Name: line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles
Uploaded: 2020-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af projektfinansiering fra University of Helsinki (WBS490302, WBS73714112) Helsinki Universitetshospital Statsmidler til sundhedsforskning på universitetsniveau (Y1014SUL05, TYH2016130), finsk-norsk medical foundation og Selma og Maja-Lisa Selander Fonden (Minerva Foundation). Vi takker Walter Pavicic for at levere den modificerede MSPA protokol og for relateret teknisk support. Vi er taknemmelige for Teemu Masalin (Helsinki Universitet) for at hjælpe os med videoproduktion.

Denne undersøgelse blev godkendt af Den Etiske Komité i Helsinki og Uusimaa Hospital District (etisk godkendelse D. 217/13/03/02/2015).
1. Forberedelse af EV-forarmet FBS ved ultracentrifugation
<ol><li>Tag FBS i (ultra)centrifuge rør og læg dem i ultracentrifuge spande. For at sikre, at ultracentrifugationen kører problemfrit og sikkert, skal du afbalancere spandene inden for 10 mg af hinanden.</li>
	<li>Læg spandene på en svingende rotor (type SW28, k-faktor 246). Rotoren anbringes ...

<ol>
	<li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenomics:+DNA+methylomes+and+histone-modification+maps.">Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).</li><li>Herman, J. G., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+cancer+in+association+with+promoter+hypermethylation.">Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation.</a> New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+Cancer:+The+Next+Generation.">Hallmarks of Cancer: The Next Generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+transposition+of+endogenous+retroviral+elements+in+hypomethylation+induced+tumors+in+mice.">Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice.</a> Oncogene. 27, 404-408 (2008).</li><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome.">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409, 860-921 (2001).</li><li>Rodriguez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+instability+correlates+with+genome-wide+DNA+demethylation+in+human+primary+colorectal+cancers.">Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers.</a> Cancer Research. 66, 8462 (2006).</li><li>Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetic+progenitor+origin+of+human+cancer.">The epigenetic progenitor origin of human cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).</li><li>Bock, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiQ+Analyzer:+visualization+and+quality+control+for+DNA+methylation+data+from+bisulfite+sequencing.">BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing.</a> Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).</li><li>Schouten, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+quantification+of+40+nucleic+acid+sequences+by+multiplex+ligation-dependent+probe+amplification.">Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification.</a> Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).</li><li>Nygren, A. O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation-Specific+MLPA+(MS-MLPA):+simultaneous+detection+of+CpG+methylation+and+copy+number+changes+of+up+to+40+sequences.">Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences.</a> Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).</li><li>El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).</li><li>Vallabhaneni, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+bone+marrow+mesenchymal+stem/stromal+cells+transport+tumor+regulatory+microRNA,+proteins,+and+metabolites.">Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites.</a> Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).</li><li>Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-+derived+microvesicles:+important+and+underappreciated+mediators+of+cell-to-cell+communication.">Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication.</a> Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).</li><li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+as+mediators+of+intercellular+communication+in+cancer-+the+emerging+science+of+cellular+"debris".">Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris".</a> Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).</li><li>Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+mediate+the+horizontal+transfer+of+an+active+LINE-1+retrotransposon.">Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).</li><li>Mannerstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+alterations+in+mesenchymal+stem+cells+by+osteosarcoma-derived+extracellular+vesicles.">Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles.</a> Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).</li><li>Shelke, G. V., L&#228;sser, C., Gho, Y. S., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+exosome+depletion+protocols+to+eliminate+functional+and+RNA-containing+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).</li><li>Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+bovine+serum+RNA+interferes+with+the+cell+culture+derived+extracellular+RNA.">Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA.</a> Scientific Reports. 6, 31175 (2016).</li><li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).</li><li>Puhka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+profiling+of+extracellular+vesicles+and+alternative+normalization+methods+reveal+enriched+metabolites+and+strategies+to+study+prostate+cancer-related+changes.">Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes.</a> Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).</li><li>Peltoniemi, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+enrichment+does+not+warrant+a+higher+graft+survival+in+lipofilling+of+the+breast:+A+prospective+comparative+study.">Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study.</a> Journal of Plastic, Reconstructive &amp; Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).</li><li>Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltom&#228;ki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE-1+hypomethylation+in+familial+and+sporadic+cancer.">LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer.</a> Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).</li><li>. L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2) Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269</a> (2000)</li><li>Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland Available from: <a target="_blank" href="https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes">https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes</a> (2018)</li><li>. Takara Bio Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview">https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview</a> (2018)</li><li>Pisanic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+interspersed+nuclear+element+1+retrotransposons+become+deregulated+during+the+development+of+ovarian+cancer+precursor+lesions.">Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions.</a> The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).</li></ol>

