Name: quantification of metal leaching in immobilized metal affinity chromatography
Uploaded: 2020-01-17T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography at JoVE.com

Bu malzeme, Grant MCB-1817448 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen çalışma ve Thomas F. ve Kate Miller Jeffress Memorial Trust, Bank of America, Mütevelli ve belirtilen donör Hazel Thorpe Carman ve George Gay Carman bir ödül tarafından dayanmaktadır Güven.

1. Tsay bileşeni hazırlama
<ol><li>280 nm'de optik absorbans veya protein zenginleştirilmiş fraksiyonları tanımlamak için alternatif protein nicelemesi yöntemleri kullanılarak taltılacak kromatografi fraksiyonlarını belirleyin. NOT: Bu çalışma için UV-Vis spektrofotometre diyot dizilimi kullandık. İş bünyesini artırmak için UV-Vis emiciliğini ölçebilen bir plaka okuyucu kullanılabilir.</li>
	<li>Gerekli numune parçalarının hazırlanması<ol>
<li>7 ile 12 arasında bir pH ile 10-100 mM ar...

<ol>
	<li>Porath, J., Carlsson, J. A. N., Olsson, I., Belfrage, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).</li><li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized-Metal+Affinity+Chromatography+(IMAC):+A+Review.">Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review.</a> Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).</li><li>Takeda, N., Matsuoka, T., Gotoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiality+of+IMAC+as+sample+pretreatment+tool+in+food+analysis+for+veterinary+drugs.">Potentiality of IMAC as sample pretreatment tool in food analysis for veterinary drugs.</a> Chromatographia. 72 (1/2), 127-131 (2010).</li><li>Felix, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+serum+proteins+involved+in+pancreatic+cancer+cachexia.">Identification of serum proteins involved in pancreatic cancer cachexia.</a> Life sciences. 88 (5-6), 218-225 (2011).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+enhanced+laser+desorption/ionization+profiling:+New+diagnostic+method+of+HBV-related+hepatocellular+carcinoma.">Surface enhanced laser desorption/ionization profiling: New diagnostic method of HBV-related hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (1), 55-62 (2009).</li><li>Goldsmith, J. O., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+bacterial+photosynthetic+reaction+centers+with+an+engineered+poly-histidine+tag.">Rapid isolation of bacterial photosynthetic reaction centers with an engineered poly-histidine tag.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1276 (3), 171-175 (1996).</li><li>Guergova-Kuras, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+one-step+purification+of+a+fully+active+polyhistidine-tagged+cytochrome+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides.">Expression and one-step purification of a fully active polyhistidine-tagged cytochrome bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides.</a> Protein Expression and Purification. 15 (3), 370-380 (1999).</li><li>Mitchell, D. M., Gennis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+wildtype+and+mutant+cytochrome+c+oxidase+from+Rhodobacter+sphaeroides+by+Ni(2+)-NTA+affinity+chromatography.">Rapid purification of wildtype and mutant cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides by Ni(2+)-NTA affinity chromatography.</a> FEBS Letters. 368 (1), 148-150 (1995).</li><li>Tian, H., White, S., Yu, L., Yu, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+head+domain+movement+of+the+rieske+iron-sulfur+protein+in+electron+transfer+reaction+of+the+cytochrome+bc1+complex.">Evidence for the head domain movement of the rieske iron-sulfur protein in electron transfer reaction of the cytochrome bc1 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (11), 7146-7152 (1999).</li><li>Tian, H., Yu, L., Mather, M. W., Yu, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexibility+of+the+neck+region+of+the+rieske+iron-sulfur+protein+is+functionally+important+in+the+cytochrome+bc1+complex.">Flexibility of the neck region of the rieske iron-sulfur protein is functionally important in the cytochrome bc1 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (43), 27953-27959 (1998).</li><li>Louie, A. Y., Meade, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+complexes+as+enzyme+inhibitors.">Metal complexes as enzyme inhibitors.</a> Chemical Reviews. 99 (9), 2711-2734 (1999).