Name: line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles
Uploaded: 2020-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من خلال تمويل مشروع جامعة هلسنكي (WBS490302، WBS73714112) تمويل مستشفى جامعة هلسنكي الحكومي للبحوث الصحية على المستوى الجامعي (Y1014SUL05، TYH2016130)، المؤسسة الطبية الفنلندية النرويجية، وسلمى و صندوق ماجا - ليزا سيلاندر (مؤسسة مينيرفا). نشكر والتر بافيتشيتش على توفير بروتوكول MSPA المعدل وعلى الدعم الفني ذي الصلة. نحن ممتنون لتيمو ماسالين (جامعة هلسنكي) لمساعدتنا في إنتاج الفيديو.

وافقت لجنة الأخلاقيات في هلسنكي ومنطقة مستشفى أوسيما (الموافقة الأخلاقية رقم 217/13/03/02/2015).
1. إعداد FBS المنضب EV عن طريق التضاريس
<ol><li>تأخذ FBS في (فائقة) أنابيب الطرد المركزي ووضعها في دلاء الطرد المركزي فائقة. لضمان أن ultracentrifugation يعمل بسلاسة وأمان، وتحقيق التوازن بين الدلاء داخ?...

<ol>
	<li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenomics:+DNA+methylomes+and+histone-modification+maps.">Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).</li><li>Herman, J. G., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+cancer+in+association+with+promoter+hypermethylation.">Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation.</a> New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+Cancer:+The+Next+Generation.">Hallmarks of Cancer: The Next Generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+transposition+of+endogenous+retroviral+elements+in+hypomethylation+induced+tumors+in+mice.">Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice.</a> Oncogene. 27, 404-408 (2008).</li><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome.">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409, 860-921 (2001).</li><li>Rodriguez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+instability+correlates+with+genome-wide+DNA+demethylation+in+human+primary+colorectal+cancers.">Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers.</a> Cancer Research. 66, 8462 (2006).</li><li>Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetic+progenitor+origin+of+human+cancer.">The epigenetic progenitor origin of human cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).</li><li>Bock, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiQ+Analyzer:+visualization+and+quality+control+for+DNA+methylation+data+from+bisulfite+sequencing.">BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing.</a> Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).</li><li>Schouten, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+quantification+of+40+nucleic+acid+sequences+by+multiplex+ligation-dependent+probe+amplification.">Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification.</a> Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).</li><li>Nygren, A. O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation-Specific+MLPA+(MS-MLPA):+simultaneous+detection+of+CpG+methylation+and+copy+number+changes+of+up+to+40+sequences.">Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences.</a> Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).</li><li>El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).</li><li>Vallabhaneni, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+bone+marrow+mesenchymal+stem/stromal+cells+transport+tumor+regulatory+microRNA,+proteins,+and+metabolites.">Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites.</a> Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).</li><li>Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-+derived+microvesicles:+important+and+underappreciated+mediators+of+cell-to-cell+communication.">Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication.</a> Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).</li><li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+as+mediators+of+intercellular+communication+in+cancer-+the+emerging+science+of+cellular+"debris".">Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris".</a> Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).</li><li>Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+mediate+the+horizontal+transfer+of+an+active+LINE-1+retrotransposon.">Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).</li><li>Mannerstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+alterations+in+mesenchymal+stem+cells+by+osteosarcoma-derived+extracellular+vesicles.">Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles.</a> Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).</li><li>Shelke, G. V., L&#228;sser, C., Gho, Y. S., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+exosome+depletion+protocols+to+eliminate+functional+and+RNA-containing+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).</li><li>Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+bovine+serum+RNA+interferes+with+the+cell+culture+derived+extracellular+RNA.">Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA.</a> Scientific Reports. 6, 31175 (2016).</li><li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).</li><li>Puhka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+profiling+of+extracellular+vesicles+and+alternative+normalization+methods+reveal+enriched+metabolites+and+strategies+to+study+prostate+cancer-related+changes.">Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes.</a> Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).</li><li>Peltoniemi, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+enrichment+does+not+warrant+a+higher+graft+survival+in+lipofilling+of+the+breast:+A+prospective+comparative+study.">Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study.</a> Journal of Plastic, Reconstructive &amp; Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).</li><li>Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltom&#228;ki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE-1+hypomethylation+in+familial+and+sporadic+cancer.">LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer.</a> Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).</li><li>. L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2) Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269</a> (2000)</li><li>Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland Available from: <a target="_blank" href="https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes">https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes</a> (2018)</li><li>. Takara Bio Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview">https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview</a> (2018)</li><li>Pisanic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+interspersed+nuclear+element+1+retrotransposons+become+deregulated+during+the+development+of+ovarian+cancer+precursor+lesions.">Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions.</a> The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).</li></ol>