Denne undersøgelse illustrerer, hvordan MSPA kan anvendes til at detektere og kvantificere methyleringsstatus for et bestemt genetisk element. LINE-1 var i fokus her, men sonderne kan designes til at målrette en række gener og sekvenser. Desuden er der en voksende liste af sonde blandinger til rådighed for forskellige applikationer. MSPA er en enkel og robust teknik til DNA-methyleringsanalyse, der ikke kræver bisulfitomdannelse10. Den komplette procedure fra prøveforberedelse til dataanalys...

DNA methylering er en større epigenetisk modifikation forekommer i humane celler. DNA-methylering henviser til sammenkædning af methylgrupper med cytosinrester i CpG dinucleotider. Sådanne dinucleotider findes normalt i klynger (CpG-øer) på 5 ' region af gener1. I normale celler findes de fleste af disse dinucleotider i en umethyleret tilstand, som tillader DNA transskription. I øvrigt, mange kræftformer er forbundet med hypermethylerede CpG øer og transskriptorisk hæmning2, især i tumor suppressor gener, som igen bidrager til forskellige kendetegnende for kræft3.
På den anden side er lange interspersed nukleare elementer-1 (LINE-1s eller L1s) gentagne, transposable DNA-elementer, der normalt har høje niveauer af methylering på CpG øer. Methylering af LINE-1 forhindrer translokation og hjælper med at opretholde genomintegriteten. I flere typer af kræft, LINE-1 er hypomethylated, resulterer i aktivering og efterfølgende retrogennemførelse-medieret kromosomale ustabilitet4. LINE-1 tegner sig for næsten 17 % af det menneskelige genom5, og dets methyleringsstatus kan tjene som indikator for det globale genomiske methyleringsniveau6. Global LINE-1 hypomethylation anses for at gå forud for overgangen af celler til en tumor fænotype7; derfor, det holder løfte som en potentiel markør for tidlig kræft debut.
I øjeblikket er der flere metoder til methylering analyse, herunder pyrosequencing, methylering-specifikke PCR, mikroarrays, og kromatin immunudfældning1. Brugen af næste generations sekventering har også gjort det muligt at indarbejde genombrede tilgange til påvisning af DNA-methylering. Mange af disse metoder er afhængige af bisulfit-behandlet DNA, hvor umethylerede cytosiner omdannes til uracil og methylerede cytosiner forbliver uændrede. Men, arbejder med bisulfit-behandlet DNA har flere faldgruber, såsom ufuldstændige konverteringer af umethylerede cytosiner til uracil, forudindtaget forstærkning af sekvenser, og sekventering fejl8.
I methyleringsspecifik sondeforstærkning (MSPA) er sonder, der består af to oligonucleotider, rettet mod DNA-sekvenser, der indeholder et restriktionssted (GCGC) for det methyleringsfølsomme restriktionsenzym HhaI9. Når sonderne hybridiserer til DNA, opdeles hver prøve i to sæt. Sonder i første sæt gennemgåligation, mens sonder i andet sæt gennemgå ligation efterfulgt af HhaI-medieret fordøjelse på umethylerede CGCG steder. Begge sæt prøver forstærkes derefter af PCR, og produkterne adskilles af kapillær elektroforese. Sonder på umethylerede steder fordøjes af HhaI og forstærkes ikke under PCR, hvilket resulterer i ingen spidsbelastningssignaler. Derimod er sonder på methylerede steder beskyttet mod fordøjelsen og forstærkes derfor under PCR og genererer efterfølgende spidssignaler10.
MSPA har flere fordele i forhold til alternative metoder. For det første kræver det en lav mængde DNA (50-100 ng) og er velegnet til analyse af DNA fra formalin-faste paraffin indlejrede prøver10. Det kræver ikke bisulfit-behandlet DNA; faktisk er det uegnet til DNA, der er ændret på denne måde. Mange prøver kan analyseres på samme tid, og MSPA sonder kan udformes således, at de er rettet mod flere gener eller sekvenser samtidig. Derudover sonderne er specifikke og følsomme for methyleret DNA som HhaI begrænsning site svarer til en sekvens, der er typisk for CpG øer10.
Denne undersøgelse undersøgte virkningerne af osteosarkom (OS)-afledte ekstracellulære vesikler (EL)på LINE-1 methylering i fedtvævsafledte mesenkymale stamceller (AT-MSCs; Figur 1). Elbiler er nanoskala, membranbundne vesikler udskilles af de fleste celletyper. De bærer proteiner, lipider, mRNA, microRNA, og yderligere molekyler fra forældreceller11,12. El-producenter mægle intercellulære kommunikation og spiller vigtige roller i flere patofysiologiske forhold13,14. En nylig undersøgelse viste, at kræft-afledte elbiler kan overføre aktive LINE-1 til recipientceller15. Det er tidligere blevet rapporteret, at eldrevne køretøjer fra CELLElinjen HOS-143B kan ændre methyleringsstatus for LINE-1 i MSC ud over andre genetiske virkninger16.
Når der dyrkes celler til ev-isolation, er det vigtigt at anvende ev-forarmet føtal kvægserum [FBS] i vækstmediet, da FBS-afledte elbiler kan forstyrre eldrevne køretøjer fra andre kilder og hæmme resultaterne17,18. Ultracentrifugation er en af de mest almindelige metoder til udtømning af elbiler fra FBS. Det er en forholdsvis enkel og omkostningseffektiv procedure sammenlignet med alternativer som ultrafiltrering og kommerciel EV-forarmet FBS19. Her viser protokollen også, hvordan man forbereder EV-forarmet FBS ved ultracentrifugation.
