Name: line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles
Uploaded: 2020-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door de universiteit van Helsinki projectfinanciering (WBS490302, WBS73714112) Helsinki University Hospital State financiering voor universitair gezondheidsonderzoek (Y1014SUL05, TYH2016130), Fins-Noorse Medical Foundation, en de Selma en Maja-Lisa Selander Fonds (Stichting Minerva). Wij danken Walter Pavicic voor het verstrekken van de gewijzigde MSPA protocol en voor de bijbehorende technische ondersteuning. We zijn Teemu Masalin (Universiteit van Helsinki) dankbaar dat hij ons heeft geholpen met videoproductie.

Deze studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van Helsinki en Uusimaa Hospital District (ethische goedkeuring D. 217/13/03/02/2015).
1. Voorbereiding van EV-uitgeputte FBS door ultracentrifugation
<ol><li>Neem FBS in (ultra)centrifugebuizen en plaats ze in ultracentrifugeemmers. Om ervoor te zorgen dat de ultracentrifugation soepel en veilig verloopt, balanceer t anderzijds de emmers binnen 10 mg van elkaar.</li>
	<li>Laad de emmers op een swingende rotor (type SW28, k-factor 246)....

<ol>
	<li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenomics:+DNA+methylomes+and+histone-modification+maps.">Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).</li><li>Herman, J. G., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+cancer+in+association+with+promoter+hypermethylation.">Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation.</a> New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+Cancer:+The+Next+Generation.">Hallmarks of Cancer: The Next Generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+transposition+of+endogenous+retroviral+elements+in+hypomethylation+induced+tumors+in+mice.">Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice.</a> Oncogene. 27, 404-408 (2008).</li><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome.">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409, 860-921 (2001).</li><li>Rodriguez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+instability+correlates+with+genome-wide+DNA+demethylation+in+human+primary+colorectal+cancers.">Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers.</a> Cancer Research. 66, 8462 (2006).</li><li>Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetic+progenitor+origin+of+human+cancer.">The epigenetic progenitor origin of human cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).</li><li>Bock, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiQ+Analyzer:+visualization+and+quality+control+for+DNA+methylation+data+from+bisulfite+sequencing.">BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing.</a> Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).</li><li>Schouten, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+quantification+of+40+nucleic+acid+sequences+by+multiplex+ligation-dependent+probe+amplification.">Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification.</a> Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).</li><li>Nygren, A. O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation-Specific+MLPA+(MS-MLPA):+simultaneous+detection+of+CpG+methylation+and+copy+number+changes+of+up+to+40+sequences.">Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences.</a> Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).</li><li>El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).</li><li>Vallabhaneni, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+bone+marrow+mesenchymal+stem/stromal+cells+transport+tumor+regulatory+microRNA,+proteins,+and+metabolites.">Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites.</a> Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).</li><li>Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-+derived+microvesicles:+important+and+underappreciated+mediators+of+cell-to-cell+communication.">Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication.</a> Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).</li><li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+as+mediators+of+intercellular+communication+in+cancer-+the+emerging+science+of+cellular+"debris".">Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris".</a> Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).</li><li>Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+mediate+the+horizontal+transfer+of+an+active+LINE-1+retrotransposon.">Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).</li><li>Mannerstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+alterations+in+mesenchymal+stem+cells+by+osteosarcoma-derived+extracellular+vesicles.">Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles.</a> Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).</li><li>Shelke, G. V., L&#228;sser, C., Gho, Y. S., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+exosome+depletion+protocols+to+eliminate+functional+and+RNA-containing+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).</li><li>Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+bovine+serum+RNA+interferes+with+the+cell+culture+derived+extracellular+RNA.">Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA.</a> Scientific Reports. 6, 31175 (2016).</li><li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).</li><li>Puhka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+profiling+of+extracellular+vesicles+and+alternative+normalization+methods+reveal+enriched+metabolites+and+strategies+to+study+prostate+cancer-related+changes.">Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes.</a> Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).</li><li>Peltoniemi, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+enrichment+does+not+warrant+a+higher+graft+survival+in+lipofilling+of+the+breast:+A+prospective+comparative+study.">Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study.</a> Journal of Plastic, Reconstructive &amp; Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).</li><li>Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltom&#228;ki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE-1+hypomethylation+in+familial+and+sporadic+cancer.">LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer.</a> Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).</li><li>. L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2) Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269</a> (2000)</li><li>Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland Available from: <a target="_blank" href="https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes">https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes</a> (2018)</li><li>. Takara Bio Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview">https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview</a> (2018)</li><li>Pisanic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+interspersed+nuclear+element+1+retrotransposons+become+deregulated+during+the+development+of+ovarian+cancer+precursor+lesions.">Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions.</a> The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).</li></ol>

