Name: line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles
Uploaded: 2020-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch die Projektförderung der Universität Helsinki (WBS490302, WBS73714112) gefördert. Maja-Lisa Selander Fund (Minerva Foundation). Wir danken Walter Pavicic für die Bereitstellung des modifizierten MSPA-Protokolls und für den damit verbundenen technischen Support. Wir danken Teemu Masalin (Universität Helsinki) für die Unterstützung bei der Videoproduktion.

Diese Studie wurde von der Ethikkommission von Helsinki und Uusimaa Hospital District genehmigt (ethische Zulassung D. Nr. 217/13/03/02/2015).
1. Vorbereitung von EV-erschöpftem FBS durch Ultrazentrifugation
<ol><li>Nehmen Sie FBS in (Ultra-)Zentrifugenröhren und legen Sie sie in Ultrazentrifugen-Eimer. Um sicherzustellen, dass die Ultrazentrifugation reibungslos und sicher abläuft, balancieren Sie die Eimer innerhalb von 10 mg voneinander.</li>
	<li>Laden Sie die Eimer auf einen schwinge...

<ol>
	<li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenomics:+DNA+methylomes+and+histone-modification+maps.">Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).</li><li>Herman, J. G., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+cancer+in+association+with+promoter+hypermethylation.">Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation.</a> New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+Cancer:+The+Next+Generation.">Hallmarks of Cancer: The Next Generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+transposition+of+endogenous+retroviral+elements+in+hypomethylation+induced+tumors+in+mice.">Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice.</a> Oncogene. 27, 404-408 (2008).</li><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome.">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409, 860-921 (2001).</li><li>Rodriguez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+instability+correlates+with+genome-wide+DNA+demethylation+in+human+primary+colorectal+cancers.">Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers.</a> Cancer Research. 66, 8462 (2006).</li><li>Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetic+progenitor+origin+of+human+cancer.">The epigenetic progenitor origin of human cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).</li><li>Bock, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiQ+Analyzer:+visualization+and+quality+control+for+DNA+methylation+data+from+bisulfite+sequencing.">BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing.</a> Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).</li><li>Schouten, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+quantification+of+40+nucleic+acid+sequences+by+multiplex+ligation-dependent+probe+amplification.">Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification.</a> Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).</li><li>Nygren, A. O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation-Specific+MLPA+(MS-MLPA):+simultaneous+detection+of+CpG+methylation+and+copy+number+changes+of+up+to+40+sequences.">Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences.</a> Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).</li><li>El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).</li><li>Vallabhaneni, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+bone+marrow+mesenchymal+stem/stromal+cells+transport+tumor+regulatory+microRNA,+proteins,+and+metabolites.">Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites.</a> Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).</li><li>Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-+derived+microvesicles:+important+and+underappreciated+mediators+of+cell-to-cell+communication.">Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication.</a> Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).</li><li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+as+mediators+of+intercellular+communication+in+cancer-+the+emerging+science+of+cellular+"debris".">Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris".</a> Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).</li><li>Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+mediate+the+horizontal+transfer+of+an+active+LINE-1+retrotransposon.">Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).</li><li>Mannerstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+alterations+in+mesenchymal+stem+cells+by+osteosarcoma-derived+extracellular+vesicles.">Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles.</a> Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).</li><li>Shelke, G. V., L&#228;sser, C., Gho, Y. S., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+exosome+depletion+protocols+to+eliminate+functional+and+RNA-containing+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).</li><li>Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+bovine+serum+RNA+interferes+with+the+cell+culture+derived+extracellular+RNA.">Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA.</a> Scientific Reports. 6, 31175 (2016).</li><li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).</li><li>Puhka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+profiling+of+extracellular+vesicles+and+alternative+normalization+methods+reveal+enriched+metabolites+and+strategies+to+study+prostate+cancer-related+changes.">Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes.</a> Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).</li><li>Peltoniemi, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+enrichment+does+not+warrant+a+higher+graft+survival+in+lipofilling+of+the+breast:+A+prospective+comparative+study.">Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study.</a> Journal of Plastic, Reconstructive &amp; Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).</li><li>Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltom&#228;ki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE-1+hypomethylation+in+familial+and+sporadic+cancer.">LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer.</a> Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).</li><li>. L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2) Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269</a> (2000)</li><li>Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland Available from: <a target="_blank" href="https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes">https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes</a> (2018)</li><li>. Takara Bio Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview">https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview</a> (2018)</li><li>Pisanic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+interspersed+nuclear+element+1+retrotransposons+become+deregulated+during+the+development+of+ovarian+cancer+precursor+lesions.">Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions.</a> The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).</li></ol>