</li><li>Tam&#225;s, M. J., Sharma, S. K., Ibstedt, S., Jacobson, T., Christen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heavy+Metals+and+Metalloids+As+a+Cause+for+Protein+Misfolding+and+Aggregation.">Heavy Metals and Metalloids As a Cause for Protein Misfolding and Aggregation.</a> Biomolecules. 4 (1), 252-267 (2014).</li><li>Gerencser, L., Maroti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retardation+of+proton+transfer+caused+by+binding+of+the+transition+metal+ion+to+the+bacterial+reaction+center+is+due+to+pKa+shifts+of+key+protonatable+residues.">Retardation of proton transfer caused by binding of the transition metal ion to the bacterial reaction center is due to pKa shifts of key protonatable residues.</a> Biochemistry. 40 (6), 1850-1860 (2001).</li><li>Klishin, S. S., Junge, W., Mulkidjanian, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash-induced+turnover+of+the+cytochrome+bc1+complex+in+chromatophores+of+Rhodobacter+capsulatus:+binding+of+Zn2++decelerates+likewise+the+oxidation+of+cytochrome+b,+the+reduction+of+cytochrome+c1+and+the+voltage+generation.">Flash-induced turnover of the cytochrome bc1 complex in chromatophores of Rhodobacter capsulatus: binding of Zn2+ decelerates likewise the oxidation of cytochrome b, the reduction of cytochrome c1 and the voltage generation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1553 (3), 177-182 (2002).</li><li>Link, T. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+ions+inhibit+the+QP+center+of+bovine+heart+mitochondrial+bc1+complex+by+blocking+a+protonatable+group.">Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bc1 complex by blocking a protonatable group.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (42), 25001-25006 (1995).</li><li>Block, H., Kubicek, J., Labahn, J., Roth, U., Sch&#228;fer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+comprehensive+quality+control+of+recombinant+human+Interleukin-1beta:+a+case+study+for+a+process+development+strategy.">Production and comprehensive quality control of recombinant human Interleukin-1beta: a case study for a process development strategy.</a> Protein Expression and Purification. 57 (2), 244-254 (2008).</li><li>Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+imidazole+to+the+heme+of+cytochrome+c1+and+inhibition+of+the+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides:+II.+Kinetics+and+mechanism+of+binding.">Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: II. Kinetics and mechanism of binding.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22522-22531 (2010).</li><li>Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+imidazole+to+the+heme+of+cytochrome+c1+and+inhibition+of+the+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides:+I.+Equilibrium+and+modeling+studies.">Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: I. Equilibrium and modeling studies.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22513-22521 (2010).</li><li>Bornhorst, J. A., Falke, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins+using+polyhistidine+affinity+tags.">Purification of proteins using polyhistidine affinity tags.</a> Methods in Enzymology. 326, 245-254 (2000).</li><li>Kokhan, O., Marzolf, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+transition+metal+leaching+in+metal+affinity+chromatography+with+hydroxynaphthol+blue.">Detection and quantification of transition metal leaching in metal affinity chromatography with hydroxynaphthol blue.</a> Analytical Biochemistry. 582, 113347 (2019).</li><li>Doyle, C., Naser, D., Bauman, H., Rumfeldt, J., Meiering, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+method+for+simultaneous+measurement+of+zinc+and+copper+in+metalloproteins+using+4-(2-pyridylazo)resorcinol.">Spectrophotometric method for simultaneous measurement of zinc and copper in metalloproteins using 4-(2-pyridylazo)resorcinol.</a> Analytical Biochemistry. 579, 44-56 (2019).</li><li>Furrer, J., Smith, G. S., Therrien, B., Gasser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inorganic Chemical Biology. , (2014).</li><li>Hogeling, S. M., Cox, M. T., Bradshaw, R. M., Smith, D. P., Duckett, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+proteins+in+whole+blood,+plasma+and+DBS,+with+element-labelled+antibody+detection+by+ICP-MS.">Quantification of proteins in whole blood, plasma and DBS, with element-labelled antibody detection by ICP-MS.</a> Analytical Biochemistry. 575, 10-16 (2019).