proteins involved in pancreatic cancer cachexia.</a> Life sciences. 88 (5-6), 218-225 (2011).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+enhanced+laser+desorption/ionization+profiling:+New+diagnostic+method+of+HBV-related+hepatocellular+carcinoma.">Surface enhanced laser desorption/ionization profiling: New diagnostic method of HBV-related hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (1), 55-62 (2009).</li><li>Goldsmith, J. O., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+bacterial+photosynthetic+reaction+centers+with+an+engineered+poly-histidine+tag.">Rapid isolation of bacterial photosynthetic reaction centers with an engineered poly-histidine tag.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1276 (3), 171-175 (1996).</li><li>Guergova-Kuras, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+one-step+purification+of+a+fully+active+polyhistidine-tagged+cytochrome+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides.">Expression and one-step purification of a fully active polyhistidine-tagged cytochrome bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides.</a> Protein Expression and Purification. 15 (3), 370-380 (1999).</li><li>Mitchell, D. M., Gennis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+wildtype+and+mutant+cytochrome+c+oxidase+from+Rhodobacter+sphaeroides+by+Ni(2+)-NTA+affinity+chromatography.">Rapid purification of wildtype and mutant cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides by Ni(2+)-NTA affinity chromatography.</a> FEBS Letters. 368 (1), 148-150 (1995).</li><li>Tian, H., White, S., Yu, L., Yu, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+head+domain+movement+of+the+rieske+iron-sulfur+protein+in+electron+transfer+reaction+of+the+cytochrome+bc1+complex.">Evidence for the head domain movement of the rieske iron-sulfur protein in electron transfer reaction of the cytochrome bc1 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (11), 7146-7152 (1999).</li><li>Tian, H., Yu, L., Mather, M. W., Yu, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexibility+of+the+neck+region+of+the+rieske+iron-sulfur+protein+is+functionally+important+in+the+cytochrome+bc1+complex.">Flexibility of the neck region of the rieske iron-sulfur protein is functionally important in the cytochrome bc1 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (43), 27953-27959 (1998).</li><li>Louie, A. Y., Meade, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+complexes+as+enzyme+inhibitors.">Metal complexes as enzyme inhibitors.</a> Chemical Reviews. 99 (9), 2711-2734 (1999).</li><li>Tam&#225;s, M. J., Sharma, S. K., Ibstedt, S., Jacobson, T., Christen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heavy+Metals+and+Metalloids+As+a+Cause+for+Protein+Misfolding+and+Aggregation.">Heavy Metals and Metalloids As a Cause for Protein Misfolding and Aggregation.</a> Biomolecules. 4 (1), 252-267 (2014).</li><li>Gerencser, L., Maroti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retardation+of+proton+transfer+caused+by+binding+of+the+transition+metal+ion+to+the+bacterial+reaction+center+is+due+to+pKa+shifts+of+key+protonatable+residues.">Retardation of proton transfer caused by binding of the transition metal ion to the bacterial reaction center is due to pKa shifts of key protonatable residues.</a> Biochemistry. 40 (6), 1850-1860 (2001).</li><li>Klishin, S. S., Junge, W., Mulkidjanian, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash-induced+turnover+of+the+cytochrome+bc1+complex+in+chromatophores+of+Rhodobacter+capsulatus:+binding+of+Zn2++decelerates+likewise+the+oxidation+of+cytochrome+b,+the+reduction+of+cytochrome+c1+and+the+voltage+generation.">Flash-induced turnover of the cytochrome bc1 complex in chromatophores of Rhodobacter capsulatus: binding of Zn2+ decelerates likewise the oxidation of cytochrome b, the reduction of cytochrome c1 and the voltage generation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1553 (3), 177-182 (2002).</li><li>Link, T. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+ions+inhibit+the+QP+center+of+bovine+heart+mitochondrial+bc1+complex+by+blocking+a+protonatable+group.">Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bc1 complex by blocking a protonatable group.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (42), 25001-25006 (1995).</li><li>Block, H., Kubicek, J., Labahn, J., Roth, U., Sch&#228;fer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+comprehensive+quality+control+of+recombinant+human+Interleukin-1beta:+a+case+study+for+a+process+development+strategy.">Production and comprehensive quality control of recombinant human Interleukin-1beta: a case study for a process development strategy.</a> Protein Expression and Purification. 57 (2), 244-254 (2008).</li><li>Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+imidazole+to+the+heme+of+cytochrome+c1+and+inhibition+of+the+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides:+II.+Kinetics+and+mechanism+of+binding.">Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: II. Kinetics and mechanism of binding.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22522-22531 (2010).</li><li>Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+imidazole+to+the+heme+of+cytochrome+c1+and+inhibition+of+the+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides:+I.+Equilibrium+and+modeling+studies.">Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: I. Equilibrium and modeling studies.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22513-22521 (2010).</li><li>Bornhorst, J. A., Falke, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins+using+polyhistidine+affinity+tags.">Purification of proteins using polyhistidine affinity tags.</a> Methods in Enzymology. 