Diese Studie zeigt, wie MSPA verwendet werden kann, um den Methylierungsstatus eines bestimmten genetischen Elements zu erkennen und zu quantifizieren. LINE-1 stand hier im Mittelpunkt, aber die Sonden können so konzipiert werden, dass sie auf eine Reihe von Genen und Sequenzen abzielen. Darüber hinaus gibt es eine wachsende Liste von Sondenmischungen, die für verschiedene Anwendungen verfügbar sind. MSPA ist eine einfache und robuste Technik für die DNA-Methylierungsanalyse, die keine Bisulfitumwandlung<sup class="...

DNA-Methylierung ist eine wichtige epigenetische Modifikation, die in menschlichen Zellen auftritt. DNA-Methylierung bezieht sich auf die Verknüpfung von Methylgruppen mit Zytosinrückständen in CpG-Dinukleotiden. Solche Dinukleotide finden sich in der Regel in Clustern (CpG-Inseln) in der 5' Region der Gene1. In normalen Zellen existieren die meisten dieser Dinukleotide in einem unmethylierten Zustand, der eine DNA-Transkription ermöglicht. Übrigens sind viele Krebsarten mit hypermethylierten CpG-Inseln und transkriptomischer Silencing2verbunden, insbesondere in Tumorsuppressor-Genen, die wiederum zu verschiedenen Merkmalen von Krebs beitragen3.
Andererseits sind lange durchsetzte Kernelemente-1 (LINE-1s oder L1s) repetitive, transponierbare DNA-Elemente, die normalerweise einen hohen Methylierungsgrad auf CpG-Inseln aufweisen. Die Methylierung von LINE-1 verhindert die Translokation und trägt zur Aufrechterhaltung der Genomintegrität bei. Bei mehreren Krebsarten wird LINE-1 hypomethyliert, was zu einer Aktivierung und anschließender retrotranspositionierter chromosomaler Instabilität4führt. LINE-1 macht fast 17% des menschlichen Genoms5aus, und sein Methylierungsstatus kann als Indikator für die globale genomische Methylierung6dienen. Globale LINE-1-Hypomethylierung gilt als vor dem Übergang von Zellen zu einem Tumor-Phänotyp7; daher verspricht sie als potenzieller Marker für den frühen Krebsbeginn.
Derzeit gibt es mehrere Methoden für die Methylierungsanalyse, einschließlich Pyrosequencing, methylierungsspezifischer PCR, Mikroarrays und Chromatin-Immunpräzipitation1. Die Verwendung der Sequenzierung der nächsten Generation hat es auch ermöglicht, genomweite Ansätze zum Nachweis der DNA-Methylierung zu integrieren. Viele dieser Methoden basieren auf bisulfitbehandelter DNA, bei der unmethylierte Zytosine in Uracil umgewandelt werden und methylierte Zytosine unverändert bleiben. Die Arbeit mit bisulfitbehandelter DNA hat jedoch mehrere Fallstricke, wie unvollständige Umwandlungen von nicht methylierten Zytosinen in Uracil, voreingenommene Amplifikation von Sequenzen und Sequenzierungsfehler8.
Bei der methylierungsspezifischen Sondenverstärkung (MSPA) zielen Sonden aus zwei Oligonukleotiden auf DNA-Sequenzen ab, die eine Restriktionsstelle (GCGC) für das methylierungsempfindliche Restriktionsenzym HhaI9enthalten. Nachdem die Sonden mit der DNA hybridisiert wurden, wird jede Probe in zwei Sätze unterteilt. Sonden im ersten Satz werden einer Ligation unterzogen, während Sonden im zweiten Satz einer Ligation unterzogen werden, gefolgt von der HhaI-vermittelten Verdauung an unmethylierten CGCG-Standorten. Beide Probensätze werden dann durch PCR verstärkt, und die Produkte werden durch Kapillarelektrophorese getrennt. Sonden an unmethylierten Standorten werden von HhaI verdaut und während der PCR nicht verstärkt, was zu keinen Spitzensignalen führt. Im Gegensatz dazu sind Sonden an methylierten Standorten vor der Verdauung geschützt und werden daher während der PCR verstärkt, wodurch anschließend Spitzensignale10erzeugt werden.
MSPA hat mehrere Vorteile gegenüber alternativen Methoden. Erstens benötigt es eine geringe Menge an DNA (50–100 ng) und eignet sich gut für die Analyse der DNA aus formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Proben10. Es erfordert keine Bisulfit-behandelte DNA; in der Tat, es ist ungeeignet für DNA, die auf diese Weise modifiziert wird. Viele Proben können gleichzeitig analysiert werden, und MSPA-Sonden können so konzipiert werden, dass sie mehrere Gene oder Sequenzen gleichzeitig zielen. Darüber hinaus sind die Sonden spezifisch und empfindlich für methylierte DNA, da die HhaI Restriktionsstelle einer Sequenz entspricht, die typisch für CpG-Inseln10ist.
Diese Studie untersuchte die Auswirkungen von Osteosarkom (OS)-abgeleiteten extrazellulären Vesikeln (EVs) auf die LINE-1-Methylierung in fettgewebeabgeleiteten mesenchymalen Stammzellen (AT-MSCs; Abbildung 1). Elektrofahrzeuge sind nanoskalige, membrangebundene Vesikel, die von den meisten Zelltypen abgesondert werden. Sie tragen Proteine, Lipide, mRNA, microRNA und zusätzliche Moleküle aus den Elternzellen11,12. EVs vermitteln interzelluläre Kommunikation und spielen eine wichtige Rolle bei mehreren pathophysiologischen Bedingungen13,14. Eine aktuelle Studie zeigte, dass krebsverlesene Elektrofahrzeuge aktive S.1-V1 auf Empfängerzellen übertragen können15. Es wurde bereits berichtet, dass Elektrofahrzeuge aus der HOS-143B-Zelllinie den Methylierungsstatus von LINE-1 in MSCs verändern können, zusätzlich zu anderen genetischen Effekten16.