Denne artikel indeholder en detaljeret protokol for ovennævnte teknikker, fra isolering af eldrevne køretøjer fra en OS-cellelinje til methyleringsanalysen af LINE-1 i OS-EV behandlede MSC 'er (figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+01T1</td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>MSC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3730XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BlueStar Prestained Protein Marker</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>MWP03</td>
			<td>WB: protein marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin (clone C5C9)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2679</td>
			<td>WB, dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 (clone H5C6)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556019</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5703000010</td>
			<td>For conditioned media and cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810000010</td>
			<td>For spinning down 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>331374</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 + GlutaMAX medium</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>For AT-MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneScan 500 LIZ size standard</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4322682</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WGA2-10RXN</td>
			<td>for MSPA negative control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Di formamide</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4311320</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOS-143B cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-8303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp70 (clone 5G10)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554243</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-mouse</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32210</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-rabbit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LINE-1 probe-mix primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Sequences in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4306737</td>
			<td>also requires sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td>measure protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniProtean TGX 10% gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1034</td>
			<td>WB: gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM14C</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>WB: protein transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue XS</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740901.50</td>
			<td>for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>WB: blocking, antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Antibiotics for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tube, 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431064</td>
			<td>For storing Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-11015</td>
			<td>WB: total protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RKO cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2577</td>
			<td>for MSPA positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 + GlutaMAX</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>61870-010</td>
			<td>For HOS-143B cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA HhaI enzyme</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>SMR50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA reagent kit</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>EK1-FAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA P300 probe-mix</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>P300-100R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging rotor SW-28</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342207</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>FPE-204-030</td>
			<td>sterile filtering FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai 12</td>
			<td>FEI Company</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Gatan Orius SC 
			1000B CCD-camera 
			(Gatan Inc., USA); for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS, 1X tablets</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-7500-100</td>
			<td>WB: buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>WB: transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TCA0096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>for trypsinization of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 (clone 4A10)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB2702167</td>
			<td>WB, dilution 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles

Methyleringsspecifik sondeforstærkning (MSPA) er en enkel og robust teknik, der kan bruges til at påvise relative forskelle i methyleringsniveauer af DNA-prøver. Det er ressourcestærke, kræver små mængder DNA, og tager omkring 4-5 h hands-on arbejde. I den præsenterede teknik, dna-prøver er først denatureret derefter hybridiseret til sonder, der er målrettet DNA på enten methylerede eller referencesteder som en kontrol. Hybridiseret DNA er opdelt i parallelle reaktioner, den ene gennemgår kun ligation og den anden gennemgår ligation efterfulgt af HhaI-medieret fordøjelse på umethylerede GCGC sekvenser. De resulterende DNA-fragmenter forstærkes af PCR og adskilles af kapillær elektroforese. Methylerede GCGC-steder fordøjes ikke af HhaI og frembringer spidssignaler, mens umethylerede GCGC-steder fordøjes, og der genereres ingen spidssignaler. Sammenligning af kontrolnormaliserede toppe af fordøjede og ufordøjede versioner af hver prøve giver methylering doseringsforholdet af en DNA-prøve. Her anvendes MSPA til at opdage virkningerne af osteosarkomafledte ekstracellulære vesikler (EL'er) på methyleringsstatus for lange interspersed nukleare element-1 (LINE-1) i mesenkymale stamceller. LINE-1s er gentagne DNA-elementer, der typisk gennemgår hypomethylation i kræft og i denne egenskab kan tjene som en biomarkør. Ultracentrifugation anvendes også som en omkostningseffektiv metode til at adskille ekstracellulære vesikler fra biologiske væsker (dvs. ved tilberedning af ev-forarmet fosterserum [FBS] og isolering af elbiler fra osteosarkombetingede medier [differentialcentrifugation]). Til methyleringsanalyse er brugerdefinerede LINE-1-sonder designet til at målrette tre methyleringsanlæg i LINE-1-promotorsekvensen og syv kontrolsteder. Denne protokol viser brugen af MSPA til LIN-1-methyleringsanalyse og beskriver præparatet ev-forarmet FBS ved ultracentrifugation.

Hovedformålet med denne undersøgelse var at evaluere os-eVs's epigenetiske virkninger på EF-pc'er. OS-E'er blev isoleret fra HOS-143B-celler ved hjælp af standardmetoden til differentieret centrifugering. Udtryk for de typiske EV markører CD63, Hsp70, og TSG101 ved vestlige blotting bekræftet tilstedeværelsen af OS-ELBILER. (Figur 2A). Fravær af calnexinsignal angivet renhed af OS-EV isolere. Der blev observeret yderligere renhedsangivelse med TEM, og intakte vesikle...

Watch this Scientific Journal Video about LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles at JoVE.com

LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

Beskrevet her er brugen af en methylering-specifik sonde forstærkning metode til at analysere methylering niveauer af LINE-1 elementer i mesenkymale stamceller behandlet med osteosarkom-afledte ekstracellulære vesikler. Ultracentrifugation, en populær procedure for adskillelse af ekstracellulære vesikler fra føtal kvægserum, er også påvist.

LINE-1 MethyleringAnalyse i mesenkymale stamceller behandlet med osteosarkom-afledte ekstracellulære vesikler

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of ...