توضح هذه الدراسة كيف يمكن استخدام اجتماع الأطراف للكشف عن حالة الميثيل لعنصر وراثي معين وقياسها كمياً. كان LINE-1 هو التركيز هنا، ولكن يمكن تصميم المسابير لاستهداف مجموعة من الجينات والتسلسلات. وعلاوة على ذلك، هناك قائمة متزايدة من يمزج التحقيق المتاحة لمختلف التطبيقات. MSPA هو تقنية بسيطة وق...

ميثيل الحمض النووي هو تعديل لاجيني كبير يحدث في الخلايا البشرية. تشير ميثيلات الحمض النووي إلى ارتباط مجموعات الميثيل بمخلفات السيتوزين في dinucleotides CpG. وعادة ما توجد هذه dinucleotides في مجموعات (جزر CpG) في منطقة 5 'من الجينات1. في الخلايا الطبيعية ، توجد معظم هذه الدينوكليوتيدات في حالة غير ميثيلية ، مما يسمح بتدوين الحمض النووي. وبالمناسبة، ترتبط العديد من أنواع السرطان مع جزر CpG hypermethylated وإسكات النسخ2، وخاصة في الجينات مثبطة الورم، والتي بدورها تسهم في السمات المختلفة للسرطان3.
ومن ناحية أخرى، فإن العناصر النووية التي تتخللها طويلاً - 1 (LINE-1s أو L1s) هي عناصر متكررة وقابلة للتبديل في الحمض النووي تتسم عادة بمستويات عالية من الميثيل في جزر CpG. ميثيل LINE-1 يمنع نقل ويساعد على الحفاظ على سلامة الجينوم. في عدة أنواع من السرطان ، هو hypomethylated LINE-1 ، مما يؤدي إلى التنشيط وعدم الاستقرار الكروموسومي بوساطة الرجعيةاللاحقة 4. LINE-1 يمثل ما يقرب من 17٪ من الجينوم البشري5، وحالة الميثيل قد تكون بمثابة مؤشر على مستويات مثيلة الجينوم العالمية6. ويعتبر نقص الميثيل العالمي LINE-1 أن تسبق انتقال الخلايا إلى النمط الظاهري الورم7; ولذلك، فإنه يحمل الوعد كعلامة محتملة لظهور السرطان في وقت مبكر.
حاليا، هناك عدة طرق لتحليل الميثيل، بما في ذلك التسلسل الحراري، PCR الميثيل محددة، microarrays، والهطول المناعي الكروماتين1. كما أتاح استخدام الجيل التالي من التسلسل إدراج نُهج على نطاق الجينوم للكشف عن ميثيل الحمض النووي. ويعتمد العديد من هذه الطرق على الحمض النووي المعالج ببسلفيت، حيث يتم تحويل السيتوسينات غير الميثيلية إلى الأوراسيل وتبقى السيتوسينات الميثيلية دون تغيير. ومع ذلك ، فإن العمل مع الحمض النووي المعالج ببيسلفيت له العديد من المزالق ، مثل التحويلات غير الكاملة للسيتوسائبين غير الميثيلية إلى uracil ، والتضخيم المتحيز للتسلسل ، وأخطاء التسلسل8.
في تضخيم المسبار الخاص بالميثيل (MSPA) ، تستهدف المسابير المكونة من اثنين من oligonucleotides تسلسل الحمض النووي الذي يحتوي على موقع تقييد (GCGC) لإنزيم تقييد HhaI9الحساس للمثيلة . بعد أن يتم تهجين المجسات إلى الحمض النووي، تنقسم كل عينة إلى مجموعتين. تخضع المسابير في المجموعة الأولى للربط ، في حين تخضع المسابير في المجموعة الثانية للربط تليها هضم HhaI-بوساطة في مواقع CGCG غير ميثيلية. ثم يتم تضخيم كل من مجموعات العينات عن طريق PCR، ويتم فصل المنتجات عن طريق الكهربية الشعرية. يتم هضم المسابير في المواقع غير المثيلة بواسطة HhaI ولا يتم تضخيمها أثناء PCR ، مما يؤدي إلى عدم وجود إشارات الذروة. وعلى النقيض من ذلك، فإن المسابير في المواقع المثيلة محمية من الهضم وبالتالي يتم تضخيمها أثناء PCR، مما يولد فيما بعد إشارات الذروة10.
MSPA لديها العديد من المزايا على الأساليب البديلة. أولاً، يتطلب كمية منخفضة من الحمض النووي (50-100 نانوغرام) وهو مناسب تمامًا لتحليل الحمض النووي من عينات البارافين المضمنة المثبتة على الفورين10. فإنه لا يتطلب الحمض النووي البسولفيت المعالجة; في الواقع، هو غير مناسب للحمض النووي الذي يتم تعديله بهذه الطريقة. ويمكن تحليل العديد من العينات في نفس الوقت، ويمكن تصميم مسابير MSPA بحيث تستهدف جينات أو تسلسلات متعددة في وقت واحد. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المسابر محددة وحساسة للحمض النووي الميثيلي حيث يتوافق موقع تقييد HhaI مع تسلسل نموذجي لجزر CpG10.
بحثت هذه الدراسة آثار الفسيخ اتوستيساركوما (OS) المشتقة خارج الخلية (EVs) على مثيلة LINE-1 في الخلايا الجذعية المتوسطة المشتقة من الأنسجة الدهنية (AT-MSCs؛ الشكل 1). المركبات الكهربائية هي نانوية الحجم، حويصلات مرتبطة بالأغشية تفرزها معظم أنواع الخلايا. أنها تحمل البروتينات والدهون والحمض النووي الريبي وميكرورنا، وجزيئات إضافية من الخلايا الأم11،12. المركبات التوسط الاتصالات بين الخلايا وتلعب أدوارا هامة في العديد من الظروف الفيزيولوجية المرضية13،14. أظهرت دراسة حديثة أن المركبات الكهربائية المشتقة من السرطان قد تنقل LINE-1 النشط إلى الخلايا المتلقية15. وقد أفيد في وقت سابق أن المركبات الكهربائية من خط الخلية HOS-143B يمكن أن تغير حالة الميثيل من LINE-1 في MSCs، بالإضافة إلى الآثار الوراثية الأخرى16.
عند نمو الخلايا لعزل EV ، من المهم استخدام مصل الأبقار الجنينالمستنفد EV [FBS] في وسط النمو ، لأن المركبات الكهربائية المشتقة من FBS قد تتداخل مع المركبات الكهربائية من مصادر أخرى وتعوق النتائج17،18. Ultracentrifugation هي واحدة من الطرق الأكثر شيوعا لاستنفاد السيارات الكهربائية من FBS. وهو إجراء بسيط نسبيا وفعالة من حيث التكلفة بالمقارنة مع بدائل مثل الترشيح الفائق والتجارية EV-المستنفدة FBS19. هنا ، يوضح البروتوكول أيضًا كيفية إعداد FBS المستنفد ة EV عن طريق التضاريس.