</li><li>Yamasaki, S., Tsumura, A., Takaku, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultratrace+Elements+in+Terrestrial+Water+as+Determined+by+High-Resolution+ICP-MS.">Ultratrace Elements in Terrestrial Water as Determined by High-Resolution ICP-MS.</a> Microchemical Journal. 49 (2), 305-318 (1994).</li><li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+Formation+Between+Hydroxy+Naphthol+Blue+and+First+Row+Transition+Metal+Cyanide+Complexes.">Complex Formation Between Hydroxy Naphthol Blue and First Row Transition Metal Cyanide Complexes.</a> Analytical Letters. 10 (13), 1105-1113 (1977).</li><li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Transition+Metal+Ions+by+the+Calcium+Indicator+Hydroxy+Naphthol+Blue.">Binding of Transition Metal Ions by the Calcium Indicator Hydroxy Naphthol Blue.</a> Analytical Letters. 11 (4), 355-362 (1978).</li><li>Temel, N. K., Sertakan, K., G&#252;rkan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preconcentration+and+Determination+of+Trace+Nickel+and+Cobalt+in+Milk-Based+Samples+by+Ultrasound-Assisted+Cloud+Point+Extraction+Coupled+with+Flame+Atomic+Absorption+Spectrometry.">Preconcentration and Determination of Trace Nickel and Cobalt in Milk-Based Samples by Ultrasound-Assisted Cloud Point Extraction Coupled with Flame Atomic Absorption Spectrometry.</a> Biological Trace Element Research. 186 (2), 597-607 (2018).</li><li>Ferreira, S. L. C., Santos, B. F., de Andrade, J. B., Costa, A. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+derivative+spectrophotometric+determination+of+nickel+with+hydroxynaphthol+blue.">Spectrophotometric and derivative spectrophotometric determination of nickel with hydroxynaphthol blue.</a> Microchimica Acta. 122 (1), 109-115 (1996).</li><li>Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Self-Assembly+of+Monodisperse+Phospholipid+Bilayer+Nanodiscs+with+Controlled+Size.">Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (11), 3477-3487 (2004).</li><li>Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+extended+membrane+scaffold+proteins+for+self-assembly+of+soluble+nanoscale+lipid+bilayers.">Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 23 (11), 843-848 (2010).</li><li>Bonta, M., Hegedus, B., Limbeck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+dried-droplets+deposited+on+pre-cut+filter+paper+disks+for+quantitative+LA-ICP-MS+imaging+of+biologically+relevant+minor+and+trace+elements+in+tissue+samples.">Application of dried-droplets deposited on pre-cut filter paper disks for quantitative LA-ICP-MS imaging of biologically relevant minor and trace elements in tissue samples.</a> Analytica Chimica Acta. 908, 54-62 (2016).</li><li>Olmedo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+method+to+quantify+chromium,+cadmium,+manganese,+nickel+and+lead+in+human+whole+blood,+urine,+saliva+and+hair+samples+by+electrothermal+atomic+absorption+spectrometry.">Validation of a method to quantify chromium, cadmium, manganese, nickel and lead in human whole blood, urine, saliva and hair samples by electrothermal atomic absorption spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 659 (1), 60-67 (2010).</li><li>Shyamal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Selective+Turn-On+Fluorogenic+Chemosensor+for+Robust+Quantification+of+Zn(II)+Based+on+Aggregation+Induced+Emission+Enhancement+Feature.">Highly Selective Turn-On Fluorogenic Chemosensor for Robust Quantification of Zn(II) Based on Aggregation Induced Emission Enhancement Feature.</a> ACS Sensors. 1 (6), 739-747 (2016).</li><li>Kudo, H., Yamada, K., Watanabe, D., Suzuki, K., Citterio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-Based+Analytical+Device+for+Zinc+Ion+Quantification+in+Water+Samples+with+Power-Free+Analyte+Concentration.">Paper-Based Analytical Device for Zinc Ion Quantification in Water Samples with Power-Free Analyte Concentration.</a> Micromachines. 8 (4), 127 (2017).</li><li>Liu, R., Zhang, P., Li, H., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-cloth+integrated+with+gravity/capillary+flow+chemiluminescence+(GCF-CL):+towards+simple,+inexpensive,+portable,+flow+system+for+measuring+trivalent+chromium+in+water.">Lab-on-cloth integrated with gravity/capillary flow chemiluminescence (GCF-CL): towards simple, inexpensive, portable, flow system for measuring trivalent chromium in water.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 236 (C), 35-43 (2016).</li></ol>

