Name: isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue
Uploaded: 2020-03-02T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue at JoVE.com

לאומי מפתח R & D תוכנית של סין (2018YFC1312504), הלאומית המדע הטבעי הקרן של סין (81970378, 81670360, 81870293), ועדת המדע והטכנולוגיה של עיריית שנגחאי (17411971000, 17140902402) סיפק את הכספים עבור מחקר זה .

פרוטוקול בעלי החיים נבדק ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'יאו טונג שנגחאי.
1. הדור של Wnt-1 היצורים+/-; Rosa26Rfp/+ עכברים
<ol><li>הצלב Wnt-1 היצורים+/- עכברים16 עם Rosa26rfp/+ עכברים18 כדי ליצור wnt-1 יצורים+/-; Rosa26Rfp/+ עכ...

<ol>
	<li>Afshin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+Effects+of+Overweight+and+Obesity+in+195+Countries+over+25+Years.">Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years.</a> New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Britton, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+distribution,+and+risk+factor+correlates+of+high+thoracic+periaortic+fat+in+the+Framingham+Heart+Study.">Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).</li><li>Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+inflammation+in+periaortic+adipose+tissue+and+angiotensin+II-induced+abdominal+aortic+aneurysm+formation.">Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).</li><li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+adipocyte+formation.">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).</li><li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige/brite+cells.">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).</li><li>Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+isolation+of+primary+adipose+cells+from+mouse+epididymal+fat+pads+induces+inflammatory+mediators+and+down-regulates+adipocyte+genes.">Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Between+brown+and+white:+novel+aspects+of+adipocyte+differentiation.">Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation.</a> Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).</li><li>Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+proliferation+and+differentiation+capacity+of+human+adipocyte+precursor+cells+from+the+omental+and+subcutaneous+adipose+tissue+depot+of+obese+subjects.">Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects.</a> Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Differentiation+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Porcine+Subcutaneous+Adipose+Tissues.">Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).</li><li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte.">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).</li><li>Medeiros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+the+neural+crest:+new+perspectives+from+lamprey+and+invertebrate+neural+crest-like+cells.">The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Crest+Cells+Differentiate+Into+Brown+Adipocytes+and+Contribute+to+Periaortic+Arch+Adipose+Tissue+Formation.">Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Tamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest-derived+stem+cells+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+after+myocardial+infarction.">Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Adipose+Tissue+Collection+and+Processing+for+RNA+Analysis.">Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).</li><li>Gupta, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zfp423+expression+identifies+committed+preadipocytes+and+localizes+to+adipose+endothelial+and+perivascular+cells.">Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells.</a> Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).</li><li>Sowa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+stromal+cells+contain+phenotypically+distinct+adipogenic+progenitors+derived+from+neural+crest.">Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest.</a> PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).</li><li>Billo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+adipocytes+by+the+neural+crest.">The generation of adipocytes by the neural crest.</a> Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).</li><li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting.">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).</li></ol>

במחקר זה, אנו מציגים שיטה אמינה לבידוד, תרבות, ואינדוקציה אדיפוגניים של NCADSCs שחולצו מ-PVAT של Wnt-1 היצורים+/-; עכברים Rosa26rfp/+ טרנסגניים שתוכננו לייצר rfp+ ADSCs. הדיווחים הקודמים מראים כי אין הבדל משמעותי בביטוי של תאי גזע mesenchymal כללי רב עוצמה (MSCs) סמנים ב NCADSCs ו לא NCADSCs22, ו...