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا مفصلًا للتقنيات المذكورة أعلاه ، من عزل المركبات الكهربائية من خط خلية نظام التشغيل إلى تحليل الميثيل من LINE-1 في OS-EV MSCs المعالجة(الشكل 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+01T1</td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>MSC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3730XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BlueStar Prestained Protein Marker</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>MWP03</td>
			<td>WB: protein marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin (clone C5C9)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2679</td>
			<td>WB, dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 (clone H5C6)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556019</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5703000010</td>
			<td>For conditioned media and cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810000010</td>
			<td>For spinning down 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>331374</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 + GlutaMAX medium</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>For AT-MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneScan 500 LIZ size standard</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4322682</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WGA2-10RXN</td>
			<td>for MSPA negative control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Di formamide</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4311320</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOS-143B cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-8303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp70 (clone 5G10)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554243</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-mouse</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32210</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-rabbit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LINE-1 probe-mix primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Sequences in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4306737</td>
			<td>also requires sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td>measure protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniProtean TGX 10% gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1034</td>
			<td>WB: gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM14C</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>WB: protein transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue XS</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740901.50</td>
			<td>for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>WB: blocking, antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Antibiotics for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tube, 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431064</td>
			<td>For storing Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-11015</td>
			<td>WB: total protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RKO cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2577</td>
			<td>for MSPA positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 + GlutaMAX</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>61870-010</td>
			<td>For HOS-143B cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA HhaI enzyme</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>SMR50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA reagent kit</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>EK1-FAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA P300 probe-mix</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>P300-100R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging rotor SW-28</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342207</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>FPE-204-030</td>
			<td>sterile filtering FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai 12</td>
			<td>FEI Company</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Gatan Orius SC 
			1000B CCD-camera 
			(Gatan Inc., USA); for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS, 1X tablets</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-7500-100</td>
			<td>WB: buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>WB: transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TCA0096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>for trypsinization of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 (clone 4A10)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB2702167</td>
			<td>WB, dilution 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles

تضخيم مسبار خاص بالميثيل (MSPA) هو تقنية بسيطة وقوية يمكن استخدامها للكشف عن الاختلافات النسبية في مستويات الميثيل لعينات الحمض النووي. فمن الحيلة، ويتطلب كميات صغيرة من الحمض النووي، ويأخذ حوالي 4-5 ساعة من العمل العملي على. في التقنية المعروضة ، يتم تشويه عينات الحمض النووي أولاً ثم يتم هجينها إلى تحقيقات تستهدف الحمض النووي في مواقع الميثيل أو المواقع المرجعية كتحكم. يتم فصل الحمض النووي المهجن إلى ردود فعل متوازية ، واحدة تخضع لربط فقط والأخرى تخضع للربط تليها هضم HhaI-بوساطة في تسلسل GCGC غير الميثيلي. يتم تضخيم شظايا الحمض النووي الناتجة عن ذلك بواسطة PCR وفصلها بواسطة الكهربية الشعرية. لا يتم هضم مواقع GCGC الميثيلية بواسطة HhaI وتنتج إشارات الذروة ، في حين يتم هضم مواقع GCGC غير المثيلة ولا يتم إنشاء إشارات الذروة. مقارنة قمم التحكم تطبيع الإصدارات المهضومة وغير المهضومة من كل عينة يوفر نسبة جرعة الميثيل من عينة الحمض النووي. هنا ، يستخدم MSPA للكشف عن آثار الحويصلات خارج الخلية المستمدة من العظام (EVs) على حالة الميثيل للعنصر النووي - 1 (LINE-1) في الخلايا الجذعية المتوسطة. LINE-1s هي عناصر الحمض النووي المتكررة التي عادة ما تخضع لنقص الميثيل في السرطان، وبهذه الصفة، يمكن أن تكون بمثابة علامة بيولوجية. كما يستخدم التضاريس كأسلوب فعال من حيث التكلفة لفصل الحويصلات خارج الخلية عن السوائل البيولوجية (أي عند إعداد مصل الأبقار الجنيني المستنفد EV-DEPLETD [FBS] وعزل المركبات الكهربائية من هشاشة العظام وسائل الإعلام المكيفة [centrifugation التفاضلية]). ولتحليل المثيلة، تم تصميم مسابير LINE-1 المخصصة لاستهداف ثلاثة مواقع للمثيلة في تسلسل مروج LINE-1 وسبعة مواقع تحكم. يوضح هذا البروتوكول استخدام MSPA لتحليل مثيلة LINE-1 ويصف إعداد FBS المستنفدة EV عن طريق التضاريس.

