Name: line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles
Uploaded: 2020-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles at JoVE.com

עבודה זו ממומנת על ידי אוניברסיטת הלסינקי מימון הפרויקט (WBS490302, WBS73714112) הלסינקי אוניברסיטת החולים המדינה מימון לחקר הבריאות ברמת האוניברסיטה (Y1014SUL05, TYH2016130), הקרן לרפואה פינית-נורווגית, ואת סלמה ו קרן מינרווה-ליסה סלאנדר (קרן מינרבה). אנו מודים לוולטר Pavicic על מתן פרוטוקול MSPA שהשתנה ולתמיכה טכנית קשורה. אנחנו אסירי תודה לטאמו Masalin (אוניברסיטת הלסינקי) על שסייע לנו עם הפקת וידאו.

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של הלסינקי ומחוז החולים אוסיסיאא (אישור מוסרי D. No. 217/13/03/02/2015).
1. הכנת הפבס מרוקנת על ידי הפוגות
<ol><li>לקחת FBS (אולטרה) הצינורות צנטריפוגה ולמקם אותם דליים ultracentrifuge. כדי להבטיח שהפוגות מסוימות יפעלו בצורה חלקה ובטוחה, תאזן את הדליים בתוך 10 מ"ג אחד מ...

<ol>
	<li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenomics:+DNA+methylomes+and+histone-modification+maps.">Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).</li><li>Herman, J. G., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+cancer+in+association+with+promoter+hypermethylation.">Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation.</a> New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+Cancer:+The+Next+Generation.">Hallmarks of Cancer: The Next Generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+transposition+of+endogenous+retroviral+elements+in+hypomethylation+induced+tumors+in+mice.">Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice.</a> Oncogene. 27, 404-408 (2008).</li><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome.">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409, 860-921 (2001).</li><li>Rodriguez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+instability+correlates+with+genome-wide+DNA+demethylation+in+human+primary+colorectal+cancers.">Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers.</a> Cancer Research. 66, 8462 (2006).</li><li>Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetic+progenitor+origin+of+human+cancer.">The epigenetic progenitor origin of human cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).</li><li>Bock, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiQ+Analyzer:+visualization+and+quality+control+for+DNA+methylation+data+from+bisulfite+sequencing.">BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing.</a> Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).</li><li>Schouten, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+quantification+of+40+nucleic+acid+sequences+by+multiplex+ligation-dependent+probe+amplification.">Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification.</a> Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).</li><li>Nygren, A. O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation-Specific+MLPA+(MS-MLPA):+simultaneous+detection+of+CpG+methylation+and+copy+number+changes+of+up+to+40+sequences.">Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences.</a> Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).</li><li>El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).</li><li>Vallabhaneni, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+bone+marrow+mesenchymal+stem/stromal+cells+transport+tumor+regulatory+microRNA,+proteins,+and+metabolites.">Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites.</a> Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).</li><li>Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-+derived+microvesicles:+important+and+underappreciated+mediators+of+cell-to-cell+communication.">Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication.</a> Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).</li><li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+as+mediators+of+intercellular+communication+in+cancer-+the+emerging+science+of+cellular+"debris".">Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris".</a> Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).</li><li>Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+mediate+the+horizontal+transfer+of+an+active+LINE-1+retrotransposon.">Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).</li><li>Mannerstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+alterations+in+mesenchymal+stem+cells+by+osteosarcoma-derived+extracellular+vesicles.">Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles.</a> Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).</li><li>Shelke, G. V., L&#228;sser, C., Gho, Y. S., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+exosome+depletion+protocols+to+eliminate+functional+and+RNA-containing+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).</li><li>Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+bovine+serum+RNA+interferes+with+the+cell+culture+derived+extracellular+RNA.">Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA.</a> Scientific Reports. 6, 31175 (2016).</li><li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).</li><li>Puhka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+profiling+of+extracellular+vesicles+and+alternative+normalization+methods+reveal+enriched+metabolites+and+strategies+to+study+prostate+cancer-related+changes.">Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes.</a> Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).</li><li>Peltoniemi, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+enrichment+does+not+warrant+a+higher+graft+survival+in+lipofilling+of+the+breast:+A+prospective+comparative+study.">Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study.</a> Journal of Plastic, Reconstructive &amp; Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).</li><li>Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltom&#228;ki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE-1+hypomethylation+in+familial+and+sporadic+cancer.">LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer.</a> Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).</li><li>. L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2) Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269</a> (2000)</li><li>Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland Available from: <a target="_blank" href="https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes">https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes</a> (2018)</li><li>. Takara Bio Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview">https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview</a> (2018)</li><li>Pisanic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+interspersed+nuclear+element+1+retrotransposons+become+deregulated+during+the+development+of+ovarian+cancer+precursor+lesions.">Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions.</a> The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).</li></ol>