Deze studie illustreert hoe MSPA kan worden gebruikt om de methylatiestatus van een specifiek genetisch element op te sporen en te kwantificeren. LINE-1 was hier de focus, maar de sondes kunnen worden ontworpen om een reeks genen en sequenties te richten. Bovendien is er een groeiende lijst van sondemixen beschikbaar voor verschillende toepassingen. MSPA is een eenvoudige en robuuste techniek voor DNA-methylatieanalyse die geen bisulfietconversie vereist10. De volledige procedure van monstervoorbe...

DNA-methylatie is een belangrijke epigenetische modificatie die zich in menselijke cellen. DNA-methylatie verwijst naar de koppeling van methylgroepen aan cytosineresiduen in CpG dinucleotiden. Dergelijke dinucleotiden worden meestal gevonden in clusters (CpG-eilanden) op de 5 'regio van genen1. In normale cellen bestaan de meeste van deze dinucleotiden in een niet-gemethyleerde toestand, waardoor DNA-transcriptie mogelijk is. Overigens worden veel kankers geassocieerd met hypermethylated CpG-eilanden en transcriptomic silencing2, vooral in tumorsuppressor genen, die op hun beurt bijdragen aan verschillende kenmerken van kanker3.
Aan de andere kant zijn lang gestrooide nucleaire elementen-1 (LINE-1's of L1's) repetitieve, omzetbare DNA-elementen die normaal gesproken hoge niveaus van methylatie hebben op CpG-eilanden. Methylatie van LINE-1 voorkomt translocatie en helpt de genoomintegriteit te behouden. Bij verschillende vormen van kanker wordt LINE-1 verondersteld, wat resulteert in activering en daaropvolgende retroomzetting-gemedieerde chromosomale instabiliteit4. LINE-1 is goed voor bijna 17% van het menselijk genoom5, en de methylatiestatus kan dienen als indicator van de wereldwijde genomische methylatieniveaus6. Globale LINE-1 hypomethylatie wordt geacht vooraf te gaan aan de overgang van cellen naar een tumorfenotype7; daarom, het houdt belofte als een potentiële marker voor het begin van vroege kanker.
Momenteel zijn er verschillende methoden voor methylatie-analyse, waaronder pyrosequencing, methylatie-specifieke PCR, microarrays, en chromatine immunoprecipitatie1. Het gebruik van next-generation sequencing heeft het ook mogelijk gemaakt om genoombrede benaderingen voor detectie van DNA-methylatie op te nemen. Veel van deze methoden zijn afhankelijk van bisulfiet-behandeld DNA, waarbij niet-gemethyleerde cytosinen worden omgezet in uracil en gemethyleerde cytosinen ongewijzigd blijven. Echter, het werken met bisulfiet-behandeld DNA heeft verschillende valkuilen, zoals onvolledige omzettingen van niet-gemethyleerde cytosines uracil, bevooroordeelde versterking van sequenties, en sequencing fouten8.
In methylatie-specifieke sondeversterking (MSPA) richten sondes bestaande uit twee oligonucleotiden zich op DNA-sequenties die een beperkingsplaats (GCGC) bevatten voor het methylatiegevoelige beperkingsenzym HhaI9. Nadat de sondes hybridiseren naar DNA, wordt elk monster verdeeld in twee sets. Sondes in de eerste set ondergaan ligatie, terwijl sondes in de tweede set ondergaan ligatie gevolgd door HhaI-gemedieerde spijsvertering op niet-gemethyleerde CGCG sites. Beide sets van monsters worden vervolgens versterkt door PCR, en de producten worden gescheiden door capillaire elektroforese. Sondes op niet-gemethyleerde locaties worden verteerd door HhaI en worden niet versterkt tijdens PCR, wat resulteert in geen pieksignalen. Sondes op gemethyleerde locaties zijn daarentegen beschermd tegen de spijsvertering en worden daarom versterkt tijdens PCR, waardoor pieksignalen worden opgevangen10.
MSPA heeft verschillende voordelen ten opzichte van alternatieve methoden. Ten eerste vereist het een lage hoeveelheid DNA (50-100 ng) en is het zeer geschikt voor de analyse van DNA uit formaline-vaste paraffine ingebedde monsters10. Het vereist geen bisulfiet-behandeld DNA; in feite is het ongeschikt voor DNA dat op deze manier wordt gewijzigd. Veel monsters kunnen tegelijkertijd worden geanalyseerd en MSPA-sondes kunnen zodanig worden ontworpen dat ze meerdere genen of sequenties tegelijk targeten. Bovendien zijn de sondes specifiek en gevoelig voor gemethyleerd DNA omdat de HhaI-beperkingssite overeenkomt met een sequentie die typisch is voor CpG-eilanden10.
Deze studie onderzocht de effecten van osteosarcoom (OS)-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV's) op LINE-1-methylatie in vetweefsel-afgeleide mesenchymale stamcellen (AT-MSCs; Figuur 1). EV's zijn nanoschaal, membraangebonden blaasjes die door de meeste celtypen worden afgescheiden. Ze dragen eiwitten, lipiden, mRNA, microRNA en extra moleculen uit oudercellen11,12. EV's bemiddelen intercellulaire communicatie en spelen belangrijke rollen in verschillende pathofysiologische omstandigheden13,14. Een recente studie toonde aan dat kanker-afgeleide EV's actieve LINE-1 kunnen overbrengen naar ontvanger cellen15. Eerder is gemeld dat EV's van de HOS-143B-cellijn de methylatiestatus van LINE-1 in MMC's kunnen veranderen, naast andere genetische effecten16.
