Name: analysis of non-human primate pancreatic islet oxygen consumption
Uploaded: 2019-12-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Non-Human Primate Pancreatic Islet Oxygen Consumption at JoVE.com

Yazarlar kendi tesislerinin kullanımı için Vanderbilt Yüksek Throughput Tarama Çekirdek kabul etmek istiyorum, Agilent Biyoteknolojiler, Dr Paul Kievit (Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi) insan olmayan primat adacık izolasyonları için, ve Eric Donahue (Vanderbilt Üniversitesi) Şekil 1 ile yardım için. J.M.E. T32GM007347 ödül numarası ile Ulusal Sağlık Enstitüleri NIGMS tarafından desteklendi. M.G. NIH/NIDDK (R24DK090964-06) ve Gazi İşleri Dairesi (BX003744) tarafından desteklenmiştir.

1. Tsanın Çalıştırılan Gün Mikroplaka ve Sensör Kartuşunun Hazırlanması
Adacıklar daha önce13açıklandığı gibi üç yaşındaki Japon makak izole edildi. Bu yöntem kadavra donörlerden insan adacıkları izole etmek için kullanılan çok benzer, ancak fareler farklıdır, hangi pankreata genellikle hayvan sedasyon altında ve organ kaldırma önce kollajenaz çözeltisi ile şişirilir. Adacık alımı Oregon Ulusal Primat Araştırma Merkezi (ONPRC) ve...

<ol>
	<li>Mulder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcribing+&#946;-cell+mitochondria+in+health+and+disease.">Transcribing &#946;-cell mitochondria in health and disease.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).</li><li>Maechler, P., Wollheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+signals+in+glucose-stimulated+insulin+secretion+in+the+beta+cell.">Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell.</a> The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).</li><li>Curry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagon+Potentiation+of+Insulin+Secretion+by+the+Perfused+Rat+Pancreas.">Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas.</a> Diabetes. 19 (6), 420 (1970).</li><li>Song, G., Pacini, G., Ahr&#233;n, B., D'Argenio, D. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagon+Increases+Insulin+Levels+by+Stimulating+Insulin+Secretion+Without+Effect+on+Insulin+Clearance+in+Mice.">Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice.</a> Peptides. 88, 74-79 (2017).</li><li>Vergari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+inhibits+glucagon+release+by+SGLT2-induced+stimulation+of+somatostatin+secretion.">Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion.</a> Nature Communications. 10 (1), 139 (2019).</li><li>Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+regulation+of+glucagon+secretion:+the+&#946;/&#945;/&#948;+model.">Paracrine regulation of glucagon secretion: the &#946;/&#945;/&#948; model.</a> American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).</li><li>Sweet, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+measurement+of+oxygen+consumption+by+pancreatic+islets.">Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).</li><li>. Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide">https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide</a> (2019)</li><li>Wikstrom, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-throughput+assay+for+islet+respiration+reveals+uncoupling+of+rodent+and+human+islets.">A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets.</a> PLoS One. 7 (5), e33023 (2012).</li><li>Taddeo, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+islet+respirometry+reveals+functional+diversity+within+the+islet+population+of+mice+and+human+donors.">Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors.</a> Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).</li><li>Conrad, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAFB+transcription+factor+impacts+islet+alpha-cell+function+in+rodents+and+represents+a+unique+signature+of+primate+islet+beta-cells.">The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells.</a> American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).</li><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity:+interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li><li>Elsakr, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Western-style+diet+affects+offspring+islet+composition+and+function+in+a+non-human+primate+model+of+maternal+over-nutrition.">Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition.</a> Molecular Metabolism. , (2019).</li><li>Soutar, M. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FBS/BSA+media+concentration+determines+CCCP's+ability+to+depolarize+mitochondria+and+activate+PINK1-PRKN+mitophagy.">FBS/BSA media concentration determines CCCP's ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy.</a> Autophagy. , 1-10 (2019).</li><li>Hirshberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+Islet+Transplantation+Using+the+Nonhuman+Primate+(Rhesus)+Model+Predicts+That+the+Portal+Vein+Is+Superior+to+the+Celiac+Artery+as+the+Islet+Infusion+Site.">Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site.</a> Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).</li><li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data.">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).</li><li>Papas, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+Oxygen+Consumption+Rate+(OCR)+Dose+Predicts+Insulin+Independence+in+Clinical+Islet+Autotransplantation.">Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation.</a> PLoS One. 10 (8), e0134428 (2015).</li></ol>

