Name: line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles
Uploaded: 2020-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato dal finanziamento del progetto dell'Università di Helsinki (WBS490302, WBS73714112) Finanziamento dello Stato ospedaliero universitario di Helsinki per la ricerca sanitaria a livello universitario (Y1014SUL05, TYH2016130), Finnish-Norwegian Medical Foundation, e la Selma e Maja-Lisa Selander Fund (Fondazione Minerva). Ringraziamo Walter Pavicic per aver fornito il protocollo MSPA modificato e per il relativo supporto tecnico. Siamo grati a Teemu Masalin (Università di Helsinki) per averci aiutato con la produzione video.

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico di Helsinki e distretto ospedaliero Di Uusimaa (approvazione etica D. N. 217/13/03/02/2015).
1. Preparazione dell'EV impoverito FBS per ultracentrifugazione
<ol><li>Prendere FBS in (ultra)centrifugare tubi e metterli in secchi di ultracentrifuga. Per garantire che l'ultracentrifugazione funzioni senza intoppi e in modo sicuro, bilanciare i secchi entro 10 mg l'uno dall'altro.</li>
	<li>Caricare i secchi su un rotore oscillante (tipo SW28, k...

<ol>
	<li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenomics:+DNA+methylomes+and+histone-modification+maps.">Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).</li><li>Herman, J. G., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+cancer+in+association+with+promoter+hypermethylation.">Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation.</a> New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+Cancer:+The+Next+Generation.">Hallmarks of Cancer: The Next Generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+transposition+of+endogenous+retroviral+elements+in+hypomethylation+induced+tumors+in+mice.">Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice.</a> Oncogene. 27, 404-408 (2008).</li><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome.">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409, 860-921 (2001).</li><li>Rodriguez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+instability+correlates+with+genome-wide+DNA+demethylation+in+human+primary+colorectal+cancers.">Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers.</a> Cancer Research. 66, 8462 (2006).</li><li>Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetic+progenitor+origin+of+human+cancer.">The epigenetic progenitor origin of human cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).</li><li>Bock, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiQ+Analyzer:+visualization+and+quality+control+for+DNA+methylation+data+from+bisulfite+sequencing.">BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing.</a> Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).</li><li>Schouten, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+quantification+of+40+nucleic+acid+sequences+by+multiplex+ligation-dependent+probe+amplification.">Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification.</a> Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).</li><li>Nygren, A. O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation-Specific+MLPA+(MS-MLPA):+simultaneous+detection+of+CpG+methylation+and+copy+number+changes+of+up+to+40+sequences.">Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences.</a> Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).</li><li>El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).</li><li>Vallabhaneni, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+bone+marrow+mesenchymal+stem/stromal+cells+transport+tumor+regulatory+microRNA,+proteins,+and+metabolites.">Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites.</a> Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).</li><li>Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-+derived+microvesicles:+important+and+underappreciated+mediators+of+cell-to-cell+communication.">Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication.</a> Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).</li><li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+as+mediators+of+intercellular+communication+in+cancer-+the+emerging+science+of+cellular+"debris".">Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris".</a> Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).</li><li>Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+mediate+the+horizontal+transfer+of+an+active+LINE-1+retrotransposon.">Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).</li><li>Mannerstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+alterations+in+mesenchymal+stem+cells+by+osteosarcoma-derived+extracellular+vesicles.">Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles.</a> Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).</li><li>Shelke, G. V., L&#228;sser, C., Gho, Y. S., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+exosome+depletion+protocols+to+eliminate+functional+and+RNA-containing+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).</li><li>Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+bovine+serum+RNA+interferes+with+the+cell+culture+derived+extracellular+RNA.">Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA.</a> Scientific Reports. 6, 31175 (2016).</li><li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).</li><li>Puhka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+profiling+of+extracellular+vesicles+and+alternative+normalization+methods+reveal+enriched+metabolites+and+strategies+to+study+prostate+cancer-related+changes.">Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes.</a> Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).</li><li>Peltoniemi, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+enrichment+does+not+warrant+a+higher+graft+survival+in+lipofilling+of+the+breast:+A+prospective+comparative+study.">Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study.</a> Journal of Plastic, Reconstructive &amp; Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).</li><li>Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltom&#228;ki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE-1+hypomethylation+in+familial+and+sporadic+cancer.">LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer.</a> Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).</li><li>. L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2) Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269</a> (2000)</li><li>Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland Available from: <a target="_blank" href="https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes">https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes</a> (2018)</li><li>. Takara Bio Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview">https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview</a> (2018)</li><li>Pisanic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+interspersed+nuclear+element+1+retrotransposons+become+deregulated+during+the+development+of+ovarian+cancer+precursor+lesions.">Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions.</a> The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).</li></ol>