מחקר זה ממחיש כיצד MSPA ניתן להשתמש כדי לזהות ולכמת את סטטוס מתילציה של אלמנט גנטי ספציפי. קו -1 היה המוקד כאן, אבל הגששים יכולים להיות מיועדים למקד את מגוון של גנים ורצפים. יתר על כן, יש רשימה גוברת של מתערבב בדיקה זמין עבור יישומים שונים. Mspa היא טכניקה פשוטה ואיתנה עבור ניתוח מתיונין DNA שאינו ד...

מתילציה DNA היא שינוי. משמעותי בתאי האדם DNA מתילציה מתייחס לחיבור של קבוצות מתיל לשקעים ציטוסין ב-CpG dinucleotides. בדרך כלל מצויים באשכולות (איי ה-CpG) באזור 5 ' של גנים1. בתאים נורמליים, רוב הדיקלאוסים האלה קיימים במצב לא מתילנטי, המאפשר תמלול של דנ א. אגב, סרטן רבים קשורים באיים ה-CpG היפרמתיל והשתקה של2, בעיקר בגנים מדכא הגידול, אשר בתורו לתרום הסימנים השונים של סרטן3.
מצד שני, הרבה מרכיבים גרעיניים שונים-1 (קו-1 או L1s) הם חוזרים ונשנים, רכיבי DNA שבדרך כלל יש רמות גבוהות של מתילציה ב איי ה-CpG. מתילציה של קו -1 מונעת טרנסלוקציה ומסייעת לשמור על שלמות הגנום. במספר סוגים של סרטן, קו -1 הוא hypomethylated, וכתוצאה מכך הפעלה ושלאחר מכן ההפעלה העוקבת-מתווך אי-יציבות כרומוזומלית4. קו 1 חשבונות עבור כמעט 17% של הגנום האנושי5, ומצב מתילציה שלה יכול לשמש כאינדיקטור לרמה העולמית של מתיונין גנולציה6. לפני המעבר שלתאים. לפנוטיפלגידול לכן, הוא מחזיק הבטחה כסמן פוטנציאלי לתחילת הסרטן המוקדמים.
כיום, ישנן מספר שיטות לניתוח מתילציה, כולל פירולציה, PCR ספציפי, מיקרו-מערכים וכרומטין immunoprecipitation1. השימוש ברצף הדור הבא הפך גם את האפשרות לשלב גישות הגנום רחב לגילוי של מתילציה DNA. רבות מהשיטות הללו מסתמכות על דנ א המטופל בביסולפיט, שבו מומרות הציטוסינוסים בלתי מגנטיים לאורצילין ומתילטוסינוסים נותרים ללא שינוי. עם זאת, העבודה עם ה-DNA bisulfite תייחס שטופלו יש מלכודות מספר, כגון המרות שלא הושלמה של ציטוסינוסים unמתיליום כדי uracil, הגברה מוטה של רצפים, ו רצף שגיאות8.
ב מתילציה-הגברה בדיקה ספציפית (MSPA), בדיקות המורכב משני ליגונואותים רצפי DNA היעד המכיל אתר הגבלה (GCGC) עבור אנזים מתילציה רגיש הגבלה HhaI9. לאחר הבדיקות hybridize ל-DNA, כל מדגם מחולק לשתי קבוצות. רגשים בסדרה הראשונה עוברים הארכה, בעוד הבדיקות בסדרה השנייה עוברים הארכה ואחריו העיכול HhaI-תיווך באתרי CGCG unמתילated. שני סטים של דגימות מוגבר אז על ידי ה-PCR, והמוצרים מופרדים על ידי אלקטרופורזה קפיצית. הזונדים באתרים לא מתיללים מתעכלים על ידי hhaI ולא מוגבר במהלך ה-PCR, וכתוצאה מכך אין אותות שיא. לעומת זאת, הגששים באתרי מתיליום מוגנים מפני העיכול, ולכן מוגברת במהלך ה-PCR, ולאחר מכן מייצרים אותות שיא10.
MSPA יש מספר יתרונות על פני שיטות חלופיות. ראשית, זה דורש כמות נמוכה של DNA (50-100 ng) והוא מתאים היטב לניתוח של ה-DNA מ פורמאלין-קבוע פרפין מוטבע דגימות10. זה לא דורש DNA התייחס bisulfite פיט; למעשה, זה לא מתאים DNA כי הוא שונה בדרך זו. דגימות רבות ניתן לנתח באותו זמן, ו MSPA בדיקות יכול להיות מעוצב כך שהם מכוונים גנים מרובים או רצפים בו. בנוסף, הבדיקות הן ספציפיות ורגישות עבור ה-DNA מתילנטי כאתר ההגבלה hhaI מתאים לרצף האופייני לאיי ה-CpG10.
מחקר זה חקר את ההשפעות של אוסטאוסרקומה (מערכת ההפעלה)-שלפוחיות נגזרות (EVs) על קו-1 מתילציה ברקמת השומן הנגזר של הרקמה המטבית (AT-MSCs; איור 1). EVs הם ננו-סקאלה, ממברנה מאוגד שלפוחיות מופרש על ידי סוגי התאים ביותר. הם נושאים חלבונים, שומנים, mrna, מיקרווריה, ומולקולות נוספותמתאיההורה 11,12. EVs תווך תקשורת בין-תאית והפעל תפקידים חשובים במספר מצבים פתופסלוגיים13,14. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי סרטן נגזר EVs עשוי להעביר הפעיל קו -1 לתאים הנמען15. זה דווח מוקדם יותר כי EVs מ-HOS-143B קו התא יכול לשנות את מצב מתילציה של קו 1 ב MSCs, בנוסף להשפעות גנטיות אחרות16.
כאשר התאים הגדלים עבור ev בידוד, חשוב להשתמש ev-מרוקן סרום שור העובר [fbs] במדיום הצמיחה, מאז fbs-נגזר EVs יכול להפריע EVs ממקורות אחרים ולפגוע בתוצאות17,18. ההפוגות היא אחת השיטות הנפוצות ביותר עבור מכלה EVs מ FBS. זהו הליך פשוט וחסכוני יחסית בהשוואה לחלופות כגון אולטראפילטרציהו-FBSמסחרי. כאן, הפרוטוקול גם מדגים כיצד להכין את FBS מרוקן-EV על-ידי הסתבכות.
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט עבור הטכניקות הנ ל, מבידוד של EVs מקו מערכת ההפעלה לניתוח מתילציה של קו 1 ב-OS-EV טיפל MSCs (איור 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+01T1</td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>MSC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3730XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BlueStar Prestained Protein Marker</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>MWP03</td>