השכיחות של השמנת יתר היא גוברת ברחבי העולם, אשר מגביר את הסיכון של מחלות כרוניות קשורות, כולל מחלות לב וכלי דם, סוכרת1. PVAT מ המקיף כלי דם הוא מקור עיקרי של גורמים האנדוקריניים האנדוקרינית המעורבים בפונקציה vascuלטורה. מחקרים קליניים מראים כי תוכן ה-pvat הגבוה הוא גורם סיכון עצמאי של מחלות לב וכלי דם2,3, והפונקציה הפתולוגית שלו תלויה בפנוטיפ של בתאי הגזע שנגזר האדיפוז (ADSCs)4.
למרות הקווים של התאים ADSC כמו murine 3T3-L1, 3T3-F442A, ו OP9 הם מודלים סלולריים שימושיים כדי ללמוד adipogenesis או ליפוגנזה5, מנגנוני הרגולציה של אדיפוגנזה שונים בין קווי התא תאים ראשוניים. ADSCs ב סטרומה תא כלי דם (SVF) מבודד ישירות מרקמות אדיפוז והמושרה להבדיל לתוך adipocytes סביר להניח ביותר בשנת vivo אדיפוגנזה וליפוגנזה6. עם זאת, שבריאת, ציפה, ואת הווריאציות גודל וimmunophenotypes של ADSCs להפוך את הבידוד הישיר שלהם מאתגרת. בנוסף, הליכי הבידוד השונים יכולים גם להשפיע באופן משמעותי על היכולת הפוטנציאלית שלהתאים האלה, ובכךמדגישים את הצורך בפרוטוקול השומר על תקינות adsc.
רקמת אדיפוז מסווגת בדרך כלל כרקמת השומן הלבנה המורפולוגית והפונקציונלית (וואט), או רקמת השומן החום (BAT)8, אשר מנמלים בנפרד ADSCs9. בעוד ADSCs בודד מן הואגונאדאל ומוואטים תת עורית התאפיין במחקרים קודמים9,10,11,12, פחות ידוע לגבי ADSCs מ-pvat כי מורכב בעיקר מבת13.
במחקר שנערך לאחרונה, מצאנו שחלק מADSCs התושב ברקמת השומן של אבי העורקים (paat) נגזרים מתאי ציצה עצבית (nccs ק), אוכלוסייה ארעית של תאים של מהגרים מהגרים שמקורם בעור של14,15. Wnt1-עכברים טרנסגניים שימשו למעקב של מעקב העצבים העצבי תא16,17. חצינו Wnt1-היצורים+ עכברים עם Rosa26rfp/+ עכברים ליצור Wnt-1 היצורים+/-; Rosa26rfp/+ עכברים, שבו nccs ו צאצאיהם מסומנים עם חלבון פלורסנט אדום (rfp) ומסומנים בקלות בvivo ובמבחנה15. כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד ציצה עצבית הנגזרת ADSCs (NC-נגזר ADSCs, או NCADSCs) מהעכבר PAAT ולגרום NCADSCs להבדיל לתוך adipocytes לבן או adipocytes חום.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>E672002-0500</td>
			<td>Lot #: EC11FA0001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>A47902</td>
			<td>1% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cebp/&#945;</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A0904</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7076</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-perilipin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB61682</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration; lot #: GR66486-54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PPARy</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-7273</td>
			<td>0.2 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked</td>
			<td>CST</td>
			<td>7074</td>
			<td>1:5000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin</td>
			<td>CST</td>
			<td>2146</td>
			<td>1:1000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR life sciences</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>0.1 &#181;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>R35-076-CV</td>
			<td>50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDMEM</td>
			<td>Gelifesciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Lot #: AD20813268</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>0.5 mM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3536</td>
			<td>1 &#956;g/mL working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F201A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-H121A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1516</td>
			<td>0.3% working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td>ABCONE (China)</td>
			<td>P41970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT reagent Kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR047A</td>
			<td>Lot #: AK4802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9767</td>
			<td>Lot #: AHF1991D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26RFP/+ mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.007909</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td>1 &#956;M working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-F424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)</td>
			<td>MR-S231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Premix Ex Taq</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR420A</td>
			<td>Lot #: AK9003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2877</td>
			<td>10 nM working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre+;PPAR&#947;flox/flox mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>No.009107</td>
			<td>C57BL/6 backgroud; male and female</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest original adipose-derived stem cells from periaortic adipose tissue

