Name: analysis of non-human primate pancreatic islet oxygen consumption
Uploaded: 2019-12-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Non-Human Primate Pancreatic Islet Oxygen Consumption at JoVE.com

המחברים רוצים להכיר את הליבה של תפוקה גבוהה של ואנדרבילט ההקרנה לשימוש המתקנים שלהם, Agilent Biotechnologies, ד ר. פול Kievit (אורגון בריאות ומדע האוניברסיטה) עבור הפרימטים שאינם אנושיים, ו אריק דונהיו (אוניברסיטת ואנדרבילט) לסיוע עם איור 1. J.M.E. של המכון הלאומי לבריאות תחת מספר הפרס T32GM007347. מ היה נתמך על ידי NIH/NIDDK (R24DK090964-06) ואת המחלקה לעניינים ותיקי (BX003744).

1. הכנת מחסנית מיקרופלייט וסנסור ביום הקודם להפעלת השיטת המחשב
איונים היו מבודדים מקופי-התוכי היפני בן השלוש, כפי שתיאר בעבר13. שיטה זו דומה מאוד לזה ששימש לבידוד איונים אנושיים מתורמים של גופה, אבל שונה מעכברים, שבו pancreata מנופחים לעתים קרובות עם פתרון הקולגן בעוד ...

<ol>
	<li>Mulder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcribing+&#946;-cell+mitochondria+in+health+and+disease.">Transcribing &#946;-cell mitochondria in health and disease.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).</li><li>Maechler, P., Wollheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+signals+in+glucose-stimulated+insulin+secretion+in+the+beta+cell.">Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell.</a> The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).</li><li>Curry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagon+Potentiation+of+Insulin+Secretion+by+the+Perfused+Rat+Pancreas.">Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas.</a> Diabetes. 19 (6), 420 (1970).</li><li>Song, G., Pacini, G., Ahr&#233;n, B., D'Argenio, D. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagon+Increases+Insulin+Levels+by+Stimulating+Insulin+Secretion+Without+Effect+on+Insulin+Clearance+in+Mice.">Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice.</a> Peptides. 88, 74-79 (2017).</li><li>Vergari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+inhibits+glucagon+release+by+SGLT2-induced+stimulation+of+somatostatin+secretion.">Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion.</a> Nature Communications. 10 (1), 139 (2019).</li><li>Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+regulation+of+glucagon+secretion:+the+&#946;/&#945;/&#948;+model.">Paracrine regulation of glucagon secretion: the &#946;/&#945;/&#948; model.</a> American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).</li><li>Sweet, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+measurement+of+oxygen+consumption+by+pancreatic+islets.">Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).</li><li>. Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide">https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide</a> (2019)</li><li>Wikstrom, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-throughput+assay+for+islet+respiration+reveals+uncoupling+of+rodent+and+human+islets.">A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets.</a> PLoS One. 7 (5), e33023 (2012).</li><li>Taddeo, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+islet+respirometry+reveals+functional+diversity+within+the+islet+population+of+mice+and+human+donors.">Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors.</a> Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).</li><li>Conrad, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAFB+transcription+factor+impacts+islet+alpha-cell+function+in+rodents+and+represents+a+unique+signature+of+primate+islet+beta-cells.">The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells.</a> American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).</li><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity:+interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li><li>Elsakr, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Western-style+diet+affects+offspring+islet+composition+and+function+in+a+non-human+primate+model+of+maternal+over-nutrition.">Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition.</a> Molecular Metabolism. , (2019).</li><li>Soutar, M. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FBS/BSA+media+concentration+determines+CCCP's+ability+to+depolarize+mitochondria+and+activate+PINK1-PRKN+mitophagy.">FBS/BSA media concentration determines CCCP's ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy.</a> Autophagy. , 1-10 (2019).</li><li>Hirshberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+Islet+Transplantation+Using+the+Nonhuman+Primate+(Rhesus)+Model+Predicts+That+the+Portal+Vein+Is+Superior+to+the+Celiac+Artery+as+the+Islet+Infusion+Site.">Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site.</a> Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).</li><li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data.">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).</li><li>Papas, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+Oxygen+Consumption+Rate+(OCR)+Dose+Predicts+Insulin+Independence+in+Clinical+Islet+Autotransplantation.">Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation.</a> PLoS One. 10 (8), e0134428 (2015).</li></ol>