			<td>WB: protein marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin (clone C5C9)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2679</td>
			<td>WB, dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 (clone H5C6)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556019</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5703000010</td>
			<td>For conditioned media and cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810000010</td>
			<td>For spinning down 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>331374</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 + GlutaMAX medium</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>For AT-MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneScan 500 LIZ size standard</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4322682</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WGA2-10RXN</td>
			<td>for MSPA negative control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Di formamide</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4311320</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOS-143B cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-8303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp70 (clone 5G10)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554243</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-mouse</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32210</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-rabbit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LINE-1 probe-mix primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Sequences in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4306737</td>
			<td>also requires sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td>measure protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniProtean TGX 10% gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1034</td>
			<td>WB: gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM14C</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>WB: protein transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue XS</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740901.50</td>
			<td>for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>WB: blocking, antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Antibiotics for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tube, 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431064</td>
			<td>For storing Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-11015</td>
			<td>WB: total protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RKO cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2577</td>
			<td>for MSPA positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 + GlutaMAX</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>61870-010</td>
			<td>For HOS-143B cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA HhaI enzyme</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>SMR50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA reagent kit</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>EK1-FAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA P300 probe-mix</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>P300-100R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging rotor SW-28</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342207</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>FPE-204-030</td>
			<td>sterile filtering FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai 12</td>
			<td>FEI Company</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Gatan Orius SC 
			1000B CCD-camera 
			(Gatan Inc., USA); for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS, 1X tablets</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-7500-100</td>
			<td>WB: buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>WB: transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TCA0096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>for trypsinization of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 (clone 4A10)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB2702167</td>
			<td>WB, dilution 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles

מתילציה-הגברה בדיקה ספציפית (MSPA) היא טכניקה פשוטה ואיתנה שניתן להשתמש בה כדי לזהות הבדלים יחסיים ברמות מתילציה של דגימות דנ א. זה רב תושייה, דורש כמויות קטנות של DNA, ולוקח סביב 4 – 5 h של הידיים על העבודה. בטכניקה המוצגת, דגימות ה-DNA הם הראשון מאוד לאחר מכן הוכלא בדיקות כי היעד DNA על מתילאו אתרים התייחסות כפקד. ה-DNA הוכלא מופרד לתגובות מקבילות, אחד עובר רק הארכה והשני עובר לאחר ואחריו העיכול HhaI-תיווך ברצפי GCGC unמתילated. שברי הדי. אנ. איי התוצאה הם מוגבר על ידי ה-PCR ומופרדים על ידי אלקטרופורזה קפילר. אתרים GCGC מתילated אינם מתעכלים על ידי HhaI ולייצר אותות שיא, בעוד האתרים GCGC מתעכל מתעכלים ולא אותות שיא נוצרות. השוואת הפסגות מנורמל השליטה של גירסאות מתעכל ובלתי מתעכלות של כל מדגם מספק את יחס המינון מתילציה של דגימת דנ א. כאן, MSPA משמש כדי לזהות את ההשפעות של אוסטאוסרקומה (EVs) על מעמד מתילציה של אלמנט גרעיני ארוך וביניהם-1 (קו -1) בתאי גזע mesenchymal. LINE-1s הם רכיבי DNA חוזרים שבדרך כלל עוברים hypomethylation בסרטן, בקיבולת זו, עשוי לשמש ביואריקר. משמש גם כשיטה חסכונית כדי להפריד ושלפוחיות מתוך נוזלים ביולוגיים (כלומר, כאשר הכנת סרום העוברי EV-מרוקנת [FBS] ובידוד EVs מתוך מדיה אוסטאוסרקומה ממוזג [צנטריפוגה]). עבור ניתוח מתילציה, בדיקות קו 1 מותאמות אישית מיועדות למקד שלושה אתרי מתילציה ברצף המקדם של קו 1 ובשבעה אתרי בקרה. פרוטוקול זה מדגים את השימוש ב-MSPA עבור ניתוח מתילציה של קו 1 ומתאר את הכנת הגושים המרוקנים ב-EV על ידי הסתבכות.