DNA methylering er en af de mest studerede epigenetiske signaturer. Mange kræftformer er karakteriseret ved ændringer i DNA methylering niveauer, som er forbundet med afvigende genekspression og andre genomiske abnormiteter. Lange afbrudte nukleare elementer er gentagne transponerbare genomsekvenser, der normalt har høje niveauer af methylering.Men, de ofte bliver hypermethyleret i kræft, hvilket resulterer i deres aktivering og fører til kromosomal ustabilitet. I denne undersøgelse behandlede vi mesenkymale stamceller med osteosarkom-afledte ekstracellulære blærer for at se, om kræft-elbiler kan påvirke LINE-1 methylering i MEC'er. Føtalt kvægserum, som er en integreret del af dyrs cellekulturmedier, indeholder et stort antal kvægbaserede elbiler.Disse Evs vil forstyrre analysen af Evs fra celler af vores interesse, derfor, når voksende celler for EV isolation, er det vigtigt at bruge EV-forarmet FBS. Tag FBS i ultracentrifuge rør og placere dem i ultracentrifuge spande. Balance spande til inden for 10 milligram af hinanden, før du lægger dem på en svingende rotor.Placer rotoren i ultracentrifuge og køre ved 100, 000 G i 19 timer ved fire grader Celsius. Efter løbet, omhyggeligt indsamle den lyse øverste lag af supernatant og overføre det til en 50 milliliter rør. Forstyr eller rør ikke den mørkebrune pellet, da den indeholder elbiler fra FBS.Før supernatanten gennem et 0,22 mikronfilter i et nyt 50 milliliterrør. Dette filter-steriliserede, EV-forarmet FBS kan nu føjes til cellekulturmedier, når der dyrkes celler til EV-isolation. Indsamle konditionerede medier fra osteosarkomceller dyrket i EV-forarmede medier.For at fjerne celler og cellerester centrifugeres det betingede medie ved 2500 G i 20 minutter ved fire grader Celsius. Overfør supernatanten til ultracentrifuge rør og balance dem som tidligere. Centrifuge rørene ved 100,000 G i to timer ved fire grader Celsius.Kassér forsigtigt supernatanten, der efterlader omkring en milliliter i bunden. Tilsæt omkring 20 milliliter PBS til røret og pipetten forsigtigt for at vaske og re-suspendere EV pellet. Balance rørene og udføre en anden runde af ultracentrifugering med de samme indstillinger.Fjern forsigtigt supernatanten, og genspjærk EV-pellet i 200 mikroliter af PBS ved hjælp af skånsom pipettering. Opbevar eldrevne køretøjer i rør med lav binding. Renset elbiler er karakteriseret ved vestlige blotting, nanopartikel tracking analyse, og transmission elektron mikroskopi.Plade 15, 000 MSC'er pr. brønd i en 24 brøndplade. Efter 24 timer skal du fjerne gamle medier, vaske cellerne med PBS og skifte til EV-forarmet medier. Behandl celler med OS-elbiler på de planlagte tidspunkter.Når EV-behandlingen er stoppet, skal dna'et trækkes ud af cellerne ved hjælp af en passende metode. Til methyleringsanalyse brugte vi en skræddersyet methyleringsspecifik sondeforstærkningsmetode. Design de tilpassede LINE-1 sonder, som gjort tidligere, af Pavicic og andre.For methyleringssonder skal du vælge tre sekvenser, der indeholder HhaI-begrænsningsstedet i promotorområdet. For kontrolsonder skal du vælge syv sekvenser, der mangler HhaI-begrænsningsstedet fra resten af LINE-1-sekvensen. Fortyndes 70 nanogram DNA-prøve i TE-buffer til fem mikroliter.Varm prøverne i 10 minutter ved 98 grader Celsius derefter afkøles til 25 grader Celsius. Tilføj tre mikroliter af sonde hybridisering mix til hver prøve og køre thermocycler at tillade sonderne at hybridisere til DNA. Ved stuetemperatur tilsættes 30 mikroliter post-hybridiseringsblanding til hver prøve.Overfør 10 mikroliter til et andet rør. Placer begge sæt rør i termocyren og inkuberes ved 48 grader Celsius i mindst et minut. Mens prøverne er på 48 grader Celsius, tilsættes 10 mikroliter af ligation mix til det første sæt af rør og 10 mikroliter af ligation-fordøjelse mix til det andet sæt af rør.Kør det næste termocylcer-program. Drej derefter rørene ned og sæt samtidig termocyren til 72 grader Celsius. Tilføj fem mikroliter af polymerase mix til hvert rør og læg rørene i termocyren.Kør PCR-programmet. Mens PCR-programmet kører, skal du forberede en opløsning af en millilitermamid, der indeholder 2,5 mikroliter af størrelsesstandard. Pipet 10 mikroliter af denne løsning til hver række af en optisk 96 brøndplade.Efter PCR fortyndes de ufordøjede og fordøjede prøver til henholdsvis et til et hundrede og et til to hundrede, henholdsvis i ultra