HNB kullanan metallerin kolorimetrik tespiti, IMAC reçineklerinden geçiş metal iyonları ile protein kontaminasyon derecesini ölçmek için basit bir yol sağlar. Ref. 20'de belirlediğimiz gibi, Ni2+ 1:1 stoiyometri stoiyometri stoiyometrisi ve Ni-HNB kompleksi için kopma sabiti ile HNB'ye bağlanır. Ancak, karmaşık Kd önerilen tüm (7-12) pH değerleri için alt nM aralığındadır. Pratik açıdan, edta gibi başka güçlü şelatreler mevcut olduğu sürece herhangi bir test fraksiyonl...

Porath ve iş arkadaşları tarafından kuruluşundan bu yana1, immobilize metal afinite kromatografi (IMAC) hızlızn2 + gibi geçiş metal iyonları ile bağ yeteneğine dayalı proteinleri ayırmak için tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir + Ni 2+, Cu2 +ve Co 2+. Bu en yaygın olarak tasarlanmış poli-histidin etiketleri ile yapılır ve şimdi rekombinant proteinlerin izolasyonu için en yaygın kromatografik arıtma tekniklerinden biridir2. IMAC ayrıca kinolonlar izole etmek için bir yol olarak rekombinant protein arıtma ötesinde uygulamalar buldu, tetrasiklinler, aminoglikozitler, makrolidler, ve gıda örnek analizi için β-laktamlar3 ve karaciğer ve pankreas kanserleri için kan-serum protein belirteçleri belirlenmesinde bir adım olarak4,5. Beklendiği gibi, IMAC da yerli biyoenerjit enzimleri6,7,8,9,10bir dizi izolasyon için tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir. Ancak, enzimatik olarak aktif biyoenerjik proteinler üzerinde yapılan çalışmalarda bu arınma yöntemlerinin başarılı bir şekilde uygulanması, sütun matrisinden eluate doğru leached metal katyonlar ihmal edilebilir düzeyde varlığına bağlıdır. IMAC'te yaygın olarak kullanılan divalent metal katyonlar, düşük konsantrasyonlarda bile patolojik biyolojik önemi bilinmektedir11,12. Bu metallerin fizyolojik etkisi en biyoenerjetik sistemlerde belirgindir, onlar hücresel solunum veya fotosentez inhibitörleri olarak ölümcül kanıtlayabilirim13,14,15. Kalıntı kirletici metallerin bir proteinin biyolojik işlevlerini veya biyokimyasal ve biyofiziksel tekniklerle karakterizasyonunu engelleyebildiği protein sınıflarının çoğunda benzer sorunlar kaçınılmazdır.
Oksitleyici koşullar altında metal kontaminasyon düzeyleri ve eluant olarak imidazol kullanarak genellikle düşükiken 16, protein izolasyonları sistein azaltıcı ajanlar varlığında yapılan (DTT, β-mercaptoetanol, vb) veya histidin gibi güçlü şelatörler ile17,18 veya etilendirinamintetraasetik asit (EDTA) metal kontaminasyon çok daha yüksek seviyelerde neden19,20. Benzer şekilde, IMAC reçinelerindeki metal iyonları karboksilik gruplar tarafından sıklıkla koordine edildiğinden, asidik koşullarda yapılan protein elutions da metal kontaminasyonçok daha yüksek düzeyde olması muhtemeldir. Çözeltilerde metal içeriği atomik absorpsiyon spektroskopisi (AAS) ve endüktif plazma kütle spektrometresi (ICP-MS) ppb-ppt aralığında algılama sınırına kadar bir araya gelen21,22,23,24kullanılarak değerlendirilebilir. Ne yazık ki, AAS ve ICP-MS bu yöntemler özel ekipman ve eğitim erişim gerektirecek gibi geleneksel bir biyokimya laboratuvarında algılama için gerçekçi araçlar değildir.
Brittain tarafından önceki çalışma25,26 hidroksinaphthol mavi kullanımı araştırılmış (HNB) çözeltide geçiş metallerin varlığını belirlemek için bir yol olarak. Ancak, veri20'de birkaç iç çelişki vardı ve bu çalışmalar yeterli bir protokol sunamadı. Temel ve ark.27 ve Ferreira ve ark.28'in çalışmaları Brittain'in HNB ile olan çalışmalarını potansiyel bir metal göstergesi olarak genişletti. Ancak Temel, HNB'yi sadece şelat aracı olarak kullanarak AAS'ı numune analizi için kullanan bir protokol geliştirdi. Ferreira'nın çalışmasında 563 nm de HNB emici spektrumdeğişikliği kullanılan, pH 5.7 HNB metal kompleksleri spektrumları ile ağır örtüşen serbest boya HNB spektrumbir bölge, oldukça düşük yanı sıra nispeten zayıf metal bağlama afinite20sonuçlanan. IMAC'ten Ni2+ leaching ile kendi laboratuvarımızda ki sorunları çözmek için, Brittain25,26 ve Ferreria28 tarafından yapılan çalışmaları genişleterek çeşitli geçiş metallerinin nanomolar düzeylerini tespit edebilen kolay bir teşbit geliştirdik. Biz HNB alt nanomolar bağlayıcı yakınlıkları ile IMAC metaller için nikel ve diğer ortak bağlar ve pH değerleri geniş bir yelpazede 1:1 karmaşık20. Burada bildirilen test bu bulgulara dayanmaktadır ve metal niceleme için 647 nm'de HNB spektrumundaki emici değişiklikleri kullanır. Test, tipik bir biyokimya laboratuvarında bulunan ortak tamponlar ve enstrümantasyon kullanılarak, metal boya komplekslerinin kolorimetrik tespiti ve nicelemi kullanılarak ve metale bağlandığında serbest boyanın absorbe edilmesindeki ilgili değişiklik kullanılarak fizyolojik pH aralığında yapılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9743-500</td>
			<td>media for E.coli growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, free acid</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxynaphthol blue disoidum salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>219916-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>IB0277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, free acid</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB0360</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>alternative buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>T870-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of metal leaching in immobilized metal affinity chromatography