המטרה העיקרית של מחקר זה היה להעריך את ההשפעות epigenetic של OS-EVs ב MSCs. OS-EVs היו מבודדים מתאי-143B באמצעות השיטה הדיפרנציאליות סטנדרטית. הביטוי של האופייני EV סמנים CD63, Hsp70, ו TSG101 על ידי בלוק המערבי אישר את הנוכחות של OS-EVs. (איור 2א). העדר אות calnexin הצביע על טוהר של מערכת ההפעלה-EV ב...

Watch this Scientific Journal Video about LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles at JoVE.com

LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

המתואר כאן הוא השימוש בשיטה ספציפית הגברה בדיקה כדי לנתח את רמות המטלציה של האלמנטים קו 1 בתאי גזע mesenchymal שטופלו אוסטאוסרקומה נגזר שלפוחיות. בנוסף, הליך פופולרי עבור הפרדת שלפוחיות ושלפוחית של הפרה העובר סרום, הוא הפגינו גם.

קו 1 ניתוח מתילציה בתאי גזע מסנמצ'אל מטופלים עם אוסטאוסרקומה-מסחטות שלפוחיות

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of ...

מתילציה של דנ"א היא אחת החתימות האפיגנטיות הנחקרות ביותר. סוגי סרטן רבים מאופיינים בשינויים ברמות מתילציה DNA, אשר קשורים עם ביטוי גנים חריגים ומומים גנומיים אחרים. יסודות גרעיניים ארוכים משולבים הם רצפים גנומיים חוזרים ונשנים שבדרך כלל יש להם רמות גבוהות של מתילציה.עם זאת, לעתים קרובות הם הופכים hypermethylated בסרטן, אשר לגרום ההפעלה שלהם ומוביל לחוסר יציבות כרומוזומלית. במחקר זה, טיפלנו בתאי גזע mesenchymal עם ארסים חוץ תאיים שמקורם osteosarcoma כדי לראות אם כלי רכב חשמליים סרטניים יכולים להשפיע על מתילציה LINE-1 ב- MECs. סרום חזיר עוברי, שהוא מרכיב אינטגרלי במדיה של תרבות תאי היונקים, מכיל מספר רב של כלי רכב חשמליים שמקורם בבובין.Evs אלה יפריעו לניתוח של Evs מתאים מעניינים שלנו, ולכן, כאשר גדל תאים לבידוד EV, חשוב להשתמש FBS מדולדל EV. קח את FBS בצינורות אולטרהצנטריים והצב אותם בדליים אולטרה-מרכזיים. לאזן את הדליים בתוך 10 מיליגרם אחד מהשני לפני טעינת אותם על רוטור מתנדנד.מניחים את הרוטור באולטרהצנטריפוגה ולרוץ ב 100, 000 G במשך 19 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הריצה, בזהירות לאסוף את השכבה העליונה בצבע בהיר של supernatant ולהעביר אותו צינור 50 מיליליטר. אין להפריע או להצינור את גלולת החום הכהה מכיוון שהיא מכילה כלי רכב חשמליים מ- FBS.מעבירים את העל-טבעי דרך מסנן 0.22 מיקרון לצינור חדש של 50 מיליליטר. FBS מעוקר מסנן זה, מדולדל EV כעת ניתן להוסיף למדיית תרבות התא בעת גידול תאים עבור בידוד EV. לאסוף מדיה מותנה מתאים osteosarcoma גדל בתקשורת מדולדל EV.כדי להסיר תאים ופסולת תאים, צנטריפוגה התקשורת המותנה ב 2500 G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את העל-טבעי לצינורות אולטרה-מרכזיים ומאזנים אותם כמו קודם לכן. צנטריפוגה הצינורות ב100, 000 G במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס.בזהירות להשליך את העל טבעי עוזב סביב מיליליטר אחד בתחתית. מוסיפים כ-20 מיליליטר של PBS לצינור ומצינורים בעדינות כדי לשטוף ולהשעות מחדש את גלולת ה-EV. לאזן את הצינורות ולבצע סיבוב נוסף של אולטרהצנטריות עם אותן הגדרות.