Beim Anbau von Zellen zur EV-Isolierung ist es wichtig, EV-dezimiertes fetales Rinderserum [FBS] im Wachstumsmedium zu verwenden, da FBS-abgeleitete Elektrofahrzeuge EVs aus anderen Quellen stören und die Ergebnisse17,18behindern können. Ultrazentrifugation ist eine der häufigsten Methoden zur Erschöpfung von Elektrofahrzeugen von FBS. Es ist ein relativ einfaches und kostengünstiges Verfahren im Vergleich zu Alternativen wieUltrafiltration und kommerzielle EV-erschöpftfb19 . Hier zeigt das Protokoll auch, wie EV-erschöpfte FBS durch Ultrazentrifugation vorbereitet werden.
Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für die oben genannten Techniken vor, von der Isolierung von Elektrofahrzeugen von einer OS-Zelllinie bis zur Methylierungsanalyse von LINE-1 in OS-EV behandelten MSCs (Abbildung 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+01T1</td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>MSC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3730XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BlueStar Prestained Protein Marker</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>MWP03</td>
			<td>WB: protein marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin (clone C5C9)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2679</td>
			<td>WB, dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 (clone H5C6)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556019</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5703000010</td>
			<td>For conditioned media and cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810000010</td>
			<td>For spinning down 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>331374</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 + GlutaMAX medium</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>For AT-MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneScan 500 LIZ size standard</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4322682</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WGA2-10RXN</td>
			<td>for MSPA negative control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Di formamide</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4311320</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOS-143B cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-8303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp70 (clone 5G10)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554243</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-mouse</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32210</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-rabbit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LINE-1 probe-mix primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Sequences in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4306737</td>
			<td>also requires sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td>measure protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniProtean TGX 10% gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1034</td>
			<td>WB: gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM14C</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>WB: protein transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue XS</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740901.50</td>
			<td>for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>WB: blocking, antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Antibiotics for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tube, 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431064</td>
			<td>For storing Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-11015</td>
			<td>WB: total protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RKO cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2577</td>
			<td>for MSPA positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 + GlutaMAX</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>61870-010</td>
			<td>For HOS-143B cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA HhaI enzyme</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>SMR50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA reagent kit</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>EK1-FAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA P300 probe-mix</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>P300-100R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging rotor SW-28</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342207</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>FPE-204-030</td>
			<td>sterile filtering FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai 12</td>
			<td>FEI Company</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Gatan Orius SC 
			1000B CCD-camera 
			(Gatan Inc., USA); for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS, 1X tablets</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-7500-100</td>
			<td>WB: buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>WB: transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TCA0096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>for trypsinization of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 (clone 4A10)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB2702167</td>
			<td>WB, dilution 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles

Die Methylierungsspezifische Sondenverstärkung (MSPA) ist eine einfache und robuste Technik, mit der relative Unterschiede in den Methylierungswerten von DNA-Proben erkannt werden können. Es ist einfallsreich, erfordert kleine Mengen an DNA und dauert etwa 4-5 h hands-on Arbeit. In der vorgestellten Technik werden DNA-Proben zunächst denaturiert und dann zu Sonden hybridisiert, die entweder auf methylierte oder Referenzstellen als Kontrolle abzielen. Hybridisierte DNA wird in parallele Reaktionen getrennt, eine unterzieht sich nur ligation und die andere wird ligation, gefolgt von der HhaI-vermittelten Verdauung in nicht methylierten GCGC-Sequenzen. Die resultierenden DNA-Fragmente werden durch PCR verstärkt und durch Kapillarelektrophorese getrennt. Methylierte GCGC-Standorte werden von HhaI nicht verdaut und erzeugen Spitzensignale, während nicht methylierte GCGC-Standorte verdaut werden und keine Spitzensignale erzeugt werden. Der Vergleich der kontrollnormalisierten Spitzen verdauter und unverdauter Versionen jeder Probe ergibt das Methylierungs-Dosierungsverhältnis einer DNA-Probe. Hier wird MSPA verwendet, um die Auswirkungen von Osteosarkom-abgeleiteten extrazellulären Vesikeln (EVs) auf den Methylierungsstatus von lang durchsetzten Kernelement-1 (LINE-1) in mesenchymalen Stammzellen zu erkennen. LINE-1 sind repetitive DNA-Elemente, die typischerweise bei Krebs hypomethyliert werden und in dieser Eigenschaft als Biomarker dienen können. Ultrazentrifugation wird auch als kostengünstige Methode verwendet, um extrazelluläre Vesikel von biologischen Flüssigkeiten zu trennen (d. h. bei der Herstellung von EV-erschöpftem fetalem Rinderserum [FBS] und der Isolierung von Elektrofahrzeugen aus Osteosarkom-konditionierten Medien [Differentialzentrifugation]). Für die Methylierungsanalyse sind benutzerdefinierte LINE-1-Sonden für drei Methylierungsstandorte in der LINE-1-Promotorsequenz und sieben Kontrollstellen ausgelegt. Dieses Protokoll veranschaulicht die Verwendung von MSPA für die LINE-1-Methylierungsanalyse und beschreibt die Herstellung von EV-erschöpftem FBS durch Ultrazentrifugation.

Das Hauptziel dieser Studie war es, die epigenetischen Wirkungen von OS-EVs auf MSCs zu bewerten. OS-EVs wurden aus HOS-143B-Zellen mit der Standard-Differentialzentrifugationsmethode isoliert. Der Ausdruck der typischen EV-Marker CD63, Hsp70 und TSG101 durch Western Blotting bestätigte das Vorhandensein von OS-EVs. (Abbildung 2A). Das Fehlen eines Calnexin-Signals deutete auf die Reinheit des OS-EV-Isolats hin. Zusätzliche Reinheitsangaben wurden bei TEM beobachtet, wobei...