326, 245-254 (2000).</li><li>Kokhan, O., Marzolf, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+transition+metal+leaching+in+metal+affinity+chromatography+with+hydroxynaphthol+blue.">Detection and quantification of transition metal leaching in metal affinity chromatography with hydroxynaphthol blue.</a> Analytical Biochemistry. 582, 113347 (2019).</li><li>Doyle, C., Naser, D., Bauman, H., Rumfeldt, J., Meiering, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+method+for+simultaneous+measurement+of+zinc+and+copper+in+metalloproteins+using+4-(2-pyridylazo)resorcinol.">Spectrophotometric method for simultaneous measurement of zinc and copper in metalloproteins using 4-(2-pyridylazo)resorcinol.</a> Analytical Biochemistry. 579, 44-56 (2019).</li><li>Furrer, J., Smith, G. S., Therrien, B., Gasser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inorganic Chemical Biology. , (2014).</li><li>Hogeling, S. M., Cox, M. T., Bradshaw, R. M., Smith, D. P., Duckett, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+proteins+in+whole+blood,+plasma+and+DBS,+with+element-labelled+antibody+detection+by+ICP-MS.">Quantification of proteins in whole blood, plasma and DBS, with element-labelled antibody detection by ICP-MS.</a> Analytical Biochemistry. 575, 10-16 (2019).</li><li>Yamasaki, S., Tsumura, A., Takaku, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultratrace+Elements+in+Terrestrial+Water+as+Determined+by+High-Resolution+ICP-MS.">Ultratrace Elements in Terrestrial Water as Determined by High-Resolution ICP-MS.</a> Microchemical Journal. 49 (2), 305-318 (1994).</li><li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+Formation+Between+Hydroxy+Naphthol+Blue+and+First+Row+Transition+Metal+Cyanide+Complexes.">Complex Formation Between Hydroxy Naphthol Blue and First Row Transition Metal Cyanide Complexes.</a> Analytical Letters. 10 (13), 1105-1113 (1977).</li><li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Transition+Metal+Ions+by+the+Calcium+Indicator+Hydroxy+Naphthol+Blue.">Binding of Transition Metal Ions by the Calcium Indicator Hydroxy Naphthol Blue.</a> Analytical Letters. 11 (4), 355-362 (1978).</li><li>Temel, N. K., Sertakan, K., G&#252;rkan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preconcentration+and+Determination+of+Trace+Nickel+and+Cobalt+in+Milk-Based+Samples+by+Ultrasound-Assisted+Cloud+Point+Extraction+Coupled+with+Flame+Atomic+Absorption+Spectrometry.">Preconcentration and Determination of Trace Nickel and Cobalt in Milk-Based Samples by Ultrasound-Assisted Cloud Point Extraction Coupled with Flame Atomic Absorption Spectrometry.</a> Biological Trace Element Research. 186 (2), 597-607 (2018).</li><li>Ferreira, S. L. C., Santos, B. F., de Andrade, J. B., Costa, A. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+derivative+spectrophotometric+determination+of+nickel+with+hydroxynaphthol+blue.">Spectrophotometric and derivative spectrophotometric determination of nickel with hydroxynaphthol blue.</a> Microchimica Acta. 122 (1), 109-115 (1996).</li><li>Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Self-Assembly+of+Monodisperse+Phospholipid+Bilayer+Nanodiscs+with+Controlled+Size.">Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (11), 3477-3487 (2004).</li><li>Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+extended+membrane+scaffold+proteins+for+self-assembly+of+soluble+nanoscale+lipid+bilayers.">Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 23 (11), 843-848 (2010).</li><li>Bonta, M., Hegedus, B., Limbeck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+dried-droplets+deposited+on+pre-cut+filter+paper+disks+for+quantitative+LA-ICP-MS+imaging+of+biologically+relevant+minor+and+trace+elements+in+tissue+samples.">Application of dried-droplets deposited on pre-cut filter paper disks for quantitative LA-ICP-MS imaging of biologically relevant minor and trace elements in tissue samples.</a> Analytica Chimica Acta. 908, 54-62 (2016).</li><li>Olmedo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+method+to+quantify+chromium,+cadmium,+manganese,+nickel+and+lead+in+human+whole+blood,+urine,+saliva+and+hair+samples+by+electrothermal+atomic+absorption+spectrometry.">Validation of a method to quantify chromium, cadmium, manganese, nickel and lead in human whole blood, urine, saliva and hair samples by electrothermal atomic absorption spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 659 (1), 60-67 (2010).</li><li>Shyamal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Selective+Turn-On+Fluorogenic+Chemosensor+for+Robust+Quantification+of+Zn(II)+Based+on+Aggregation+Induced+Emission+Enhancement+Feature.">Highly Selective Turn-On Fluorogenic Chemosensor for Robust Quantification of Zn(II) Based on Aggregation Induced Emission Enhancement Feature.</a> ACS Sensors. 1 (6), 739-747 (2016).</li><li>Kudo, H., Yamada, K., Watanabe, D., Suzuki, K., Citterio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-Based+Analytical+Device+for+Zinc+Ion+Quantification+in+Water+Samples+with+Power-Free+Analyte+Concentration.">Paper-Based Analytical Device for Zinc Ion Quantification in Water Samples with Power-Free Analyte Concentration.</a> Micromachines. 8 (4), 127 (2017).</li><li>Liu, R., Zhang, P., Li, H., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-cloth+integrated+with+gravity/capillary+flow+chemiluminescence+(GCF-CL):+towards+simple,+inexpensive,+portable,+flow+system+for+measuring+trivalent+chromium+in+water.">Lab-on-cloth integrated with gravity/capillary flow chemiluminescence (GCF-CL): towards simple, inexpensive, portable, flow system for measuring trivalent chromium in water.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 236 (C), 35-43 (2016).</li></ol>