Adacık oksijen tüketimi çalışma daha önce adacıkların küresel şekli, kültür yüzeylerine bağlılık eksikliği ve iyi başına gerekli adacık sayısı tarafından engel olmuştur. Bu protokolde, 96 kuyulu küresel mikroplakanın az sayıda adacık üzerinde adacık oksijen tüketimini ölçmek için etkinliğini vurgulamakta ve teknik olarak uygun ve tutarlı hale gelen adacıkların taşınması ve yüklenmesi için bir teknik göstermekteyiz. Sonuç -ları.
Adacıkların mikrop...

Normal kan şekeri düzeylerini korumak için, pankreas β hücre glikoz yükseklikleri algılamak ve buna göre insülin salgılar. İnsülin salgısının glikoz düzeyleri ile birleå mesi, glukoz metabolizmasÄ± ve mitokondriyal oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP Ã1/4retimi ile doÄ rudan baÄ lantÄ±lÄ± dÃ1/4Å Ã1/4rÃ1/4lÃ1/4yor. Böylece, mitokondri uyarıcı-salgı kaplin kritik bir rol oynamaktadır1. Β-hücre mitokondriyal fonksiyonunun değerlendirilmesi, insülin salgısının bozulmasına yol açan kusurları ortaya çıkarabilir. Pankreas α hücreleri tarafından glukagon salgıları da yakından mitokondriyal fonksiyon2bağlıdır . Ölümsüzleştirilmiş adacık hücre hatları tahliller bazı türleri için yararlı kanıtlanmış olmasına rağmen, Bu hücrelerin fizyolojisi doğru tüm adacık fonksiyonu özetlemek değil, glukagon tarafından insülin salgılanması potentiation gösterildiği gibi3,4 ve insülin tarafından glukagon salgılanması inhibisyonu5,6 bozulmamış adacıklar. Bu, bütün, bozulmamış adacıklar kullanılarak oksijen tüketimini ölçme ihtiyacını göstermektedir.
Adacık hücre respirometrisinin ölçümü teknikleri zamanla, oksijene duyarlı floresan boyaların kullanımındanoksijen tüketimini doğrudan ölçen katı hal sensörlerine kadar gelişmiştir8. Başlangıçta monolayer için tasarlanmış, yapışık hücreler, yaygın olarak kullanılan hücre kültürü plaka sistemleri pankreas adacıkları için etkisiz olduğu kanıtlanmıştır. Adacıklar doğal olarak kuyulara yapışmadığı için, kültürün çevresine itilmeye yatkındırlar ve bu da oksijen tüketiminin yanlış ölçülmesi ile sonuçlanır9. Bu sorunla mücadele etmek için, adacıklar içerebilir merkezi bir depresyon ile özel 24-iyi plakalar geliştirilmiştir9. Ancak, 24-iyi plaka sistemi gerekli adacıkların çok sayıda (kuyu başına 50-80) ve aynı anda10test edilebilir koşulların sayısı ile sınırlıydı. Küresel lerde ekstrasellüler akı analizi için özel olarak tasarlanmış 96-iyi mikroplakalar son gelişme iyi10başına 20 veya daha az adacık ile adacık respirometri ölçümü sağlayan, bu engelleri aşmıştır.
Burada, japon makak(Macaca fuscata),insanlara benzer adacık biyolojisi ile bir hayvan modeli11,12adacıklarda oksijen tüketimini ölçmek için bu sistemin kullanımını göstermek . Bu protokolde, her biri 15 makak adacık analiz edilir. Elimizde, 15 adacık lar iyi az adacıklar daha yüksek bazal oksijen tüketimi üretilen, sağlam aktivasyon ve farmakolojik manipülasyon yanıt olarak solunum baskı ile. Her kuyunun merkezinde adacıkların tutarlı bir şekilde yüklenmesi için etkili bir yöntem olan ve bu titreyi gerçekleştirirken karşılaşılan genel zorluklara hazırlanmak için gereken adımları vurguluyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube, 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP350-1</td>
			<td>For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable reservoirs (sterile), 25 ML</td>
			<td>Vistalab</td>
			<td>3054-1033</td>
			<td>for loading multichannel pipet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZFlow Sterile 0.45 &#956;m PES Syringe Filter, 13 mm</td>
			<td>Foxx Life Sciences</td>
			<td>371-3115-OEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>200 mM (100x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>94410810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette, 15-1250 &#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4672100BT</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20, P200, and P1000 pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Probe</td>
			<td>Hanna Instruments</td>
			<td>HI2210-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 20 &#956;L, 200 &#956;L, 1000 &#956;L</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>24-404, 24-412, 24-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Base Media</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103334-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S7800B</td>
			<td>Including prep station with 37 &#176;C non-CO2 incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102905-100</td>
			<td>Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>100 mM (100x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (sterile), 5 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309603</td>
			<td>For sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (sterile)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W3500-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of non-human primate pancreatic islet oxygen consumption