Watch this Scientific Journal Video about LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles at JoVE.com

LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

Beschrieben wird hier die Verwendung einer methylierungsspezifischen Sondenverstärkungsmethode zur Analyse der Methylierungvon LINE-1-Elementen in mesenchymalen Stammzellen, die mit osteosarkomabgeleiteten extrazellulären Vesikeln behandelt werden. Ultrazentrifugation, ein beliebtes Verfahren zur Trennung extrazellulärer Vesikel vom fetalen Rinderserum, wird ebenfalls demonstriert.

LINE-1 Methylierungsanalyse in mesenchymalen Stammzellen, die mit Osteosarkom-abgeleiteten extrazellulären Vesikeln behandelt werden

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of ...

DNA-Methylierung ist eine der am meisten untersuchten epigenetischen Signaturen. Viele Krebsarten sind durch Veränderungen der DNA-Methylierung gekennzeichnet, die mit aberranter Genexpression und anderen genomischen Anomalien verbunden sind. Lange durchsetzte Kernelemente sind repetitive, übertragbare genomische Sequenzen, die normalerweise einen hohen Methylierungsgrad aufweisen.Jedoch, Sie werden oft hypermethyliert bei Krebs, die in ihrer Aktivierung führen und führt zu chromosomalen Instabilität. In dieser Studie behandelten wir mesenchymale Stammzellen mit osteosarkomabgeleiteten extrazellulären Vesikeln, um zu sehen, ob Krebs-EVs die LINE-1-Methylierung in MECs beeinflussen können. Fetales Rinderserum, das ein integraler Bestandteil der Medien zur Zellkultur von Säugetieren ist, enthält eine große Anzahl von aus Rindern gewonnenen Elektrofahrzeugen.Diese Evs werden die Analyse von Evs aus Zellen von unserem Interesse stören, daher ist es beim Anbau von Zellen für die EV-Isolierung wichtig, EV-erschöpfte FBS zu verwenden. Nehmen Sie FBS in Ultrazentrifugenrohren und legen Sie sie in Ultrazentrifugen-Eimer. Balancieren Sie die Eimer auf 10 Milligramm voneinander, bevor Sie sie auf einen schwingenden Rotor laden.Den Rotor in die Ultrazentrifuge legen und bei 100.000 G 19 Stunden bei vier Grad Celsius laufen. Nach dem Lauf die hellgefärbte obere Schicht des Überstandes sorgfältig sammeln und in ein 50-Milliliter-Rohr übertragen. Stören oder pipet das dunkelbraune Pellet nicht, da es EVs von FBS enthält.Übergeben Sie den Überstand durch einen 0,22-Mikron-Filter in ein neues 50-Milliliter-Rohr. Diese filtersterilisierte, EV-erschöpfte FBS kann nun beim Anbau von Zellen für die EV-Isolierung zu Zellkulturmedien hinzugefügt werden. Sammeln Sie konditionierte Medien aus Osteosarkomzellen, die in EV-erschöpften Medien angebaut werden.Um Zellen und Zellablagerungen zu entfernen, zentrieren Sie die konditionierten Medien bei 2500 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Überstand auf Ultrazentrifugenrohre und balancieren Sie sie wie früher. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 100. 000 G für zwei Stunden bei vier Grad Celsius.Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und lassen Sie etwa einen Milliliter am Boden. Rund 20 Milliliter PBS sanft in das Rohr und die Pipette geben, um das EV-Pellet zu waschen und wieder aufzuhängen. Balancieren Sie die Rohre und führen Sie eine weitere Runde der Ultrazentrifugation mit den gleichen Einstellungen.Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und hängen Sie das EV-Pellet in 200 Mikroliter PBS durch sanftes Pipettieren wieder auf. Bewahren Sie die Elektrofahrzeuge in bindungsarmen Rohren auf. Gereinigte Elektrofahrzeuge zeichnen sich durch Western Blotting, Nanopartikel-Tracking-Analyse und Transmissionselektronenmikroskopie aus.Platte 15. 