وكان الهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو تقييم الآثار اللاجينية لنظام التشغيل -EVs على MSCs. تم عزل OS-EVs من خلايا HOS-143B باستخدام طريقة الطرد المركزي التفاضلية القياسية. التعبير عن علامات EV النموذجية CD63، Hsp70، وTSG101 من قبل النشاف الغربي أكد وجود OS-EVs. (الشكل2أ). وأشار عدم وجود إش?...

Watch this Scientific Journal Video about LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles at JoVE.com

LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

وصف هنا هو استخدام طريقة تضخيم مسبار خاص بالميثيل لتحليل مستويات الميثيل من عناصر LINE-1 في الخلايا الجذعية المتوسطة المعالجة بالحويصلات خارج الخلية المشتقة من عظم العظم. كما يتم إظهار التّيسق، وهو إجراء شائع لفصل الحويصلات خارج الخلية عن مصل الأبقار الجنينية.

LINE-1 تحليل الميثيل في الخلايا الجذعية Mesenchymal تعامل مع الحويصلات خارج الخلية المستمدة من العظام

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of ...

ميثيل الحمض النووي هو واحد من أكثر التواقيع اللاجينية دراسة. يتميز العديد من أنواع السرطان بالتغيرات في مستويات ميَلَل الحمض النووي، والتي ترتبط بتعبيرات جينية شاذة وغير ذلك من التشوهات الجينومية. والعناصر النووية الطويلة المتخللة هي متواليات جينومية متكررة قابلة للنقل عادة ما تكون فيها مستويات عالية من المثيلات.ومع ذلك ، فإنها غالبا ما تصبح فرط thmethylated في السرطان ، مما يؤدي إلى تنشيطها ويؤدي إلى عدم الاستقرار في الكروموسومات. في هذه الدراسة، عالجنا الخلايا الجذعية السيسينشيمالية مع الخلايا خارج الخلية المشتقة من العظام لمعرفة ما إذا كانت المركبات الكهربائية السرطانية يمكن أن تؤثر على ميثيل LINE-1 في MECs. يحتوي مصل الأبقار الجنيني، الذي يعد مكونًا أساسيًا من وسائل بث الخلايا الثديية، على عدد كبير من المركبات الكهربائية المشتقة من الأبقار.هذه Evs سوف تتداخل مع تحليل EVS من الخلايا التي تهمنا ، وبالتالي ، عندما تنمو الخلايا لعزل EV ، من المهم استخدام EV - استنفاد FBS. تأخذ FBS في أنابيب فائقة التركيز ووضعها في دلاء فائقة التركيز. تحقيق التوازن بين الدلاء إلى داخل 10 ملليغرام من بعضها البعض قبل تحميلها على الدوار يتأرجح.ضع الدوار في الطارد الفائق الحرارة وقم بتشغيله على 100، 000 غ لمدة 19 ساعة عند أربع درجات مئوية. بعد المدى، وجمع بعناية الطبقة العليا الملونة الخفيفة من عظمى ونقلها إلى أنبوب 50 ملليلتر. لا تزعج أو pipet بيليه البني الداكن لأنه يحتوي على EVs من FBS.تمرير عظمى من خلال مرشح 0.22 ميكرون في أنبوب جديد 50 ملليلتر. هذا تصفية تعقيم، EV- استنفاد FBS يمكن الآن أن تضاف إلى وسائل الإعلام ثقافة الخلية عند تزايد الخلايا لعزلة EV. جمع وسائل الإعلام مشروط من خلايا osteosarcoma التي تزرع في وسائل الإعلام EV المنضب.لإزالة الخلايا ومخلفات الخلايا، الطرد المركزي وسائل الإعلام مكيفة في 2500 G لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية. نقل supernatant إلى أنابيب فائقة التركيز والتوازن بينهما كما في وقت سابق. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 100،000 G لمدة ساعتين في أربع درجات مئوية.تجاهل بعناية supernatant ترك حوالي ملليلتر واحد في الجزء السفلي. إضافة حوالي 20 ملليلتر من برنامج تلفزيوني إلى أنبوب و pipet بلطف من أجل غسل وإعادة تعليق بيليه EV. تحقيق التوازن بين الأنابيب وتنفيذ جولة أخرى من الطرد فائقة التركيز مع نفس الإعدادات.