Ex vivo pankreas adacıkları gibi küresel hücre kümelerinde oksijen tüketiminin ölçümü tarihsel olarak zor olmuştur. Adacık oksijen tüketiminin ölçülmesini, küresel lerde oksijen tüketiminin ölçülmesi için tasarlanmış 96 kuyuluk bir mikroplaka ile gösteriyoruz. Bu tözde, küresel mikroplakalar bir hücre ve doku yapıştırıcısı ile önceki gün asanın la kaplıdır. Adacık bağlılığını sadece kuyunun dibine yapışmasını teşvik etmek için küçük hacimli yapışkan çözüm kullanıyoruz. Tsuruk gününde, 15 adacık, adacıkların optimum konumlandırılmasını ve oksijen tüketiminin doğru ölçülmesini sağlayan bir teknik kullanılarak doğrudan her kuyunun tabanına yüklenir. Mitokondriyal solunumun çeşitli yönleri, ATP'ye bağımlı solunum, maksimal solunum ve proton sızıntısı gibi insan dışı primat adacıklarında farmakolojik olarak incelenir. Bu yöntem, kuyu başına yalnızca az sayıda adacık kullanarak tutarlı, tekrarlanabilir sonuçlar sağlar. Teorik olarak benzer büyüklükteki kültürlere uygulanabilir.

Adacıkları mikro plakaya yüklemek için Şekil 1A'dagösterildiği gibi 15 adacık 15°L ortama aspire edilmelidir. Adacıklar doğal olarak birkaç saniye içinde pipet ucunun dibine doğru yerleşirler. Daha sonra, pipet ucu kuyunun altına indirilir. Ucu çok hafifçe kaldırılır ve küçük bir hacim (yaklaşık 5 μL) adacıklar ile birlikte dışarı borulu. Bu teknik, adacık ların mikroplaka nın alt kısmında tutarlı bir şek...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Non-Human Primate Pancreatic Islet Oxygen Consumption at JoVE.com

Analysis of Non-Human Primate Pancreatic Islet Oxygen Consumption

Bu protokol, insan dışı primat pankreas adacıklarında oksijen tüketiminin doğru ve tekrarlanabilir ölçümünü göstermektedir. Adacık yükleme teknikleri ve mikroplaka kaplama kültürlü küresel diğer türde solunum verimli ölçümü için bir çerçeve sağlar.

İnsan Dışı Primat Pankreatik Adacık Oksijen Tüketiminin Analizi

The measurement of oxygen consumption in spheroid clusters of cells, such as ex vivo pancreatic islets, has historically been challenging. We demonstrate ...