Bij het kweken van cellen voor EV-isolatie is het belangrijk om EV-uitgeput foetaal runderserum [FBS] te gebruiken in het groeimedium, aangezien fbs-afgeleide EV's EV's uit andere bronnen kunnen verstoren en de resultaten kunnen belemmeren17,18. Ultracentrifugation is een van de meest voorkomende methoden voor het afbreken van EV's van FBS. Het is een relatief eenvoudige en kosteneffectieve procedure in vergelijking met alternatieven zoals ultrafiltratie en commerciële EV-uitgeputfbs19. Hier laat het protocol ook zien hoe ev-uitgeputte FBS voor te bereiden door ultracentrifugation.
Dit artikel bevat een gedetailleerd protocol voor de bovengenoemde technieken, van isolatie van EV's van een OS-cellijn tot de methylatieanalyse van LINE-1 in OS-EV behandelde MDO's (figuur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+01T1</td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>MSC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3730XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BlueStar Prestained Protein Marker</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>MWP03</td>
			<td>WB: protein marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin (clone C5C9)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2679</td>
			<td>WB, dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 (clone H5C6)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556019</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5703000010</td>
			<td>For conditioned media and cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810000010</td>
			<td>For spinning down 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>331374</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 + GlutaMAX medium</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>For AT-MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneScan 500 LIZ size standard</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4322682</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WGA2-10RXN</td>
			<td>for MSPA negative control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Di formamide</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4311320</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOS-143B cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-8303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp70 (clone 5G10)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554243</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-mouse</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32210</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-rabbit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LINE-1 probe-mix primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Sequences in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4306737</td>
			<td>also requires sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td>measure protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniProtean TGX 10% gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1034</td>
			<td>WB: gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM14C</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>WB: protein transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue XS</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740901.50</td>
			<td>for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>WB: blocking, antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Antibiotics for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tube, 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431064</td>
			<td>For storing Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-11015</td>
			<td>WB: total protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RKO cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2577</td>
			<td>for MSPA positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 + GlutaMAX</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>61870-010</td>
			<td>For HOS-143B cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA HhaI enzyme</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>SMR50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA reagent kit</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>EK1-FAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA P300 probe-mix</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>P300-100R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging rotor SW-28</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342207</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>FPE-204-030</td>
			<td>sterile filtering FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai 12</td>
			<td>FEI Company</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Gatan Orius SC 
			1000B CCD-camera 
			(Gatan Inc., USA); for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS, 1X tablets</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-7500-100</td>
			<td>WB: buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>WB: transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TCA0096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>for trypsinization of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 (clone 4A10)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB2702167</td>
			<td>WB, dilution 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles

Methylatie-specifieke sondeversterking (MSPA) is een eenvoudige en robuuste techniek die kan worden gebruikt om relatieve verschillen in methylatieniveaus van DNA-monsters te detecteren. Het is vindingrijk, vereist kleine hoeveelheden DNA, en duurt ongeveer 4-5 uur hands-on werk. In de gepresenteerde techniek worden DNA-monsters eerst gedenatureerd en vervolgens gehybridiseerd tot sondes die dna richten op gemethyleerde of referentielocaties als controle. Gehybridiseerd DNA wordt gescheiden in parallelle reacties, de ene ondergaat alleen ligatie en de andere ondergaat ligatie gevolgd door HhaI-gemedieerde spijsvertering bij niet-gemethyleerde GCGC sequenties. De resulterende DNA-fragmenten worden versterkt door PCR en gescheiden door capillaire elektroforese. Gemethyleerde GCGC-sites worden niet verteerd door HhaI en produceren pieksignalen, terwijl niet-gemethyleerde GCGC-locaties worden verteerd en er geen pieksignalen worden gegenereerd. Het vergelijken van de controle-genormaliseerde pieken van verteerd en onverteerd versies van elk monster biedt de methylatie dosering verhouding van een DNA-monster. Hier wordt MSPA gebruikt om de effecten van osteosarcoom-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV's) op de methylatiestatus van lang gestrooid nucleair element-1 (LINE-1) in mesenchymale stamcellen te detecteren. LINE-1s zijn repetitieve DNA-elementen die meestal hypomethylatie ondergaan bij kanker en, in deze hoedanigheid, kunnen dienen als biomarker. Ultracentrifugation wordt ook gebruikt als een kosteneffectieve methode om extracellulaire blaasjes te scheiden van biologische vloeistoffen (d.w.z. bij de voorbereiding van EV-uitgeput foetaal runderserum [FBS] en het isoleren van EV's van osteosarcoom geconditioneerde media [differentiële centrifugatie]). Voor methylatieanalyse zijn aangepaste LINE-1-sondes ontworpen om zich te richten op drie methylatielocaties in de LINE-1-promotorreeks en zeven controlelocaties. Dit protocol toont het gebruik van MSPA voor LINE-1 methylatieanalyse en beschrijft de voorbereiding van EV-uitgepute FBS door ultracentrifugation.

Het belangrijkste doel van deze studie was het evalueren van de epigenetische effecten van OS-EV's op MMC's. OS-EV's werden geïsoleerd van HOS-143B cellen met behulp van de standaard differentiële centrifugatie methode. Expressie van de typische EV markers CD63, Hsp70, en TSG101 door westerse blotting bevestigde de aanwezigheid van OS-EV's. (Figuur 2A). Afwezigheid van calnexin signaal aangegeven zuiverheid van de OS-EV isolaat. Bij TEM werd een aanvullende indicatie van z...

Watch this Scientific Journal Video about LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles at JoVE.com

LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

Hier beschreven is het gebruik van een methylatie-specifieke sonde versterking methode om methylatie niveaus van LINE-1 elementen te analyseren in mesenchymale stamcellen behandeld met osteosarcoom-afgeleide extracellulaire blaasjes. Ultracentrifugation, een populaire procedure voor het scheiden van extracellulaire blaasjes van foetaal runderserum, wordt ook aangetoond.

LINE-1 MethylatieAnalyse in Mesenchymale stamcellen behandeld met osteosarcoom-afgeleide extracellulaire blaasjes

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of ...