כמות מוגזמת של רקמת אדיפוז מסביב לכלי הדם (רקמת השומן הפריקולרית, המוכרת גם כ-PVAT), קשורה לסיכון גבוה למחלות לב וכלי דם. ADSCs שמקורם ברקמות שונות מציגות תכונות נפרדות, ואלה מ-PVAT מ לא התאפיין היטב. במחקר שנערך לאחרונה, דיווחו כי חלק ADSCs ברקמת השומן של האבי העורקים (PAAT) לרדת מן התאים ציצה עצבית (NCCs '), אוכלוסייה ארעית של תאים נודדים שמקורם האקטועור.
במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול עבור בידוד חלבון פלורסנט אדום (RFP) מתויג NCCs מ PAAT של Wnt-1 היצורים+/-; Rosa26Rfp/+ עכברים וגרימת בידול האדיגניים שלהם בתוך מבחנה. בקצרה, שבר כלי הדם סטרומה (SVF) הוא הושעה אנזימטי של PAAT, ו-RFP+ ציצה עצבית הנגזרת ADSCs (NCADSCs) מבודדים על ידי מיון תא המופעל על ידי הזריחה (facs). NCADSCs להבדיל לתוך שניהם adipocytes חום ולבן, יכול להיות cryopreserved, ולשמור על פוטנציאל האדיגניים שלהם עבור ~ 3 – 5 מעברים. הפרוטוקול שלנו יכול ליצור ADSCs שופע מתוך PVAT ל עבור דוגמנות PVAT ע או ליפוגנזה בתוך מבחנה. לפיכך, NCADSCs אלה יכולים לספק מערכת רבת-ערך לחקר המתגים המולקולריים המעורבים בבידול PVAT מ.

באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, הגענו ~ 0.5 – 1.0 x 106 ADSCs מ 5-6 wnt-1 היצורים+/-; Rosa26Rfp/+ עכברים (48 בן שבועות, זכר או נקבה).
תרשים הזרימה של אוסף PAAT מעכברים מוצג באיור 1. המבנה של הNCADSCs היה דומה ל-ADSC מן העכברים האחרים מרקמות האדיפוז. הNCADSCs התרבותיים הגיעו ל-80...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue at JoVE.com

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד, התרבות, והאינדוקציה האדיגנית של הרכס העצבי (NCADSCs) מתוך רקמת השומן של ה-Wnt-1 יצורים+/-; Rosa26Rfp/+ עכברים. NCADSCs יכול להיות מקור נגיש בקלות של ADSCs עבור מידול אדיפוגנזה או ליפוגנזה ב מבחנה.