בזהירות להסיר את supernatant ולהשעות מחדש את גלולת EV ב 200 microliters של PBS על ידי צינורות עדינים. אחסן את כלי רכב חשמליים בצינורות עם כריכה נמוכה. כלי רכב חשמליים מטוהרים מאופיינים על ידי כתמים מערביים, ניתוח מעקב חלקיקים, מיקרוסקופ אלקטרונים שידור.צלחת 15, 000 MSCs ל הבאר בצלחת 24 באר. לאחר 24 שעות, הסר מדיה ישנה, שטף את התאים באמצעות PBS ושנה למדיה המדולדל EV. לטפל בתאים עם OS-EVs בנקודות הזמן המתוזמנות.לאחר הפסקת הטיפול EV, לחלץ DNA מהתאים בשיטה המתאימה. לניתוח מתילציה, השתמשנו בשיטת הגברה ספציפית לתילציה בהתאמה אישית. תכנן את בדיקות LINE-1 המותאמות אישית, כפי שנעשה בעבר, על ידי Pavicic ואחרים.עבור בדיקות מתילציה, בחר שלושה רצפים המכילים את אתר הגבלת HhaI בתוך אזור האמרגן. עבור בדיקות בקרה, בחר שבעה רצפים ללא אתר הגבלת HhaI משאר רצף LINE-1. לדלל 70 ננוגרם של דגימת DNA במאגר TE לחמישה מיקרוליטרים.מחממים את הדגימות במשך 10 דקות ב 98 מעלות צלזיוס ואז להתקרר ל 25 מעלות צלזיוס. הוסף שלושה microliters של תערובת הכלאה בדיקה לכל מדגם ולהפעיל את התרמוצ'ילר כדי לאפשר לבדיקות הכלאה ל- DNA. בטמפרטורת החדר, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של תערובת שלאחר ההכלאה לכל מדגם.מעבירים 10 מיקרוליטרים לצינור שני. מניחים את שני סטים של צינורות בתרמוצ'ילר ודגירה ב 48 מעלות צלזיוס לפחות דקה אחת. בעוד הדגימות הן ב 48 מעלות צלזיוס, להוסיף 10 microliters של תערובת קשירה לקבוצה הראשונה של צינורות ו 10 microliters של תערובת עיכול קשירה לסט השני של צינורות.הפעל את תוכנית התרמוצ'ילסר הבאה. לאחר מכן, לסובב את הצינורות בו זמנית להגדיר את התרמוצ'ילר ל 72 מעלות צלזיוס. מוסיפים חמישה מיקרוליטרים של תערובת פולימראז לכל צינור ומ מניחים את הצינורות בתרמוציקלר.הפעל את תוכנית PCR. בזמן שתוכנית ה-PCR פועלת, הכינו פתרון של תרכובת מיליליטר אחת המכילה 2.5 מיקרוליטרים בתקן גודל. Pipet 10 מיקרוליטרים של פתרון זה לכל שורה של צלחת באר אופטית 96.לאחר PCR, לדלל את דגימות מעוכל מעוכל אחד עד מאה ואחד עד מאתיים, בהתאמה במים טהורים במיוחד. הוסף שני מיקרוליטרים של מוצר PCR מדולל לצלחת 96 באר. צנטריפוגה הצלחת ב 200 G במשך 15 עד 20 שניות כדי להסיר בועות אוויר.לבצע ניתוח שבר של דגימות על ידי אלקטרופורזה נימי. פתח את תוצאות האלקטרופורזה נימי בתוכנת ניתוח אלקטרופרוגרמה. בחרו דוגמה והגדירו את החלונית ל-MLPA מהתפריט.לחץ על הלוח ולחץ על פקד D כדי להחיל הגדרה זו על כל הדגימות. באופן דומה, הגדר את שיטת הניתוח כברירת מחדל microsatellite עבור כל הדגימות. בחר את כל הדגימות ולחץ על כפתור המשחק הירוק כדי להפעיל ניתוח, ולאחר מכן בחר את כל הדגימות ולחץ על כפתור הגרף כדי לדמיין את פסגות הבדיקה.הגדל את אזור השיא לקבלת רזולוציה גבוהה יותר של הפסגות הבודדות. ודא כי כל 10 פסגות המתאימות לבדיקות מתערובת החללית LINE-1 מסומנים. בכרטיסיה גנוטיפים, יצא את התוצאות בתבנית CSV.