Bu yöntem, insan olmayan primatlar ve insanlar gibi ilgili türlerden gelen az sayıda adacıktan gelen az sayıdaki adacıklardan oksijen tüketiminin ölçülmesine olanak sağlayarak mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesine olanak sağlar. Bu teknik, az sayıda birincil adacıkla, teknik çoğaltmaların artırılması, birden fazla koşulun test edilmesine olanak tanıyan ve testin katılığını ve tekrarlanabilirliğini geliştirerek gerçekleştirilebilir. Bu teknik, adacık fonksiyonu ve insülin salgısının önemli bir belirleyicisi olan ve genellikle diyabette bozulmuş olan ve başarılı adacık naklinin önemli bir belirleyicisi olan mitokondriyal sağlığı değerlendirir.Adacıkların transferden sonra kuyuların merkezine lokalize olduğundan emin olmak esastır. Aksi takdirde tutarsız oksijen tüketimi ölçümleri ile sonuçlanır. Bu prosedürü gösteren, Valerie Ricciardi, benim laboratuvarımda çalışan bir lisans öğrencisi olacak.Bir gün önce, 0,1 molar sodyum bikarbonat çözeltisi 2.8 mililitre hücre ve doku yapıştırıcı 200 mikrolitre ekleyin ve 96 iyi küresel mikroplaka her kuyunun altına elde edilen çözelti nin 20 mikrolitre ekleyin. Herhangi bir hava kabarcıkları pipet ucu kaldırılır emin olun. Tüm kuyular yüklendiğinde, plakayı 37 derece lik karbondioksit olmayan bir inkübatöre yerleştirin.Bir saat sonra, steril bir ortamda plaka dan hücre yapışkan çözeltiaspire ve 37 derece santigrat steril su 400 mikrolitre ile her kuyu iki kez yıkayın. Daha sonra kuyuların 4 santigrat derecede geceleme için plakayı kaplamadan önce 30 ila 40 dakika boyunca kurumasını bekleyin. Sensör kartuşunu nemlendirmek için steril bir ortamda sensör kartuş paketini açın ve içindekileri çıkarın.Sensör kartuşunu yardımcı plakanın yanına ters yerleştirin ve yardımcı plakanın her kuyusunu 200 mikrolitre steril suyla doldurun. Tüm kuyular yüklendiğinde, sensör kartuşu yardımcı plakaya indirin ve monte edilmiş sensör kartuşu ve yardımcı plakayı bir gecede 37 derece santigrat derece karbondioksit olmayan inkübatöre yerleştirin. Tgörünüşe gününde, sensör kartuşu kapağını çıkarın ve suyu servis plakasının kuyularından çıkarın.Her kuyuya 200 mililitre önceden ısıtılmış kalibran ekleyin ve sensör kartuş kapağını değiştirin. Daha sonra sensör kartuşu yla yaklaşık bir saat boyunca kuvöze geri yerleştirin. Adacıkları transfer için hazırlamak için, adacıkları yaklaşık %100 saflıkta biraraya getirilmiş ortam içeren 60 ila 15 milimetrelik hücre kültür yemeğine yerleştirin.Tüm adacıklar toplandığında, hazırlanan küresel mikroplakanın her kuyuyu 175 mikrolitre bir araya getirilmiş ortamla yükleyin ve hücre kültürü çanaktan 15 mikrolitrelik orta 15 adacık aspire etmek için 15 mikrolitreye ayarlanmış bir P20 pipet kullanın. Adacıkları küresel mikroplakaya tohumlamak için pipet ucunu kuyunun dibine indirin, ucu zar zor kaldırın ve yaklaşık beş mikrolitre orta litre orta yığın. Adacıkları kuyulara yüklemek için, adacıkların pipet ucuna yerleşmelerine izin verin ve bunları kuyu merkezinin alt kısmından küçük bir hacimde yavaşça serbest bırakın.Tüm adacıkların pipet ucunu bıraktığını doğrulayın, ara sıra mikroskop altında küresel mikroplakayı kontrol edin ve adacıkların plakanın alt kısmında tohumlu olduğunu ve kuyuların kenarlarına yapışmadığını doğrulayın. Tüm adacıklar transfer edildiğinde, mikroplakayı 37 derece karbondioksit olmayan inkübatöre yerleştirin. Teşp prosedürünü başlatmadan önce, sensör kartuşunun 20 mikrolitresi ile sensör kartuşuna yeni hazırlanmış 