Kolorimetrisk detektion av metaller med HNB ger ett enkelt sätt att kvantifiera graden av protein förorening genom övergång metalljoner från IMAC hartser. Som vi etablerat i Ref. 20 binder ni2 + till hnb med 1:1 stoichiometri och dissociationskonstant för ni-HNB-komplexet ändras med pH. Dock är komplexet Kd i sub-nm-området för alla rekommenderade (7-12) pH-värden. I praktiken innebär det att alla ni2 + i alla testade fraktioner kommer att binda till HNB så länge inga andra ...

Sedan starten av Porath och medarbetare1, immobiliserade metallaffinitetskromatografi (iMac) har blivit en metod för val att snabbt separera proteiner baserat på deras förmåga att binda med övergång metalljoner såsom Zn2+, ni2 +, Cu2 +, och co2 +. Detta görs oftast via konstruerade Poly-Histidine Taggar och är nu en av de vanligaste kromatografiska reningstekniker för isolering av rekombinanta proteiner2. IMac har också funnit tillämpningar utöver rekombinant Proteinrening som ett sätt att isolera kinoloner, tetracykliner, aminoglykosider, makrolider, och β-lactams för mat provanalys3 och som ett steg i att identifiera blod-serumprotein markörer för lever och pankreascancer4,5. Inte överraskande, iMac har också blivit en metod för val för isolering av ett antal infödda blockeringar enzymer6,7,8,9,10. Men framgångsrikt genomförande av dessa reningsmetoder för studier av enzymatiskt aktiva bioenergetiska proteiner är beroende av närvaron av obetydliga nivåer av metallkatjoner som lakas från kolonnmatrisen till eluatet. De divalenta metallkatjoner som vanligen används i iMac har känd patologisk biologisk betydelse, även vid låga koncentrationer11,12. Den fysiologiska effekten av dessa metaller är mest uttalad i bioenergetiska system, där de kan visa sig dödliga som hämmare av cellandning eller fotosyntes13,14,15. Liknande frågor är oundvikliga för de flesta protein klasser där rester av främmande metaller kan störa proteiners biologiska funktioner eller karaktärisering med biokemiska och biofysiska metoder.
Även om halterna av metallkontaminering under oxiderande förhållanden och användning av Imidazol som eluant vanligtvis är låga16, proteinisoleringar utförs i närvaro av cystein reducerande medel (DTT, β-merkaptoetanol, etc.) eller med starkare kelatorer som histidin17,18 eller etylendiamintetraättiksyra (EDTA) resultera i mycket högre nivåer av metall förorening19,20. Likaså, eftersom metalljoner i IMAC hartser ofta samordnas av karboxylska grupper, protein elutioner utförs under sura förhållanden är också sannolikt att ha mycket högre nivåer av metall förorening. Metallhalten i lösningar kan bedömas med hjälp av atomabsorptionsspektroskopi (AAS) och induktivt kopplad plasma-masspektrometri (ICP-MS) ner till en detektionsgräns i ppb-PPT-intervallet21,22,23,24. Tyvärr, AAS och ICP-MS är inte realistiska sätt för detektion i en traditionell biokemi Lab som dessa metoder skulle kräva tillgång till specialiserad utrustning och utbildning.
Tidigare arbete av Brittain25,26 undersökt användningen av hydroxynaphthol blå (HNB) som ett sätt att identifiera förekomsten av övergångsmetaller i lösning. Det fanns dock flera interna motsägelser i data20 och dessa arbeten misslyckades med att erbjuda ett adekvat protokoll. Studier av Temel et al.27 och Ferreira et al.28 expanderade på BRITTAIN arbete med HNB som en potentiell metall indikator. Dock utvecklade Temel ett protokoll som utnyttjar AAS för provanalys, med HNB endast som en kelat agent. Ferreiras studie använde förändringen i HNB absorbans Spectra på 563 nm, en region av fri-Dye HNB Spectra som överlappar kraftigt med spektra av HNB-metall komplex vid pH 5,7, vilket gör analysens känslighet ganska låg samt resulterar i relativt svag metallbindande samhörighet20. För att lösa problem i vårt eget labb med ni2 + urlakning från iMac har vi utökat det arbete som utförts av Brittain25,26 och Ferreria28 för att utveckla en enkel analys som kan detektera nanomolära nivåer av flera övergångsmetaller. Vi visade att HNB binder nickel och andra vanliga för IMAC metaller med sub-nanomolar bindande tillhörighet och form 1:1 komplex över ett brett spektrum av pH-värden20. Analysen som rapporteras här baseras på dessa fynd och utnyttjar absorbansförändringar i HNB-spektrumet vid 647 Nm för metallkvantifiering. Analysen kan utföras i det fysiologiska pH-intervallet med hjälp av vanliga buffertar och instrumentering som finns i en typisk biokemi Lab med hjälp av kolorimetrisk detektion och kvantifiering av metall-färgkomplex och tillhörande förändring i absorbans av fri-färg när den binder till metall.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9743-500</td>
			<td>media for E.coli growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, free acid</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxynaphthol blue disoidum salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>219916-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>IB0277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, free acid</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB0360</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>T870-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of metal leaching in immobilized metal affinity chromatography