IMAC reçineler kullanılan yaygın di-ve trivalent katyonların çoğu enzimler üzerinde inhibitör etkisi olduğu gibi, immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) sütunlarından leached metaller ile enzimlerin kontaminasyonu, enzimler için önemli bir endişe teşkil eder. Ancak, metal yıkamanın kapsamı ve çeşitli eluting ve azaltıcı reaktiflerin etkisi, genellikle mevcut ekipmanları kullanan basit ve pratik geçiş metal kantifikasyon protokollerinin olmaması nedeniyle büyük ölçüde yeterince anlaşılamamıştır. biyokimya laboratuarları. Bu sorunu gidermek için, IMAC kullanılarak bir arınma adımı olarak hazırlanan numunelerde metal kontaminasyon miktarını hızlı bir şekilde ölçmek için bir protokol geliştirdik. Yöntem, hidroksinaphthol mavisini (HNB) numune çözeltisindeki metal katyon içeriği için kolorimetrik bir gösterge olarak ve UV-Vis spektroskopisini, 647 nm'deki HNB spektrumundaki değişikliğe bağlı olarak nanomolar aralığına, mevcut metal miktarını ölçmek için bir araç olarak kullanır. Bir çözeltideki metal içeriği tarihsel olarak atomik soğurma spektroskopisi veya endüktif olarak birleştirilmiş plazma teknikleri kullanılarak belirlenirken, bu yöntemler tipik bir biyokimya laboratuvarının kapsamı dışında özel ekipman ve eğitim gerektirir. Burada önerilen yöntem, biyokimyacıların doğruluktan ödün vermeden mevcut ekipman ve bilgileri kullanarak numunelerin metal içeriğini belirlemeleri için basit ve hızlı bir yol sağlar.