DNA-methylatie is een van de meest bestudeerde epigenetische handtekeningen. Veel kankers worden gekenmerkt door veranderingen in DNA-methylatieniveaus, die worden geassocieerd met afwijkende genexpressie en andere genomische afwijkingen. Lange gestrooide kernelementen zijn repetitieve omslagbare genomische sequenties die normaal gesproken hoge niveaus van methylatie hebben.Echter, ze worden vaak hypermethylated bij kanker, wat resulteert in hun activering en leidt tot chromosomale instabiliteit. In deze studie behandelden we mesenchymale stamcellen met osteosarcoom-afgeleide extracellulaire vesicles om te zien of kanker-EV's LINE-1-methylatie in MEC's kunnen beïnvloeden. Foetaal runderserum, dat een integraal onderdeel is van media voor de celkweek van zoogdieren, bevat een groot aantal ev's die van runderen zijn afgeleid.Deze EV's zullen interfereren met de analyse van EV's uit cellen van ons belang, daarom is het bij het kweken van cellen voor EV-isolatie belangrijk om EV-uitgeputte FBS te gebruiken. Neem FBS in ultracentrifugebuizen en plaats ze in ultracentrifugemmers. Breng de emmers in balans tot binnen 10 milligram van elkaar voordat ze op een slingerende rotor worden geladen.Plaats de rotor in de ultracentrifuge en ren op 100,000 G gedurende 19 uur op vier graden Celsius. Verzamel na de run voorzichtig de lichtgekleurde bovenste laag van de supernatant en breng deze over naar een buis van 50 milliliter. Stoor de donkerbruine pellet niet, want deze bevat EV's van FBS.Geef de supernatant door een 0,22 micron filter in een nieuwe 50 milliliter buis. Deze filter-gesteriliseerde, EV-uitgeputte FBS kan nu worden toegevoegd aan celkweek media bij het kweken van cellen voor EV isolatie. Verzamel geconditioneerde media van osteosarcoomcellen gekweekt in EV-uitgeputte media.Om cellen en celpuin te verwijderen, centrifugeren de geconditioneerde media op 2500 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Breng de supernatant over op ultracentrifugebuizen en breng ze in balans zoals eerder. Centrifugeren de buizen op 100,000 G gedurende twee uur op vier graden Celsius.Gooi voorzichtig de supernatant verlaten ongeveer een milliliter aan de onderkant. Voeg ongeveer 20 milliliter PBS toe aan de buis en pipet voorzichtig om de EV-pellet te wassen en opnieuw op te schorten. Breng de buizen in balans en voer nog een ronde ultracentrifugatie uit met dezelfde instellingen.Verwijder voorzichtig de supernatant en hang de EV-pellet opnieuw op in 200 microliter PBS door zachte pipetting. Bewaar de EV's in laagbandige buizen. Gezuiverde EV's worden gekenmerkt door westerse blotting, nanodeeltjes tracking analyse, en transmissie elektronen microscopie.Plaat 15.000 MSCs per put in een 24 putplaat. Na 24 uur, verwijder oude media, was de cellen met PBS, en over te schakelen naar EV-uitgeputte media. Behandel cellen met OS-EV's op de geplande tijdstippen.Na het stoppen van de EV-behandeling, extract DNA uit de cellen met behulp van een geschikte methode. Voor methylatieanalyse gebruikten we een op maat gemaakte methylatiespecifieke sondeversterkingsmethode. Ontwerp de aangepaste LINE-1 sondes, zoals eerder gedaan, door Pavicic en anderen.Selecteer voor methylatiesondes drie sequenties met de HhaI-beperkingsplaats binnen het promotorgebied. Voor controlesondes selecteert u zeven sequenties die de HhaI-beperkingsplaats missen uit de rest van de LINE-1-reeks. Verdun 70 nanogram DNA-monster in TE-buffer tot vijf microliter.Verwarm de monsters gedurende 10 minuten bij 98 graden Celsius en koel af tot 25 graden Celsius. Voeg drie microliters van sonde hybridisatie mix aan elk monster en voer de thermocycler om de sondes te hybridiseren naar DNA. Voeg bij kamertemperatuur 30 microliter post-hybridisatiemix toe aan elk monster.Breng 10 microliter naar een tweede buis. Plaats beide sets buizen in de thermocycler en incubeer op 48 graden Celsius gedurende ten minste een minuut. Terwijl de monsters zijn op 48 graden Celsius, voeg 10 microliter van ligatie mix aan de eerste set van buizen en 10 microliters van ligatie-spijsvertering mix aan de tweede set van buizen.Voer het volgende thermocylcer programma uit. Draai vervolgens de buizen naar beneden en stel tegelijkertijd de thermocycler in op 72 graden Celsius. Voeg vijf microliter polymerase mix toe aan elke buis en plaats de buizen in de thermocycler.Voer het PCR-programma uit. Terwijl het PCR-programma wordt uitgevoerd, bereidt u een oplossing voor van één milliliter formamide met 2,5 microliter groottestandaard. Pipet 10 microliter van deze oplossing aan elke rij van een optische 96 putplaat.Verdun na PCR de onverteerde en verteerde monsters tot respectievelijk