Förorening av enzymer med metaller som lakats från immobiliserade metallaffinitetskromatografi (IMAC) kolumner utgör ett stort bekymmer för enzymologer, eftersom många av de gemensamma di-och trivalenta katjoner som används i IMAC hartser har en hämmande effekt på enzymer. Omfattningen av utlakning av metaller och effekten av olika elminerande och reducerande reagenser är dock dåligt förstådd till stor del på grund av avsaknaden av enkla och praktiska kvantifieringsprotokoll för övergångsmetaller som använder utrustning som vanligtvis finns i biokemi Labs. För att lösa detta problem har vi utvecklat ett protokoll för att snabbt kvantifiera mängden metall förorening i prover som förberetts med IMAC som reningssteg. Metoden använder hydroxynaphtol blå (HNB) som en kolorimetrisk indikator för metall katjonhalten i en provlösning och UV-VIS-spektroskopi som ett sätt att kvantifiera mängden metall som finns, i nanomolar-området, baserat på förändringen i HNB-spektrumet vid 647 nm. Medan Metallhalt i en lösning historiskt har fastställts med hjälp av atomabsorptionsspektroskopi eller induktivt kopplade plasma tekniker, dessa metoder kräver specialiserad utrustning och utbildning utanför tillämpningsområdet för ett typiskt biokemi laboratorium. Den metod som föreslås här ger ett enkelt och snabbt sätt för biokemister att bestämma metallhalten i prover med hjälp av befintlig utrustning och kunskap utan att offra noggrannhet.