Nötr pH'daki serbest HNB spektrumu (siyah çizgi) ve MSP1E3D129'un izolasyonundan Ni2+ için titreşen kesirlerin temsili spektrumu Şekil 2'degösterilmiştir. Başarılı bir teşp serisi, hnb kontrolüne kıyasla 647 nm'de azalmış bir emicilik göstermelidir, bu da bir geçiş metalinin varlığında HNB komplekslerinin oluşumuna karşılık gelir. Başarısız bir tsay 647 nm emicilik bir artış ile gösterilir. Alternatif olarak, 647 nm'de ilk abs...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography at JoVE.com

Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography

İmmobilize metal afinite kromatografisi kullanılarak hazırlanan numunelere tanıtılan metallerin kolay ölçülmesi için bir test salıyoruz. Yöntem, kolorimetrik metal göstergesi olarak hidroksinaphthol mavisi ve dedektör olarak UV-Vis spektrofotometresi kullanır.

Immobilize Metal Affinity Kromatografisinde Metal Yıkamanın Ölçülmesi

Contamination of enzymes with metals leached from immobilized metal affinity chromatography (IMAC) columns poses a major concern for enzymologists, as ...

Yöntemimiz önemli, çünkü ortalama bir biyokimyacının immobilize metal afinite kromatografisi kullanılarak izole edilen numunelerin geçiş metalleriyle kontamine olup olmadığını hızlı bir şekilde belirlemesine olanak sağlar. Ana avantajı, talın yapılabildiği kolaylıktır. Tahlil enstrümantasyon ve teknikleri en biyokimya laboratuvarları için ortak kullanır ve kolayca ve hızlı bir şekilde uygulanabilir.Bu makalede nikel-NTA kolon ile izole edilmiş numuneler için bu yöntemi uygularken, yöntem başka bir metal afinite reçinesi ile kullanılabilir. İlk kez kullanıcılar bilinen konsantrasyon bir nikel stok çözümü ile bu yöntemi denemelisiniz. Bu, spektral değişikliklerde gösterilen iş akışı, örnek renkler ve reisinler hakkında onları tanıdık.Prosedürü gösteren Cole Swain, laboratuvarımdan bir teknisyen. Başlamak için UV-Vis spektrofotometresini açın ve ısıtın. Proteini ölçmek için 280 nanometre optik absorbansiçeren diyot dizisi UV-Vis spektrofotometre kullanılarak teşbilenecek kromatografi fraksiyonlarını belirleyin.Tris, HEPES, MOPS ve fosfat tamponu gibi PH'si 7 ile 12 arasında olan 10 ila 100 milimolar örnek tampon elde edin. Hazırlanan her mililitre lik stok çözeltisi için 120 miligram HNB reaktifi kullanarak numune arabelleğindeki HNB dağılımının hacim çözeltisi ile %12 ağırlık hazırlayın. Spektrofotometreyi 647 nanometrede veri toplamak için ayarlayın.Spektrofotometreyi boşaltmak için örnek arabellekle dolu bir kuvars cuvette kullanın. Toplam elekt hacminin mililitrebaşına 50 mikrolitre HNB stoku içeren bir cuvette bir kontrol çözeltisi hazırlayın. Kontrol oda sıcaklığında en az üç dakika kuluçkaya izin verin.Kontrol numunesi için emiciliği 647 nanometre de ölçün ve kaydedin. 150 mikrolitre HNB stoğunu, uygun seyreltilmiş protein fraksiyonlarının 2850 mikrolitresi ile numune tamponu ile karıştırarak test numunelerini hazırlayın. Numunenin oda sıcaklığında en az üç dakika kuluçkaya yatmasını bekleyin.Ölçülecek her kesir için spektrum kaydını tekrarlayın. Yeterli seyreltme elde edilmesi durumunda 647 nanometredeki spektral bandın tamamı yok edilir. Çok güçlü seyreltme ile olsa da, örnek kontrol ayırt edilemez.Her numunedeki metal konsantrasyonunun belirlenmesi için, ilk olarak her numune emicisinin HNB kontrolünden 647 nanometrelik farkını bulun. DF'nin titrek fraksiyonu için seyreltme faktörü olduğu formülü kullanarak mikromolardaki metal konsantrasyonu belirleyin, delta A-B-S 647 647 nanometrede emici değişimdir, 3.65 çarpı 10 negatif 2 HNB'nin yok olma katsayısını temsil eder ve ben de cuvette'nin santimetrelik optik yoludur. Bu çalışmada, MSP1E3D1 izolasyonundan nikel iyon için titreşen fraksiyonların temsili spektrumlarında nötr PH'deki serbest HNB spektrumu burada gösterilmiştir.HNB kontrolüne göre 647 nanometrede bir azalma emdirme gözlenmiştir, bu da bir geçiş metalinin varlığında HNB komplekslerinin oluşumuna karşılık gelmektedir. Bu testin uygulanmasını göstermek için, iki adet etiketli membran iskele proteini, MSP1E3D1, MSP2N2 ve geobacter sülfürden oluşan üç heme, c-tipi sitokrom GSU0105 adlı roman analiz edildi. GSU0105 için her fraksiyonun protein ve nikel iyon içeriği birbirinden önemli ölçüde kaydırılırken, en fazla proteini içeren MSP1E3D1 ve MSP2N2 kesirleri de en yüksek nikel içeriğine sahipti.Ayrıca, metal içeriğinin harekete geçirilmiş metal afiyetkromatografisi kullanılarak toplanan kesirler arasında eşit olarak dağıtılmayabileceği de gösterilmiştir. Tüm örneklerdeki boşluğu yeterli ve tutarlı bir şekilde karıştırmak ve tüm numunelerde boş için eşit kuluçka sürelerine izin vermek en önemlidir. Metal kontaminasyonunu doğrulamak ve şelatlı veya güçlü bir şekilde bağlanmış protein metal iyonlarını test etmek için atomik absorpsiyon spektrometresi veya ICPMS ile özel ilgi protein fraksiyonları daha fazla analiz edilebilir.Geçiş metal yıkama algılama yanı sıra, bu teknik proteinlere geçiş metal iyonları bağlayıcı yakınlıkları ölçmek için kullanılabilir. HNB ve numunelerde bulunan herhangi bir nikel sırasıyla göz ve cilt tahriş edicidir. Yöntem sırasında eldiven ve göz koruması içeren standart PPE kullanılmalıdır.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Periodic Properties of the Elements