בידוד, תרבות, והשראה של הרכס העצבי המקורי אדיפוז-תאי גזע שמקורם ברקמת אדיפוז

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

המתודולוגיה הפשוטה והמעשית שלנו יכולה לשמש כדי להשיג ADSCS בשפע לחקר ADIPogenesis PVAT במבחנה ולמבחן תרופות נורמליות נגד השמנת יתר ומחלות לב וכלי דם הקשורות. היתרון של שיטה זו הוא הפלואורסצנטיות הטבועה של NCADSCs של ביוטין אתה צריך לתייג את התאים עם נוגדנים נדדים flou-chrome עבור FACS, או מיון תאים מופעל מגנטי. שיטה זו יכולה לשמש כדי לרכוש ADSC בשפע נגזר תאי סמל עצבי מן ectoderm ללמוד אדיפוגנזה PVAT, או lipogenesis במבחנה.באמצעות עכברים צעירים שיש ניסיון עם cautery ו adipogenesis המושרה אומר 3T3 תאים הוא קריטי להצלחת פרוטוקול זה. הדגמת ההליך תהיה Yiding Qi, סטודנטית לתואר שני, וליאן שו, טכנאית מהמעבדה שלי. עבור ניתוח PAAT, לאחר עיקור פגר העכבר ב 75% אתנול במשך חמש דקות, להשתמש במספריים כדי לחשוף ולהפריד את העור על הבטן.חותכים לאורך קו האמצע הגחון מהאגן לצוואר, ולפתוח את הבטן. להזיז את הכבד כדי לחשוף את הסרעפת, לחתוך את הסרעפת ואת הצלעות משני צידי קו האמצע. מקלפים בחזרה את הצלעות כדי לחשוף את הלב והריאות.ולהסיר את הריאות ואת התימוס. מוציאים את הפאאט יחד עם בית הישבן והלב לתוך צלחת פטרי. ולנתק את בית ההיתוך בשורש בית ההיתוך כדי להסיר את הלב.לאחר מכן, לעשות חתך בין קשת בית ההיתוך ו aorta יורד. בזהירות להפריד את רקמת השומן המקיפה את שני המבנים, ואת העורקים הראשיים הנפוצים שמאלה ויימין מקיר החזה האחורי. חשוב להפריד את PAAT מהשורש כמו כלי דם גדולים יותר בזהירות, היא נוכחות של תאי קיר כלי הדם יכול להשפיע על יעילות FACS.מניחים את הרקמה לתוך צלחת פטרי המכילה חיץ HBSS קר כקרח. ולהשתמש מטלטולים סטריליים כדי להסיר כמה שיותר של כלי דם fascia ככל האפשר. לאחר מכן, להעביר את רקמת השומן לתוך צינור Eppendorf שני מיליליטר, המכיל נקודה חמישה מיליליטר של חיץ HBSS קר קרח על קרח.כאשר כל PAAT נאסף, להעביר את רקמת השומן שנקטפו לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה שני מיליליטר חדש המכיל מיליליטר אחד של מדיום עיכול מוכן טרי. ולהשתמש במספריים כירורגיים כדי לטחון את הרקמות. העבר את תרחיף הרקמה לתוך צינור 50 מילימטר המכיל תשעה מיליליטר של מדיום עיכול טרי.ולהשתמש פיפט מיליליטר אחד כדי triturate הרקמות 10 פעמים. כאשר פתרון הומוגני הושג, דגירה הצינור במשך 30 עד 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 100 מהפכות לדקה, בדיקת כל חמש עד 10 דקות כדי למנוע overdigestion. כאשר פתרון רקמת שומן הומוגני צהוב בהיר ניתן לראות על מערבולת עדינה של הצינור, לעצור את העיכול עם חמישה מיליליטר של HDMEM בתוספת 10% נסיוב חזיר עוברי.לאחר ערבוב יסודי, צנטריפוגה מדגם רקמת השומן. שבר תא כלי הדם הסטרומאלי יהיה גלוי ככדור חום. להשעות מחדש את גלולה ב 10 מיליליטר של מדיום תרבות, ולסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר.לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה אחרת. בעדינות להשעות את גלולה בחמישה מיליליטר של חיץ תזה אריתרוציטים. העבר את ההשעיה לצינור 15 מיליליטר.לאחר 10 דקות, להפסיק את התגובה עם שני צנטריפוגות ב 10 מיליליטר של PBS, בתוספת 1% נסיוב בקר עוברי. לאחר הצנטריפוגה השנייה, להשעות מחדש את גלולה בחמישה מיליליטר של מדיום תרבות על קרח. ולאסוף את התאים עם צנטריפוגה סופית.