Det spektrum av fria HNB vid neutral pH (svart linje) och representativa spektra av fraktioner analyseras för ni2 + från ISOLERINGEN av MSP1E3D129 visas i figur 2. En framgångsrik analysserie bör uppvisa en minskad absorbans vid 647 nm jämfört med HNB kontroll, vilket motsvarar bildandet av HNB komplex i närvaro av en övergång metall. En misslyckad analys skulle indikeras genom en ökning av absorbans vid 647 nm. Alternativt, mer än 90% minskning ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography at JoVE.com

Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography

Vi presenterar en analys för enkel kvantifiering av metaller som introduceras i prover som bereds med immobiliserad metallaffinitetskromatografi. Metoden använder hydroxynaphthol blått som den kolorimetriska metall indikatorn och en UV-VIS spektrofotometer som detektorn.

Kvantifiering av Metallurlakning i immobiliserad Metallaffinitetskromatografi

Contamination of enzymes with metals leached from immobilized metal affinity chromatography (IMAC) columns poses a major concern for enzymologists, as ...

Vår metod är betydande, eftersom det gör det möjligt för den genomsnittliga biokemisten att snabbt avgöra om prover isolerade med hjälp av immobiliserade metall affinitet kromatografi är förorenade med övergång metaller. Den största fördelen är den lätthet genom vilken analysen kan utföras. Analysen använder instrumentering och tekniker som är gemensamma för de flesta biokemilabb, och den kan enkelt och snabbt implementeras.Medan vi i denna artikel tillämpar denna metod för prover isolerade med en nickel-NTA kolumn, kan metoden användas med någon annan metall affinitet harts. Första gången användare bör prova denna metod med en nickel stamlösning av kända koncentration. Detta kommer att göra dem bekanta med arbetsflödet, exempelfärger och hartser som visas i spektrala förändringar.Demonstrerar proceduren blir Cole Swain, en tekniker från mitt laboratorium. Till att börja med slår du på och värmer upp UV-Vis spektrofotometern. Bestäm de kromatografifraktioner som ska analyseras med hjälp av en diod array UV-Vis spektrofotometer med optisk absorbans vid 280 nanometer för att kvantifiera proteinet.Erhåll 10 till 100 millimolprovsbuffert med en PH mellan 7 och 12, såsom Tris, HEPES, MOPS, och fosfatbuffert. Bered en 12-procentig volymviktslösning av HNB-spridning i provbufferten med hjälp av 120 milligram HNB-reagens för varje milliliter stamlösning som bereds. Ställ in spektrofotometern för att samla in data vid 647 nanometer.Använd en kvarts cuvette fylld med provbufferten för att göra spektrofotometern tom. Bered en styrlösning i en cuvette innehållande 50 mikroliter HNB-materiel per milliliter av total analysvolym. Låt reglaget inkubera i minst tre minuter i rumstemperatur.Mät och antele absorbansen vid 647 nanometer för kontrollprovet. Bered analysproverna genom att blanda 150 mikroliter HNB-bestånd med 2850 mikroliter av lämpligt utspädda proteinfraktioner med provbufferten. Låt provet inkubera i minst tre minuter i rumstemperatur.Upprepa spektrumregistreringen för varje fraktion som ska mätas. I det fall där otillräcklig utspädning erhålls är hela spektralbandet vid 647 nanometer borta. Även med alltför stark utspädning, provet är omöjlig att skilja från kontrollen.För att bestämma koncentrationen av metall i varje prov, först hitta skillnaden av varje provabsorbans vid 647 nanometer från HNB-kontrollen. Bestäm metallkoncentrationen i mikromolar med hjälp av formeln där DF är utspädningsfaktorn för analysfraktionen, delta A-B-S 647 är absorbansförändringen vid 647 nanometer, 3,65 gånger 10 till den negativa 2 representerar utdöendekoefficienten för HNB, och l är cuvettes optiska väg i centimeter. I denna studie, det spektrum av fria HNB vid neutrala PH i representativa spektra av fraktioner assayed för nickel jon från