000 MSCs pro Brunnen in einer 24-Well-Platte. Nach 24 Stunden alte Medien entfernen, die Zellen mit PBS waschen und auf EV-erschöpfte Medien umstellen. Behandeln Sie Zellen mit OS-EVs zu den geplanten Zeitpunkten.Nach Beendigung der EV-Behandlung, extrahieren Sie DNA aus den Zellen mit einer geeigneten Methode. Für die Methylierungsanalyse haben wir eine maßgeschneiderte Methylierungs-spezifische Sondenverstärkungsmethode verwendet. Entwerfen Sie die maßgeschneiderten LINE-1-Sonden, wie bisher, von Pavicic und anderen.Wählen Sie für Methylierungssonden drei Sequenzen aus, die die HhaI-Einschränkungsstelle innerhalb der Förderregion enthalten. Wählen Sie für Kontrollsonden sieben Sequenzen aus, die nicht die HhaI-Einschränkungsstelle aus dem Rest der LINE-1-Sequenz fehlen. 70 Nanogramm DNA-Probe im TE-Puffer auf fünf Mikroliter verdünnen.Die Proben 10 Minuten bei 98 Grad Celsius erhitzen und dann auf 25 Grad Celsius abkühlen lassen. Fügen Sie jeder Probe drei Mikroliter Sondenhybridisierungsmix hinzu und führen Sie den Thermocycler aus, damit die Sonden mit der DNA hybridisieren können. Bei Raumtemperatur 30 Mikroliter Posthybridisierungsmischung zu jeder Probe hinzufügen.10 Mikroliter in ein zweites Rohr geben. Legen Sie beide Röhrensätze in den Thermocycler und brüten Sie mindestens eine Minute lang bei 48 Grad Celsius. Während die Proben bei 48 Grad Celsius sind, fügen Sie 10 Mikroliter Ligationsmischung in den ersten Satz von Röhren und 10 Mikroliter Ligationsverdauungsmischung zum zweiten Satz von Röhren hinzu.Führen Sie das nächste Thermocylcer-Programm aus. Dann drehen Sie die Rohre nach unten und stellen Sie gleichzeitig den Thermocycler auf 72 Grad Celsius. Fügen Sie fünf Mikroliter Polymerase-Mix zu jedem Rohr und legen Sie die Rohre in den Thermocycler.Führen Sie das PCR-Programm aus. Während das PCR-Programm läuft, bereiten Sie eine Lösung von einem Milliliter Formamid mit 2,5 Mikroliter Größenstandard vor. Pipetten Sie 10 Mikroliter dieser Lösung zu jeder Reihe einer optischen 96-Well-Platte.Nach pcR die unverdaute und die verdaute Probe auf ein bis einhunderthundert bzw. zweihundert verdünnen, bzw. in reinem Ultrawasser. Fügen Sie zwei Mikroliter verdünntes PCR-Produkt auf die 96-Well-Platte. Zentrifugieren Sie die Platte bei 200 G für 15 bis 20 Sekunden, um Luftblasen zu entfernen.Durchführung der Fragmentanalyse von Proben durch Kapillarelektrophorese. Öffnen Sie die Kapillarelektrophorese ergibt eine Elektropherogramm-Analyse-Software. Wählen Sie ein Beispiel aus, und legen Sie das Bedienfeld über das Menü auf MLPA fest.Klicken Sie auf das Bedienfeld und drücken Sie die Taste D, um diese Einstellung auf alle Proben anzuwenden. Legen Sie auf ähnliche Weise die Analysemethode für alle Proben auf Mikrosatellitenstandard fest. Wählen Sie alle Samples aus und klicken Sie auf die grüne Wiedergabeschaltfläche, um die Analyse auszuführen, dann wählen Sie alle Samples aus und klicken Sie auf die Grafikschaltfläche, um die Sondenspitzen zu visualisieren.Zoomen Sie auf den Spitzenbereich für eine höhere Auflösung der einzelnen Spitzen. Stellen Sie sicher, dass alle 10 Spitzen, die den Sonden aus dem LINE-1-Sondenmix entsprechen, beschriftet sind. Exportieren Sie die Ergebnisse auf der Registerkarte Genotypes im CSV-Format.