לאחר מכן, השהה מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של מאגר FACS לספירה. כדי להקים תרבות NCADSC, לאחר הבידוד שלהם על ידי FACS על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, למקם את התאים בחמש פעמים 10 לתאים השלישיים לס"מ בריבוע ריכוז בכל באר, צלחת תרבות 12 היטב. בינוני תרבות לא שלם ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 20 עד 24 שעות.למחרת, לשטוף את התאים עם 37 מעלות צלזיוס PBS, ולהאכיל את התרבות עם מדיום תרבות טרי. כאשר התרבות מגיעה 80 עד 90%confluency, לטפל בתאים עם שני מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA לגם במשך שלוש עד חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים נותקו מתחתית הצלחת, לנטרל את האנזימים עם שני מיליליטר של מדיום מתורבת, ולאסוף את התאים שנקטפו על ידי צנטריפוגה.להשעות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של מדיום תרבות טרי לספירה. ולזרע את התאים בצלחת חדשה של 12 בארות בתרבות של חמש פעמים עד התאים השלישיים, ריכוז בריבוע של 12 ס"מ. לאחר מכן, להשעות מחדש את התאים הנותרים בתרבות בינוני בתוספת 10% דימתיל סולפוקסיד לאחסון קפוא בחנקן נוזלי.כדי לגרום התמיינות אדיפוגנית, כאשר התאים מגיעים 80 עד 90%confluency, לטפל בתאים עם מדיום אינדוקציה אדיפוגניים חום או לבן במשך יומיים לפי הצורך. בסוף הדגירה, יש לשטוף בעדינות את התאים פעמיים עם PBS לפני הוספת מדיום אינדוקציה אדיפוגניים טרי מתאים לכל באר, והחזרת התאים לחממת תרבות התאים למשך שלושה עד חמישה ימים נוספים של דגירה. NCADSCs מתורבתים להגיע 80 עד 90% confluency לאחר שבעה עד שמונה ימים של תרבות.ולהדגים פיברגלס מורחב כמו מורפולוגיה. כדי לאשר עוד יותר את הפוטנציאל האדיפוגני שלהם, כתמים אדומים שמן של NCADSCs הבדיל יכול להתבצע כדי לזהות adipocytes בוגרת. בדרך כלל, adipocytes בוגרת נצפו לאחר שמונה ימים של אינדוקציה אדיפוגנית לבנה או חומה עם מעל 60% של NCADSCs המציגים התברמות אדיפוגנית.שים לב כי NCADSCs להפגין פוטנציאל אדיפוגני מופחת מאוד לאחר המעבר. Immunoblotting ו PCR כמותי בזמן אמת לגלות כי הביטוי של חלבונים יחסיים ספציפיים adipocyte וגנים גדל באופן משמעותי NCADSCs הבדיל אדיפוגנית לאחר שמונה ימים של אינדוקציה אדיפוגנית לבנה. באופן דומה, הביטוי של גנים ספציפיים adipocyte, וגנים ספציפיים adipocyte חום, גם עולה באופן משמעותי לאחר שמונה ימים של אינדוקציה אדיפוגנית חומה.מכיוון שרוב פרוטוקול הבידוד של NCADSC הוא פשוט, חסכוני, ולא דורש שימוש בנוגדנים, לשם כך, עוצמת הסיבות הנוזליות החזקות של IFP יכולה לשפר את יעילות ההזנה של FACS.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

בידוד וההעשרה של אדם שומן המופק מתאי סטרומה לOsteogenesis משופר

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Culturing האדם pluripotent ואת עצבי תאי גזע מערכת תרבית תאים סגורות למחקר בסיסי פרה

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

בידוד ובידול של תאי גזע נגזר שומן מרקמות שומן תת עורי בשר חזירים

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

הפרדת immunomagnetic של שומן דיפו ספציפי Sca1<sup&gt; גבוה</sup&gt; בתאי גזע שמקורם שומן (ASCs)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Chondrogenic בידול האינדוקציה של תאי גזע שמקורם שומן על ידי הכביד צנטריפוגלי

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

בידוד מהיר של BMPR-IB + השומן שמקורם בתאי סטרומה לשימוש במודל ריפוי פגם calvarial

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

אין ויוו מעקב של האדם נגזר שומן בתאי גזע Mesenchymal במודל דלקת מפרקים ניוונית של הברך עכברוש עם קרום Lipophilic פלורסנט לצבוע

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...