Questo studio illustra come mspA può essere utilizzato per rilevare e quantificare lo stato di metilazione di uno specifico elemento genetico. LINE-1 è stato il focus qui, ma le sonde possono essere progettate per indirizzare una serie di geni e sequenze. Inoltre, c'è un elenco crescente di miscele di sonde disponibili per diverse applicazioni. MSPA è una tecnica semplice e robusta per l'analisi della metilazione del DNA che non richiede la conversione bisulfita10. La procedura completa dalla ...

La metilazione del DNA è una grande modifica epigenetica che si verifica nelle cellule umane. La metilazione del DNA si riferisce al collegamento dei gruppi metilici ai residui di citosina nei dinucleotidi CpG. Tali dinucleotidi si trovano di solito negli ammassi (isole CpG) nella regione 5' dei geni1. Nelle cellule normali, la maggior parte di questi dinucleotidi esiste in uno stato non metilato, che consente la trascrizione del DNA. Per inciso, molti tumori sono associati con le isole CpG ipermetillate e il silenziamento trascrittomico2, soprattutto nei geni soppressori tumorali, che a loro volta contribuiscono a vari segni distintivi del cancro3.
D'altra parte, lunghi elementi nucleari interspersati-1 (LINE-1 o L1) sono elementi di DNA ripetitivi e trasponibili che normalmente hanno alti livelli di metilazione nelle isole CpG. La metilazione di LINE-1 previene la traslocazione e aiuta a mantenere l'integrità del genoma. In diversi tipi di cancro, LINE-1 è ipometilato, con conseguente attivazione e successiva instabilità cromosomica retrotrassima mediata4. LINE-1 rappresenta quasi il 17% del genoma umano5e il suo stato di metilazione può fungere da indicatore dei livelli di metilazione genomica globale6. Si ritiene che l'ipometilazione line-1 globale preceda la transizione delle cellule a un fenotipo tumorale7; quindi, promette come potenziale marcatore per l'insorgenza precoce del cancro.
Attualmente, ci sono diversi metodi per l'analisi della metilazione, tra cui la pigzoncazione, la metilazione specifica PCR, microarray e l'immunoprecipitazioni della cromatina1. L'uso del sequenziamento di nuova generazione ha anche permesso di incorporare approcci a livello di genoma per la rilevazione della metilazione del DNA. Molti di questi metodi si basano sul DNA trattato con bisulfite, in cui le citosine non metilate vengono convertite in uracile e le citosine metilate rimangono invariate. Tuttavia, lavorare con il DNA trattato con bisulfite ha diverse insidie, come conversioni incomplete di citosine non metilate in uracili, amplificazione di biasima delle sequenze e errori di sequenza8.
Nell'amplificazione della sonda specifica per la metilazione (MSPA), le sonde composte da due oligonucleotidi prendono di mira sequenze di DNA contenenti un sito di restrizione (GCGC) per l'enzima di restrizione sensibile alla metilazione HhaI9. Dopo che le sonde si ibridano al DNA, ogni campione viene diviso in due set. Le sonde nel primo set vengono sottoposte a legatura, mentre le sonde nel secondo set vengono sottoposte a legatura seguita da una digestione mediata di HhaI in siti CGCG non metilati. Entrambi i set di campioni vengono poi amplificati dalla PCR e i prodotti sono separati da elettroforesi capillare. Le sonde nei siti non metilati vengono digerite da HhaI e non vengono amplificate durante la PCR, con conseguente assenza di segnali di picco. Al contrario, le sonde nei siti metilati sono protette dalla digestione e sono quindi amplificate durante la PCR, generando successivamente segnali di picco10.
MSPA presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi alternativi. In primo luogo, richiede una bassa quantità di DNA (50-100 ng) ed è adatto per l'analisi del DNA da campioni incorporati di paraffina fissati in formalina10. Non richiede DNA trattato con bisulfiti; infatti, non è adatto per il DNA che viene modificato in questo modo. Molti campioni possono essere analizzati contemporaneamente e le sonde MSPA possono essere progettate in modo che si rivolgono a più geni o sequenze contemporaneamente. Inoltre, le sonde sono specifiche e sensibili per il DNA metilato come il sito di restrizione HhaI corrisponde a una sequenza che è tipica delle isole CpG10.
Questo studio ha studiato gli effetti delle vesciche extracellulari derivate dall'osteosarcoma (OS) (EV) sulla metilazione LINE-1 nelle cellule staminali mesenchimale derivate da tessuto adiposo (AT-MSC; Figura 1). Gli EV sono su nanoscala, vesciche legate a membrana secrete dalla maggior parte dei tipi di cellule. Trasportano proteine, lipidi, mRNA, microRNA e molecole aggiuntive dalle cellule dei genitori11,12. Gli EV mediano la comunicazione intercellulare e svolgono ruoli importanti in diverse condizioni patofisiologiche13,14. Uno studio recente ha dimostrato che gli EV derivati dal cancro possono trasferire line-1 attivi alle cellule ricevente15. È stato riferito in precedenza che i veicoli elettrici della linea cellulare HOS-143B possono alterare lo stato di metilazione di LINE-1 nelle MSC, oltre ad altri effetti genetici16.