SCIENTISTS IN ACTION

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

MTT deneyi ile sentez ve Sitotoksisite Değerlendirilmesi: Anticancer Metal Kompleksleri

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Fonksiyonlu Sentezi ve Karakterizasyonu Metal-organik Altyapıları

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi-birleştiğinde Akış Parıldama tarafından Radyoetiketleme ve Fosfoinosititler Hücresel Düzeylerinin Quantification

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Synthesis of a Water-soluble Metal&#8211;Organic Complex Array

Synthesis of a Water-soluble MetalÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œOrganic Complex Array

suda çözünür bir metal-organik kompleks dizi sentezi

We demonstrate a method for the synthesis of a water-soluble multimetallic peptidic array containing a predetermined sequence of metal centers such as ...

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

Situ Algılama ve Metal Oksit nano tanecikleri nükleer Microprobe analizi ile tek hücre miktar

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

Çekirdekleşme ligand-aracılı ve Paladyum Metal nano tanecikleri gelişmesi

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Surface Functionalization of Metal-Organic Frameworks for Improved Moisture Resistance

Geliştirilmiş nem direnci için Metal organik çerçeveler yüzey Functionalization

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. ...

Electrophoretic Crystallization of Ultrathin High-performance Metal-organic Framework Membranes

Elektroforetik kristalizasyon Ultrathin yüksek performanslı Metal organik Framework membranlar

We report the synthesis of thin, highly intergrown, polycrystalline metal-organic framework (MOF) membranes on a wide range of unmodified porous and ...

Molten-Salt Synthesis of Complex Metal Oxide Nanoparticles

Karmaşık Metal Oksit nano tanecikleri erimiş tuz sentezi

The development of feasible synthesis methods is critical for the successful exploration of novel properties and potential applications of nanomaterials. ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Metal Bağlama Oligopeptidlerinin Yapısı ve Mekanizmalarının Belirlenmesinde Iyon Hareketliliği-Kütle Spektrometresi Teknikleri ve Metal Bağlayıcı Oligopeptidlerin Redoks Aktivitesi