45 mikromolar oligomisin, 22 mikrolitre taze hazırlanmış 10 mikromolar FCCP ile Port B'yi ve 25 mikrolitre taze hazırlanmış 25 mikromolar rotenon AA ile Port C'yi yükleyin. Daha sonra, program 30 dakikalık temel solunum dönemi, 42 dakika oligomisin ölçüm dönemi, 30 dakika FCCP dönemi ve 30 dakikalık rotenon AA dönemi için bir ekstrasellüler akı analizörü testi.Daha sonra sensörü kalibre etmek ve mikro plakayı yerleştirmek için ekrandaki talimatları izleyerek testi çalıştırın. Adacık teslimi için, 15 adacık gösterildiği gibi orta 15 mikrolitre aspire edilmelidir. Bu teknik, adacıkların her bir mikroplakanın alt ortasına tutarlı bir şekilde yerleştirilmesine ve doğru oksijen tüketimi ölçümlerinin alınmasına olanak sağlamasına neden olacaktır.Bireysel kuyuların oksijen tüketimini gösteren bu temsili deneyde, kuyular kötü yüklenmiş ve bu da çok düşük bir temel oksijen tüketimi düzeyine ve FCCP'ye yanıt vermeye naz ına neden olarak yüklenmiştir. Bu deneyde, kuyuların çoğu önemli bir temel solunum ve ilaçlara yanıt gösterdi. Ancak, iki kuyu rotenone hiçbir yanıt sergiledi, ilacın düzgün kuyuya serbest olmadığını düşündüren.Bu kuyular daha ileri analizler dışında tutuldu. Burada, kuyuların adacıklarla doğru bir şekilde yüklendiği ve doğru bir şekilde ilaç enjekte edildiği başarılı bir tahkikatsonuçları gözlemlenebilir. Adacıkların izole edildikten veya alındıktan kısa bir süre sonra kullanılmasına izin vermek için, tetkikleri gerçekleştirmeden bir gün önce reaktiflerin ve plakaların hazırlanması faydalıdır.Testin ardından, adacıklar oksijen tüketimi verilerini normalleştirmek veya mitokondriyal DNA içeriğini ölçmek için protein veya DNA çıkarma için geri kazanılabilir. Mitokondriyal fonksiyonu az sayıda birincil primat adacıklarında ölçebilme yeteneği, birden fazla ilaç ve diğer manipülasyonların tek bir biyolojik çoğaltmada test edilmesine olanak sağlar. Birincil primat adacıkları ile çalışan bireyler bu dokular ile doğru ve güvenli kullanım konusunda eğitilmiş olması emin olmalısınız.Özellikle, uygun kişisel koruyucu ekipman kullanımı ve bu örneklerin uygun bertaraf.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Transkripsiyon Faktörleri aşırı ifadesinin doğrudan Hemogenic Endotelyumunun uyarılması ve Kan

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Gelişim Biyolojisi

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotent Verimli Farklılaşma NKX6-1 için Kök Hücreler<sup&gt; +</sup&gt; Pankreas Progenitörler

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Reaktif oksijen türleri Solea Senegalensis sperm hücreleri, hücre içi konumunu değerlendirilmesi

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Bağdaşık süper çözünürlük ve elektron mikroskobu Zebra balığı Retina Protein yerelleşme gidermek için

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Verimli üretimi, pankreas/oniki parmak bağırsağı Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/pankreas ataları hPSCs yapışma kültürlerde üzerinden

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

Reaktif oksijen türleri ve yaşlanma ilişkili salgı fenotip Normal insan fibroblast içinde bir nicel ölçüm onkogen kaynaklı yaşlanma sırasında

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Fare pankreatik endokrin hücreleri tek hücre Transcriptomic analizleri

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

Epididimal Protein sentezi ve salgı Analizi

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...