één tot honderd en één tot tweehonderd, respectievelijk in ultrazuiver water. Voeg twee microliters van verdund PCR product aan de 96 put plaat. Centrifugeren de plaat op 200 G gedurende 15 tot 20 seconden om luchtbellen te verwijderen.Uitvoeren fragment analyse van monsters door capillaire elektroforese. Open de capillaire elektroforese resulteert in een elektroferogram analyse software. Selecteer een voorbeeld en stel het deelvenster in op MLPA in het menu.Klik op het paneel en druk op control D om deze instelling toe te passen op alle monsters. Stel op een vergelijkbare manier de analysemethode in op microsatellietstandaard voor alle monsters. Selecteer alle voorbeelden en klik op de groene afspeelknop om analyse uit te voeren, selecteer vervolgens alle monsters en klik op de grafiekknop om de sondepieppen te visualiseren.Zoom in op het piekgebied voor een hogere resolutie van de afzonderlijke pieken. Zorg ervoor dat alle 10 pieken die overeenkomen met de sondes van de LINE-1 sonde mix zijn gelabeld. Exporteer de resultaten op het tabblad genotypen in de CSV-indeling.Open het CSV-bestand in een software voor gegevensanalyse en sorteer de gegevens in kolommen. Label de drie methylatie site pieken op basis van hun maten. De resterende zeven pieken komen overeen met de controlesondes.Hier gebruiken we de LINE-1 2M sonde pieken die een grootte van ongeveer 117 basisparen hebben. Bereken voor elk monster het sompiekgebied van alle zeven controlepieken. Verdeel het piekgebied van elke LINE-1 sonde door deze som.Verdeel voor elk monster de waarde van het verteerde monster door die van het onverteerd monster om de methylatiedosatleerverhouding te verkrijgen. Westerse blotting analyse bevestigde de aanwezigheid van OS-EV's met signalen waargenomen voor TSG101, HSP70, en CD63. Afwezigheid van calnexin signaal aangegeven dat de EV monster zuiver was.Aanvullende indicatie van zuiverheid werd waargenomen met TEM met intacte piepjes van verschillende grootte aanwezig in het OS-EV monster. De OS-EV deeltjesconcentratie en grootteverdeling werd gemeten door NTA. 80% van de EV's waren in het bereik van 50 tot 200 nanometer.Hier kunnen we de methylatie doseringsverhoudingen van LINE-1 van MSCs op verschillende tijdstippen van de EV-behandeling zien. De grijze lijn vertegenwoordigt het methylatieniveau van de basislijn vanaf tijdpunt nul. Op tijdpunt drie is er een afname van de gemiddelde methylatiedoseringsverhouding na toediening van EV's, wat wijst op hypermethylatie.Dit hypermethyleende effect van de EV's is minder uitgesproken op tijdpunt zeven. Hier hebben we een eenvoudige, zeer gevoelige en robuuste techniek voor methylatieanalyse laten zien. Het vereist een lage hoeveelheid DNA zonder bisulfite conversie betrokken en het is ook geschikt voor DNA geïsoleerd van paraffine-embedded monsters.De hele methode, met de experimentele en analytische onderdelen, duurt ongeveer twee dagen. Door een hoog exemplaaraantal LINE-1 in het genoom is de uitgangsmethylatie van LINE-1 hoog in normale monsters. Daarom kunnen de verschillen in methylatieniveaus van monsters, zoals waargenomen met deze methode, subtiel zijn.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Het gebruik van Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) voor het bestuderen van genen en Promoters Betrokken bij Wood Vorming en secundaire Stem Development

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Engineering Kunstmatige Factoren om specifiek manipuleren alternatieve splitsing in menselijke cellen

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analyse van Cap-bindende eiwitten in menselijke cellen blootgesteld aan Physiological Oxygen Voorwaarden

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

Omvattende DNA-methyleringsanalyse met gebruikmaking van een methyle-CpG-bindende domein-opnamebaseerde methode bij patiënten met chronische lymfocytische leukemie

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunokleuring voor DNA wijzigingen: computationele analyse van Confocal beelden

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Verbeterde genoom bewerken met Cas9 Ribonucleoprotein in verschillende cellen en organismen

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Methodologie voor nauwkeurige detectie van mitochondriaal DNA methylatie

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene eiwit Tagging in mens geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identificatie van homologe recombinatie gebeurtenissen in muis embryonale stamcellen met behulp van Southern Blotting en de Kettingreactie van de Polymerase

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...