המחקר של צריכת חמצן של איון כבר הושפע בעבר על ידי הצורה כדורית של איונים, חוסר הדבקות שלהם משטחי התרבות, ואת מספר איונים נדרש לכל טוב. בפרוטוקול זה, אנו להדגיש את היעילות של 96-היטב מיקרו-לוחית ספרואיד עבור מדידת צריכת החמצן של איון על מספר קטן של איונים ולהדגים טכניקה לטיפול וטעינת איונים שה...

על מנת לשמור על רמות הגלוקוז בדם נורמלי, התא β הלבלב חייב לחוש את הגבהים בגלוקוז ולהפריש אינסולין בהתאם. צימוד הפרשת האינסולין עם רמות הגלוקוז קשור ישירות לחילוף החומרים של הגלוקוז ולייצור ATP דרך זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי. כך, המיטו, לשחק תפקיד קריטי הפרשות הגירוי צימוד1. הערכת β-מיטוכונדריאלי-תא יכולה לחשוף פגמים המובילים לפגיעה באינסולין. הפרשה של גלוקגון על ידי תאים הלבלב α הוא גם קשור הדוק פונקציה מיטוכונדריאלי2. למרות מונצח קווי התא הוכיחו שימושי עבור סוגים מסוימים של assays הפיזיולוגיה של תאים אלה אינה מדויקת באופן מדויק הפונקציה איון שלם, כפי שמודגם על ידי פוטנציאל של הפרשת אינסולין על ידי גלוקגון3,4 ואת עיכוב הפרשת גלוקגון על ידי אינסולין/סומטוסטטין5,6 ב איים שלמים. זה מדגים את הצורך מדידת צריכת החמצן באמצעות איים שלמים, שלם.
טכניקות עבור המדידה של תא מוריקה של התא איון התפתחו לאורך זמן, מהשימוש של צבעי פלורסנט רגישים חמצן7 כדי חיישנים במצב מוצק כי מדידת ישירות צריכת החמצן8. תוכנן בתחילה עבור monolayer, תאים חסיד, בדרך כלל מערכות השימוש בתרבות התא הוכיחו להיות לא יעילים עבור איולי הלבלב. כמו האיים לא לדבוק באופן טבעי הבארות, הם נוטים להיות נדחף לפריפריה של התרבות היטב וכתוצאה מכך מדידה לא מדויקת של צריכת החמצן9. כדי להילחם בבעיה זו, לוחיות 24-היטב מיוחדות עם דיכאון מרכזי שיכול להכיל איונים פותחו9. עם זאת, הצלחת 24-באר מערכת היה מוגבל על ידי מספר גדול של איונים נדרש (50-80 לכל טוב) ואת מספר התנאים שניתן היה לבדוק בו10. ההתפתחות האחרונה של 96-מיקרולוחיות היטב תוכנן במיוחד עבור ניתוח השטף החילוץ ב spheroids יש להתגבר על המחסומים האלה, המאפשר את המדידה של איון הגז מוריקה עם 20 או פחות איים לכל טוב10.
כאן, אנו להדגים את השימוש במערכת זו כדי למדוד צריכת חמצן באיים מ מקוק יפני (macaca פאסכאטה), מודל בעל חיים עם ביולוגיה איון דומה לבני אדם11,12. , בפרוטוקול זה. מנתחים 15 מקוק בבאר בידינו, 15 איונים לכל התוצרת הגבוהה בסיסית צריכת החמצן הבסיסית מאשר פחות איונים, עם הפעלה חזקה ודיכוי של נשימה בתגובה טיפול תרופתי. אנו מדגישים את הצעדים להכנה לצורך התמדה, שיטה אפקטיבית להעלאת האיונים העקביים במרכז הבאר, ואתגרים משותפים בעת ביצוע הצורך.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube, 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP350-1</td>
			<td>For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable reservoirs (sterile), 25 ML</td>
			<td>Vistalab</td>
			<td>3054-1033</td>
			<td>for loading multichannel pipet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZFlow Sterile 0.45 &#956;m PES Syringe Filter, 13 mm</td>
			<td>Foxx Life Sciences</td>
			<td>371-3115-OEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>200 mM (100x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>94410810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette, 15-1250 &#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4672100BT</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20, P200, and P1000 pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Probe</td>
			<td>Hanna Instruments</td>
			<td>HI2210-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 20 &#956;L, 200 &#956;L, 1000 &#956;L</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>24-404, 24-412, 24-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Base Media</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103334-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S7800B</td>
			<td>Including prep station with 37 &#176;C non-CO2 incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102905-100</td>
			<td>Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>100 mM (100x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (sterile), 5 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309603</td>
			<td>For sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (sterile)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W3500-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of non-human primate pancreatic islet oxygen consumption