إزالة بعناية فائقة وإعادة تعليق بيليه EV في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عن طريق الأنابيب لطيف. تخزين المركبات الكهربائية في أنابيب منخفضة الربط. وتتميز المركبات الكهربائية النقية من قبل غرب النشاف، تحليل تتبع الجسيمات النانوية، والمجهر الإلكترون انتقال.لوحة 15، 000 MSCs في بئر في لوحة 24 جيدا. بعد 24 ساعة، وإزالة وسائل الإعلام القديمة، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، وتغيير وسائل الاعلام EV المنضب. علاج الخلايا التي تحتوي على نظام التشغيل -EVs في نقاط الوقت المجدولة.بعد إيقاف العلاج EV، استخراج الحمض النووي من الخلايا باستخدام طريقة مناسبة. لتحليل الميثيل، استخدمنا طريقة تضخيم مسبار مخصص الميثيليشن. صمم مسبار LINE-1 المخصص، كما كان عليه الحال من قبل، من قبل بافيتشي وغيرها.بالنسبة لمسبارات المثيلات، حدد ثلاثة تسلسلات تحتوي على موقع تقييد HhaI داخل منطقة المروج. بالنسبة إلى تحقيقات التحكم، حدد سبعة تسلسلات تفتقر إلى موقع تقييد HhaI من بقية تسلسل LINE-1. تمييع 70 نانوغرام من عينة الحمض النووي في عازلة TE إلى خمسة ميكرولترات.سخني العينات لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 98 درجة مئوية ثم تبرد إلى 25 درجة مئوية. إضافة ثلاثة ميكروليترات من مزيج التهجين التحقيق إلى كل عينة وتشغيل ثيرموساير للسماح للتحقيقات إلى التهجين إلى الحمض النووي. في درجة حرارة الغرفة، إضافة 30 ميكرولترات من مزيج ما بعد التهجين لكل عينة.نقل 10 ميكروليتر إلى أنبوب ثان. ضع كلتا المجموعتين من الأنابيب في الدراجات الحرارية واحتضانها عند درجة حرارة 48 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة على الأقل. في حين أن العينات هي في 48 درجة مئوية، إضافة 10 ميكرولترات من مزيج الربط إلى المجموعة الأولى من الأنابيب و 10 ميكرولترات من مزيج الربط الهضم إلى المجموعة الثانية من الأنابيب.تشغيل برنامج thermocylcer المقبل. ثم، تدور أسفل الأنابيب وتعيين في وقت واحد من الحرارية إلى 72 درجة مئوية. إضافة خمسة ميكروليترس من مزيج البوليميراز إلى كل أنبوب ووضع الأنابيب في الترموسكلاير.تشغيل برنامج PCR. أثناء تشغيل برنامج PCR، إعداد حل من formamide ملليلتر واحد يحتوي على 2.5 ميكرولترات من الحجم القياسي. Pipet 10 ميكرولترات من هذا الحل لكل صف من لوحة بصرية 96 جيدا.بعد PCR، وتمييع العينات غير المهضومة والعينات المهضومة إلى 100 إلى 110 و1 إلى 200، على التوالي في المياه النقية جدا. إضافة اثنين microliters من المنتج PCR المخفف إلى لوحة 96 جيدا. جهاز طرد مركزي في لوحة 200 G لمدة 15 إلى 20 ثانية لإزالة فقاعات الهواء.إجراء تحليل جزء من العينات بواسطة الكهرباء الشعرية. فتح نتائج الكهرباء الشعرية في برنامج تحليل electropherogram. حدد عينة وتعيين لوحة لMLPA من القائمة.انقر على لوحة واضغط على السيطرة D لتطبيق هذا الإعداد على جميع العينات. بطريقة مماثلة، قم بتعيين طريقة التحليل إلى سواتل صغيرة افتراضية لكافة العينات. حدد جميع العينات وانقر على زر التشغيل الأخضر لتشغيل التحليل، ثم حدد جميع العينات وانقر على زر الرسم البياني لتصور القمم التحقيق.تكبير منطقة الذروة للحصول على دقة أعلى من القمم الفردية. تأكد من أن جميع القمم 10 الموافق تحقيقات من المزيج مسبار LINE-1 هي المسمى. في علامة التبويب "الأنماط الجينية"، قم بتصدير النتائج بتنسيق CSV.