Öffnen Sie die CSV-Datei in einer Datenanalysesoftware, und sortieren Sie die Daten in Spalten. Beschriften Sie die drei Methylierungs-Standortspitzen basierend auf ihrer Größe. Die restlichen sieben Spitzen entsprechen den Kontrollsonden.Hier verwenden wir die LINE-1 2M Sondenspitzen, die eine Größe von etwa 117 Basenpaaren haben. Berechnen Sie für jede Stichprobe die Summenspitzenfläche aller sieben Kontrollspitzen. Teilen Sie den Spitzenbereich jeder LINE-1-Sonde durch diese Summe.Teilen Sie für jede Probe den Wert der verdauten Probe durch den Wert der unverdauten Probe, um das Methylierungsdosisverhältnis zu erhalten. Die Western-Blotting-Analyse bestätigte das Vorhandensein von OS-EVs mit Signalen, die für TSG101, HSP70 und CD63 beobachtet wurden. Das Fehlen eines Calnexin-Signals deutete darauf hin, dass die EV-Probe rein war.Zusätzliche Reinheitshinweise wurden bei TEM mit intakten Vesikeln unterschiedlicher Größe in der OS-EV-Probe beobachtet. Die OS-EV Partikelkonzentration und Größenverteilung wurde mit NTA gemessen. 80 % der Elektrofahrzeuge lagen im Größenbereich von 50 bis 200 Nanometern.Hier können wir die Methylierungsdosisverhältnisse von LINE-1 von MSCs zu verschiedenen Zeitpunkten der EV-Behandlung sehen. Die graue Linie stellt den Basismethylierungsgrad ab dem ZeitpunktPunkt Null dar. Zum Zeitpunkt 3, Gibt es eine Abnahme der durchschnittlichen Methylierung DosierungVerhältnis nach der Verabreichung von Elektrofahrzeugen, wodurch Hypermethylierung.Diese hypermethylierende Wirkung der Elektrofahrzeuge ist zum Zeitpunkt 7 weniger ausgeprägt. Hier haben wir eine einfache, hochempfindliche und robuste Technik für die Methylierungsanalyse gezeigt. Es erfordert eine geringe Menge an DNA ohne Bisulfit-Umwandlung beteiligt und es ist auch für DNA aus Paraffin-eingebetteten Proben isoliert geeignet.Die gesamte Methode mit den experimentellen und analytischen Teilen dauert etwa zwei Tage. Aufgrund einer hohen Kopierzahl von LINE-1 im Genom ist die Basismethylierung von LINE-1 in normalen Proben hoch. Daher können die Unterschiede in den Methylierungsniveaus von Proben, wie bei dieser Methode beobachtet, subtil sein.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Die Verwendung von Induced Somatic Sektoranalyse (IVSS) in Holzbildung und Nebenschaft Entwicklung beteiligten Gene und Promotoren Studieren

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Forschung

Genetik

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Engineering künstliche Faktoren zur Speziellen Manipulation alternativen Spleißen in menschlichen Zellen

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analyse von Cap-bindende Proteine ​​in menschlichen Zellen zu Physiologische Sauerstoffbedingungen ausgesetzt

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

Umfassende DNA-Methylierungsanalyse unter Verwendung einer Methyl-CpG-bindenden Domänen-Capture-basierten Methode bei chronischen lymphatischen Leukämie-Patienten

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Verbesserte Genom Bearbeitung mit Cas9 Ribonucleoprotein in verschiedenen Zellen und Organismen

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Methodik für die präzise Erkennung der mitochondrialen DNA-Methylierung

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein Tagging in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifikation der homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern Blotting und Polymerase-Kettenreaktion

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...