המדידה של צריכת החמצן באשכולות ספרואיד של תאים, כגון איולי לשעבר vivo הלבלב, היסטורית היה מאתגר. אנו להדגים את המדידה של צריכת חמצן של איון באמצעות 96-ובכן מיקרופלייט המיועדים למדידת צריכת החמצן ב spheroids. בתוך מעשה זה, מיקרולוחיות ספרואיד מצופות בדבק תא ורקמה ביום שלפני השיטת הפעולה. אנו מנצלים נפח קטן של הפתרון דבק כדי לעודד הדבקות איון רק בתחתית הבאר. ביום השימוש, 15 איונים נטענים ישירות לבסיס של כל הבאר באמצעות טכניקה המבטיחה מיקום אופטימלי של איונים ומדידה מדויקת של צריכת החמצן. היבטים שונים של נשימה מיטוכונדריאלי מאובטים באופן פרמקולוגית באיונים לא אנושיים, כולל נשימה תלוית ATP, נשימה מירבית ודליפת פרוטון. שיטה זו מאפשרת לתוצאות עקביות, הניתן לשימוש באמצעות מספר קטן של איונים לכל טוב. זה יכול תיאורטית להיות מיושם על כל הרוהרואידים תרבותי בגודל דומה.

כדי לטעון איים לתוך microplate, 15 איונים צריכים להיות משופחת ב 15 μL של מדיה, כפי שמוצג באיור 1א. איונים באופן טבעי להתיישב לקראת החלק התחתון של הטיפ pipet בתוך כמה שניות. לאחר מכן, הקצה התחתון מופחת לתחתית הבאר. הטיפ הוא מוסר מעט מאוד, וכמות קטנה (כ 5 μL) הוא ממ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Non-Human Primate Pancreatic Islet Oxygen Consumption at JoVE.com

Analysis of Non-Human Primate Pancreatic Islet Oxygen Consumption

פרוטוקול זה מדגים את המדידה המדויקת והניתנת לכימות של צריכת החמצן באיונים שאינם אנושיים הלבלב. שיטות הטעינה של איון וציפוי המיקרופלטה מספקות מסגרת למדידת יעילות של נשימה בסוגים אחרים של הספרואידים מתורבתים.

ניתוח של שאינם אנושיים הלבלב של איון צריכת החמצן

The measurement of oxygen consumption in spheroid clusters of cells, such as ex vivo pancreatic islets, has historically been challenging. We demonstrate ...