פתח את קובץ ה- CSV בתוכנה לניתוח נתונים ומיין את הנתונים לעמודות. סמן את שלושת פסגות אתר המתילציה לפי הגדלים שלהן. שבע הפסגות הנותרות תואמות את בדיקות הבקרה.כאן אנו משתמשים בפסגות הגשושית LINE-1 2M שגודלן כ-117 זוגות בסיסים. עבור כל מדגם, חשב את אזור שיא הסכום של כל שבע פסגות הבקרה. חלק את אזור השיא של כל בדיקה LINE-1 בסכום זה.עבור כל מדגם, לחלק את הערך של המדגם מתעכל על ידי זה של המדגם מעוכל כדי לקבל את יחס המינון מתילציה. ניתוח סופג מערבי אישר את נוכחותם של כלי רכב חשמליים עם אותות שנצפו עבור TSG101, HSP70 ו- CD63. היעדר אות calnexin הצביע על כך שדגימה EV היה טהור.אינדיקציה נוספת של טוהר נצפתה עם TEM עם תנודות שלמות בגדלים שונים נוכח מדגם OS-EV. ריכוז חלקיקי OS-EV והתפלגות הגודל נמדדו על ידי NTA. 80% מהרכבים התת-חשמליים היו בטווח גודל של 50 עד 200 ננומטר.כאן אנו יכולים לראות את יחסי המינון מתילציה של LINE-1 מ MSCs בנקודות זמן שונות של הטיפול EV. הקו האפור מייצג רמת מתילציה בסיסית מנקודת זמן אפס. בנקודת זמן שלוש, יש ירידה ביחס המינון מתילציה הממוצע לאחר הממשל של כלי רכב חשמליים, ובכך מצביע על היפרמתילציה.אפקט זה hypermethylating של כלי רכב חשמליים בולט פחות בנקודת זמן שבע. כאן הראינו טכניקה פשוטה, רגישה וחזקה לניתוח מתילציה. זה דורש כמות נמוכה של DNA ללא המרה bisulfite מעורב וזה מתאים גם DNA מבודד מדגימות מוטבע פרפין.השיטה כולה, עם החלקים הניסיוניים והאנליטיים, אורכת כיומיים. בשל מספר עותק גבוה של LINE-1 בגנום, המתילציה הבסיסית של LINE-1 גבוהה בדגימות רגילות. לכן, ההבדלים ברמות מתילציה של דגימות, כפי שנצפה בשיטה זו, עשויים להיות עדינים.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

השימוש בניתוח מגזר סומטיים מושרה (ISSA) לימוד גנים ומקדמי המעורבים ביצירת עץ ופיתוח גזע משניים

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

הנדסה גורמים מלאכותיים כדי לתמרן באופן ספציפי שחבור אלטרנטיבי בתאים אנושיים

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

ניתוח של חלבונים קושרי שווי בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיזיולוגיים

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

ניתוח מקיף מתילציה DNA באמצעות Methyl-CpG מחייב דומיין לכידת מבוסס שיטה בחולים לוקמיה לימפוציטית כרונית

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining עבור שינויים DNA: ניתוח חישובית של תמונות קונפוקלי

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

הגנום משופרת עריכה עם Cas9 Ribonucleoprotein שונים תאים ואורגניזמים

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

מתודולוגיה עבור איתור מדויק של מתילציה DNA מיטוכונדריאלי

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

זיהוי של אירועי רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג הדרומי ואת תגובת שרשרת פולימראזית

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...