rent vand. Tilsæt to mikroliter af fortyndet PCR-produkt til 96 brøndpladen. Centrifuge pladen ved 200 G i 15 til 20 sekunder for at fjerne luftbobler.Der udføres fragmentanalyse af prøver med kapillær elektroforese. Åbn kapillær elektroforese resulterer i en elektroferogram analyse software. Vælg et eksempel, og indstil panelet til MLPA i menuen.Klik på panelet, og tryk på kontrolelementet D for at anvende denne indstilling på alle eksempler. På samme måde indstilles analysemetoden til mikrosatellitstandard for alle prøver. Vælg alle prøver og klik på den grønne play-knappen for at køre analyse, derefter vælge alle prøver og klik på grafen knappen for at visualisere sonden toppe.Zoom ind på topområdet for at få en højere opløsning af de enkelte toppe. Sørg for, at alle 10 toppe svarende til sonderne fra LINE-1 sondeblandingen er mærket. Eksportér resultaterne i CSV-formatet under fanen genotyper.Åbn CSV-filen i en dataanalysesoftware, og sorter dataene i kolonner. Mærk de tre toppe af methyleringsstedet baseret på deres størrelser. De resterende syv toppe svarer til kontrolsonderne.Her bruger vi LINE-1 2M sonde toppe, som har en størrelse på omkring 117 base par. For hver prøve beregnes summen af toppen af alle syv kontroltoppe. Opdel toppen af hver LINE-1-sonde med denne sum.For hver prøve divideres værdien af den fordøjede prøve med værdien af den ufordøjede prøve for at opnå methyleringsdoseringsforholdet. Western blotting analyse bekræftede tilstedeværelsen af OS-elbiler med signaler observeret for TSG101, HSP70, og CD63. Fravær af calnexinsignal indikerede, at EV-prøven var ren.Yderligere indikation af renhed blev observeret med TEM med intakte vesikler i forskellige størrelser til stede i OS-EV-prøven. OS-EV partikelkoncentration og størrelsesfordeling blev målt af NTA. 80% af eldrevne køretøjer var i størrelse på 50 til 200 nanometer.Her kan vi se methylering dosering nøgletal af LINE-1 fra MSCs på forskellige tidspunkter af EV behandling. Den grå linje repræsenterer baselinemethyleringsniveau fra tidspunkt nul. På tidspunktetspunkt tre, der er et fald i den gennemsnitlige methylering dosering ratio efter administration af elbiler, hvilket indikerer hypermethylering.Denne hypermethyleringseffekt af elvs er mindre udtalt på tidspunktet syv. Her har vi vist en enkel, meget følsom og robust teknik til methyleringsanalyse. Det kræver en lav mængde DNA uden bisulfit konvertering involveret, og det er også velegnet til DNA isoleret fra paraffin-indlejrede prøver.Hele metoden, med de eksperimentelle og analytiske dele, tager omkring to dage. På grund af et højt antal REPeteringsnummer line-1 i genomet er baselinemethyleringen af LINE-1 højt i normale prøver. Derfor kan forskellene i methylering niveauer af prøver, som observeret med denne metode, være subtile.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Brug af induceret Somatisk Sector Analysis (ISSA) for at studere Gener og Initiativtagere involveret i Wood Formation og Sekundær Stem Development

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Tekniske kunstige faktorer til specifikt manipulation af alternativ splejsning i humane celler

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analyse af Cap-bindende proteiner i Human celler udsat for Fysiologiske iltforhold

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

Omfattende DNA-methyleringsanalyse ved anvendelse af en methyl-CpG-bindingsdomæne-capture-baseret metode i patienter med kronisk lymfocytisk leukæmi

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunfarvning for DNA ændringer: beregningsmæssige analyse af Konfokal billeder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Højeffektive gen afbrydelse af Murine og menneskelige hæmatopoietisk stamceller ved CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Forbedret genom-redigering med Cas9 Ribonucleoprotein i forskellige celler og organismer

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metoder til nøjagtig detektering af mitokondrie-DNA methylering

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein Tagging i menneskelige induceret pluripotente stamceller ved hjælp af CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifikation af homologe rekombination begivenheder i mus embryonale stamceller ved hjælp af det sydlige Blotting og Polymerase kædereaktion

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...