שיטה זו מאפשרת לכמת את צריכת החמצן מכמות קטנה של איונים ממינים רלוונטיים, כגון פרימטים לא אנושיים ובני אדם, ומאפשרת הערכה של תפקוד המיטוכונדריאלי. טכניקה זו יכולה להתבצע עם מספר קטן של איונים ראשוניים, הגדלת שכפולים טכניים, המאפשר בדיקה של תנאים מרובים, ושיפור הקשיחות ואת הרבייה של הבדיקה. טכניקה זו מעריכה את בריאות המיטוכונדריה, גורם מכריע בתפקוד איון והפרשת אינסולין שלעתים קרובות נפגעת בסוכרת והיא מנבאת משמעותית של השתלת איון מוצלחת.זה חיוני כדי לוודא כי איונים הם מקומיים למרכז הבארים לאחר ההעברה. כישלון לעשות זאת גורם למדידות צריכת חמצן לא עקביות. הוכחת הליך זה תהיה, ואלרי ריצ'ארדי, סטודנטית לתואר ראשון שעובדת במעבדה שלי.יום לפני הראיה, להוסיף 200 microliters של תאים ורקמות דבק 2.8 מיליליטר של 0.1 פתרון סודיום ביקרבונט טוחן ולהוסיף 20 microliters של הפתרון וכתוצאה מכך לתחתית של כל באר של 96 מיקרופלסטיק כדורי היטב. ודא שכל בועות האוויר יוסרו מהטיפ של הפיפיאט. כאשר כל בארות כבר טעון, למקם את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס שאינו פחמן דו חמצני אינקובטור.לאחר שעה אחת, שאפו את תותבת דבק התא מהצלחת בתוך סביבה סטרילית ושטפו כל באר פעמיים עם 400 מיקרוליטרים של מים סטריליים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן אפשרו ל בארות להתייבש במשך 30 עד 40 דקות לפני כיסוי הצלחת לאחסון לילה בארבע מעלות צלזיוס. כדי לחות את מחסנית החיישן, בסביבה סטרילית לפתוח את חבילת מחסנית החיישן ולהסיר את התוכן.מניחים את מחסנית החיישן במהופך ליד צלחת השירות וממלאים כל באר של צלחת השירות עם 200 מיקרוליטרים של מים סטריליים. לאחר שכל הבארות נטענו, הורידו את מחסנית החיישנים לתוך לוחית השירות והצבו את מחסנית החיישן המורכבת ואת לוחית השירות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס שאינו פחמן דו-חמצני במהלך הלילה. ביום ההתראה, להסיר את מכסה מחסנית החיישן ולפענח את המים מן הבארים של צלחת השירות.הוסף 200 מיליליטר של כיול טרום המלחמה לכל באר והחלף את מכסה מחסנית החיישן. ואז למקם את מחסנית החיישן בחזרה לתוך החממה במשך כשעה. כדי להכין את איונים להעברה, יד לבחור את איונים לתוך צלחת 60 על 15 מילימטר תאים המכיל מדיום מורכב ליד 100% טוהר.כאשר כל האיונים נאספו, לטעון כל באר של מיקרופלאט ספרואיד מוכן עם 175 microliters של מדיום התאספו ולהשתמש פיפטה P20 להגדיר 15 microliters כדי לשכוף 15 איונים ב 15 microliters של מדיום מן צלחת תרבות התא. כדי לזרוע את האיונים על המיקרופלאט הכדורידי, הורידו את קצה הפיפט לתחתית הגם, בקושי הרימו את הקצה, ופזרו לאט כחמש מיקרוליטרים של מדיום. כדי לטעון את איונים לתוך בארות, לאפשר את איונים להתיישב בקצה פיפטה לפני בעדינות לשחרר אותם ישירות מעל החלק התחתון של מרכז היטב בנפח קטן של מדיום.אשר כי כל האיים עזבו את קצה פיפטה, מדי פעם בדיקת מיקרופלסטיק כדורית מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא כי האיים הם זרע בתחתית הצלחת ולא דבוקים לצדדים של בארות. כאשר כל האיים הועברו, מניחים את המיקרופלאט ב-37 מעלות צלזיוס שאינם פחמן דו-חמצני. לפני התחלת הליך הבדיקה, טען את יציאה A של מחסנית החיישן עם 20 מיקרוליטרים של אוליגומיצין 45 מיקרומולרים טריים, פורט B עם 22 מיקרוליטרים של FCCP 10 מיקרומולרים שהוכנו זה לזה, ופורט C עם 25 מיקרוליטרים של רוטנונה 25 מיקרומולרים טריים AA. לאחר מכן, לתכנת מתקן שטף חוץ תאיים למשך 30 דקות תקופת נשימה בסיסית, 42 דקות תקופת מדידת אוליגומיצין, תקופת FCCP של 30 דקות, ותהוכת רוטנונה AA של 30 דקות.