افتح ملف CSV في برنامج تحليل بيانات وفرز البيانات في أعمدة. تسمية ثلاثة قمم موقع الميثيل استناداً إلى أحجامها. أما القمم السبع المتبقية فيتطابق مع تحقيقات التحكم.هنا نحن نستخدم خط 1 2M قمم التحقيق التي لديها حجم ما يقرب من 117 أزواج قاعدة. لكل عينة، حساب مساحة ذروة المجموع من جميع قمم التحكم السبعة. قسم مساحة الذروة لكل مسبار LINE-1 بهذا المجموع.لكل عينة, تقسيم قيمة العينة هضم على ذلك من العينة غير مهضومة للحصول على نسبة جرعة الميثيل. وأكد التحليل الغربي النشاف وجود نظام التشغيل-المركبات الكهربائية مع إشارات لوحظ لSSG101، HSP70، وD63. ويشير غياب إشارة الكالين إلى أن عينة EV كانت نقية.لوحظت إشارة إضافية من النقاء مع TEM مع vesicles سليمة من مختلف الأحجام الموجودة في نموذج OS-EV. تم قياس تركيز الجسيمات OS-EV وتوزيع الحجم بواسطة NTA. 80٪ من المركبات الكهربائية كانت في نطاق حجم 50 إلى 200 نانومتر.هنا يمكننا أن نرى نسب جرعة المثيل من LINE-1 من MSCs في نقاط زمنية مختلفة من العلاج EV. يمثل الخط الرمادي مستوى المثيل الأساسي من نقطة الزمن صفر. في الوقت الثالث، هناك انخفاض في متوسط نسبة جرعة الميثيل بعد إدارة المركبات الكهربائية، مما يدل على hypermethylation.هذا تأثير فرط الحساسية للمركبات الكهربائية أقل وضوحًا عند النقطة السابعة. هنا أظهرنا تقنية بسيطة وحساسة للغاية وقوية لتحليل المثيلات. وهو يتطلب كمية منخفضة من الحمض النووي مع عدم وجود تحويل ثنائي الفيتيت المعنية، كما أنه مناسب للحمض النووي المعزول عن العينات المضمّنة من البارافين.الطريقة كلها ، مع الأجزاء التجريبية والتحليلية ، تستغرق حوالي يومين. ونظراً لعدد نسخة عالية من LINE-1 في الجينوم، فإن نموذج خط الخط -1 خط الأساس مرتفع في العينات العادية. ولذلك، فإن الاختلافات في مستويات المثيل من العينات، كما لوحظ مع هذه الطريقة، قد تكون خفية.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

استخدام المستحثة الجسدية التحليل القطاعي (ISSA) لدراسة الجينات والمروجين المشاركة في تشكيل الخشب والتنمية الجذعية الثانوية

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

هندسة العوامل الاصطناعي للتلاعب على وجه التحديد الربط البديل في الخلايا البشرية

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

تحليل البروتينات ملزم كاب في خلايا الإنسان تتعرض لظروف الأوكسجين فسيولوجية

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

تحليل شامل للحمض النووي باستخدام طريقة ميثيل-كبغ الملزمة القائمة على الالتقاط في مرضى سرطان الدم الليمفاوي المزمن

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

إيمونوستينينج لإدخال تعديلات على الحمض النووي: التحليل الحسابي للصور [كنفوكل]

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

تعزيز الجينوم التحرير مع ريبونوكليوبروتين Cas9 في مختلف الخلايا والكائنات الحية

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

منهجية للكشف عن دقة مثلايشن الحمض النووي

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

البروتين الذاتية في الإنسان التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent باستخدام كريسبر/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

تحديد الأحداث جزئ مثلى في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام النشاف الجنوبي وتفاعل البوليميراز المتسلسل

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...