isolering av MSP1E3D1 visas här.En minskad absorbans vid 647 nanometer jämfört med HNB-kontrollen observerades, vilket motsvarade bildandet av HNB-komplex i närvaro av en övergångsmetall. För att visa tillämpningen av denna analys, två hans-taggade membran byggnadsställning proteiner, MSP1E3D1, MSP2N2 och en roman, tre-heme, c-typ cytokrom GSU0105, från geobacter sulfurreducens, analyseras. Protein- och nickeljonhalten för varje fraktion för GSU0105 skiftades avsevärt från varandra, medan fraktionerna för MSP1E3D1 och MSP2N2 som innehöll mest protein också hade den högsta nickelhalten.Det illustreras också att metallinnehållet kanske inte är jämnt fördelat mellan fraktioner som samlats in med hjälp av en mobiliserad metalltillhörighetkromatografi. Det är viktigast att på ett adekvat och konsekvent sätt blanda blankt i alla prover och möjliggöra lika inkubationstider för blindproven i alla prover. Proteinfraktioner av särskilt intresse skulle kunna analyseras ytterligare med atomabsorptionsspektrometri eller ICPMS för att bekräfta metallkontaminering och för att testa för kelaterade eller starkt bundna proteinmetalljoner.Förutom övergång metall urlakning upptäckt, denna teknik kan användas för att mäta bindande affiniteter i övergången metalljoner till proteiner. HNB och eventuell nickel som förekommer i prover är irriterande för ögon respektive hud. Standard-personlig skyddsutrustning inklusive handskar och ögonskydd bör användas under metoden.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Periodic Properties of the Elements

SCIENTISTS IN ACTION

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

Anticancer Metallkomplexen: Syntes och Cytotoxicity Utvärdering av MTT-analys

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Syntes och karakterisering av funktionaliserad metal-organic frame

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radiomärkning och kvantifiering av cellulära nivåerna av fosfoinositider från High Performance Liquid Chromatography kopplade Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Synthesis of a Water-soluble Metal&#8211;Organic Complex Array

Synthesis of a Water-soluble MetalÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œOrganic Complex Array

Syntes av en vattenlösligt metall-organiskt komplex Array

We demonstrate a method for the synthesis of a water-soluble multimetallic peptidic array containing a predetermined sequence of metal centers such as ...

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Upptäckt och enda Cell kvantifiering av metalloxid nanopartiklar med nukleära Microprobe analys

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

Ligand-medierad kärnbildning och tillväxt av Palladium metall nanopartiklar

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Surface Functionalization of Metal-Organic Frameworks for Improved Moisture Resistance

Ytan funktionalisering av belägga med metall-organiska ramar för förbättrad fuktbeständighet

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. ...

Electrophoretic Crystallization of Ultrathin High-performance Metal-organic Framework Membranes

Elektrofores kristallisation av ultratunna högpresterande belägga med metall-organiska ramverk membran

We report the synthesis of thin, highly intergrown, polycrystalline metal-organic framework (MOF) membranes on a wide range of unmodified porous and ...

Molten-Salt Synthesis of Complex Metal Oxide Nanoparticles

Smält-Salt syntes av komplexa metalloxid nanopartiklar

The development of feasible synthesis methods is critical for the successful exploration of novel properties and potential applications of nanomaterials. ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Jon mobilitet-masspektrometri tekniker för att bestämma strukturen och mekanismerna för metall Jon igenkänning och redox aktivitet av metall bindning Oligopeptides