לאחר מכן הפעל את ההתראה בהתאם להוראות על המסך לכיול החיישן ולהכנסת המיקרופלסטיק. עבור משלוח איון לצלחת ההתמדה, יש לזמן 15 איונים ב-15 מיקרוליטרים של מדיום כפי שמודגם. טכניקה זו תגרום למיקום עקבי של איונים במרכז התחתון של כל באר מיקרופלסטיק המאפשר מדידות צריכת חמצן מדויקות.בניסוי מייצג זה מראה את צריכת החמצן של בארות בודדות, הבארים היו טעונים היטב וכתוצאה מכך רמה בסיסית נמוכה מאוד של צריכת חמצן מעט מאוד תגובה FCCP. בניסוי זה, רוב בארות הפגינו נשימה בסיסית משמעותית ותגובה לסמים. עם זאת, שתי בארות לא הציגו תגובה רוטנונה, מה שמרמז כי התרופה לא שוחרר כראוי לתוך באר.בארות אלה הוצאו מניתוחים נוספים. כאן, ניתן לראות את התוצאות של בדיקה מוצלחת שבה בארות היו טעונות כראוי עם איונים מוזרק כראוי עם תרופות ניתן לראות. זה מועיל להכין את reagents ואת הצלחות יום לפני ביצוע ההתעקשות כדי לאפשר את איונים לשמש זמן קצר לאחר שהם מבודדים או מתקבלים.לאחר ההתמדה, ניתן לשחזר את איונים עבור חלבון או מיצוי DNA כדי לנרמל את נתוני צריכת החמצן או לכמת את תוכן ה- DNA המיטוכונדריאלי. היכולת למדוד תפקוד מיטוכונדריאלי במספרים קטנים של איוני פרימטים ראשוניים מאפשרת בדיקה של תרופות מרובות ומניפולציות אחרות בשכפול ביולוגי אחד. אנשים העובדים עם איי פרימטים ראשוניים צריכים להיות מאומנים בטיפול הנכון והבטוח עם רקמות אלה.בפרט, השימוש בציוד מגן אישי מתאים וסילוק נאות של דגימות אלה.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

אינדוקציה ישירה של Hemogenic האנדותל ודם על ידי יתר של גורמי שעתוק בתאי גזע pluripotent האדם

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

בידול יעיל של pluripotent בתאי גזע כדי NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; אבות הלבלב

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

הערכה של המיקום תאיים של מינים חמצן תגובתי ב- Solea Senegalensis Spermatozoa

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

רזולוציה סופר correlative ואלקטרון לפתרון חלבון לוקליזציה ברשתית דג זברה

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

יעיל הדור של הלבלב/תריסריון גנים Homeobox חלבון 1+ אבות הלבלב במעי הקדמי/אחורי של hPSCs בתרבויות אדהזיה

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

מדידה כמותית של מינים חמצן תגובתי, הזדקנות ביולוגית-הקשורים פנוטיפ הפרשה ב Fibroblasts אנושי נורמלי במהלך אונקוגן-induced הזדקנות ביולוגית

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Transcriptomic תא בודד ניתוחים של תאים בלבלב האנדוקרינית העכבר

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

ניתוח של סינתזת חלבונים Epididymal והפרשת

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...