Quando si coltivano cellule per l'isolamento EV, è importante utilizzare il siero bovino fetale impoverito di EV [FBS] nel mezzo di crescita, poiché gli EV derivati da FBS possono interferire con i veicoli elettrici provenienti da altre fonti e ostacolare i risultati17,18. L'ultracentrifugazione è uno dei metodi più comuni per esaurire i VE da FBS. Si tratta di una procedura relativamente semplice ed economica rispetto ad alternative come l'ultrafiltrazione e l'esaurimento commerciale di FBS19. Qui, il protocollo dimostra anche come preparare FBS impoverito da EV per ultracentrifugazione.
In questo articolo viene presentata un protocollo dettagliato per le tecniche di cui sopra, dall'isolamento dei veicoli elettrici da una linea cellulare del sistema operativo all'analisi della metilazione di LINE-1 negli MSC trattati con OS-EV (Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+01T1</td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>MSC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3730XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BlueStar Prestained Protein Marker</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>MWP03</td>
			<td>WB: protein marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin (clone C5C9)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2679</td>
			<td>WB, dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 (clone H5C6)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556019</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5703000010</td>
			<td>For conditioned media and cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810000010</td>
			<td>For spinning down 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>331374</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 + GlutaMAX medium</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>For AT-MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneScan 500 LIZ size standard</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4322682</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WGA2-10RXN</td>
			<td>for MSPA negative control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Di formamide</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4311320</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOS-143B cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-8303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp70 (clone 5G10)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554243</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-mouse</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32210</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-rabbit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LINE-1 probe-mix primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Sequences in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4306737</td>
			<td>also requires sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td>measure protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniProtean TGX 10% gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1034</td>
			<td>WB: gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM14C</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>WB: protein transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue XS</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740901.50</td>
			<td>for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>WB: blocking, antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Antibiotics for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tube, 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431064</td>
			<td>For storing Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-11015</td>
			<td>WB: total protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RKO cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2577</td>
			<td>for MSPA positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 + GlutaMAX</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>61870-010</td>
			<td>For HOS-143B cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA HhaI enzyme</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>SMR50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA reagent kit</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>EK1-FAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA P300 probe-mix</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>P300-100R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging rotor SW-28</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342207</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>FPE-204-030</td>
			<td>sterile filtering FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai 12</td>
			<td>FEI Company</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Gatan Orius SC 
			1000B CCD-camera 
			(Gatan Inc., USA); for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS, 1X tablets</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-7500-100</td>
			<td>WB: buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>WB: transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TCA0096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>for trypsinization of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 (clone 4A10)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB2702167</td>
			<td>WB, dilution 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles

L'amplificazione della sonda specifica per la metilazione (MSPA) è una tecnica semplice e robusta che può essere utilizzata per rilevare differenze relative nei livelli di metilazione dei campioni di DNA. È pieno di risorse, richiede piccole quantità di DNA e richiede circa 4-5 h di lavoro pratico. Nella tecnica presentata, i campioni di DNA vengono prima denaturati e quindi ibridati su sonde che prendono di mira il DNA in siti metilati o di riferimento come controllo. Il DNA ibridato è separato in reazioni parallele, una sottoposta solo a legatura e l'altra sottoposta a legatura seguita dalla digestione mediata da HhaI in sequenze GCGC non metilate. I frammenti di DNA risultanti sono amplificati dalla PCR e separati dall'elettroforesi capillare. I siti GCGC metilati non vengono digeriti da HhaI e producono segnali di picco, mentre i siti GCGC non metilati vengono digeriti e non vengono generati segnali di picco. Confrontando i picchi normalizzati dal controllo delle versioni digerite e non digerite di ogni campione si fornisce il rapporto di dosaggio della metilazione di un campione di DNA. Qui, MSPA viene utilizzato per rilevare gli effetti delle vesciche extracellulari derivate dall'osteosarcoma (EV) sullo stato di metilazione dell'elemento nucleare a lungo intervallato-1 (LINE-1) nelle cellule staminali mesenmalmalmal. I LINE-1 sono elementi di DNA ripetitivi che in genere subiscono l'ipometilazione nel cancro e, in questa capacità, possono fungere da biomarcatore. L'ultracentrifugato è anche usato come metodo conveniente per separare le vesciche extracellulari dai fluidi biologici (cioè, durante la preparazione del siero bovino fetale impoverito di EV [FBS] e l'isolamento dei vescitabi dai media condizionati dall'osteosarcoma [centrifugazione differenziale]). Per l'analisi della metilazione, le sonde LINE-1 personalizzate sono progettate per indirizzare tre siti di metilazione nella sequenza promotrice LINE-1 e sette siti di controllo. Questo protocollo dimostra l'uso di MSPA per l'analisi della metilazione LINE-1 e descrive la preparazione di FBS impoverito da EV per ultracentrifugazione.

L'obiettivo principale di questo studio era valutare gli effetti epigenetici degli OS-EV sulle MSC. OS-EV sono stati isolati dalle cellule HOS-143B utilizzando il metodo di centrifugazione differenziale standard. L'espressione dei tipici marcatori EV CD63, Hsp70 e TSG101 da oscillazioni occidentali ha confermato la presenza di OS-EV. (Figura 2A). L'assenza di segnale di calnexina indicava la purezza dell'isolamento OS-EV. Ulteriori indicazioni di purezza sono state osservate...

Watch this Scientific Journal Video about LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles at JoVE.com

LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

Di seguito è descritto l'uso di un metodo di amplificazione della sonda specifico per la metilazione per analizzare i livelli di metilazione degli elementi LINE-1 nelle cellule staminali mesenchymiche trattate con vescicle extracellulari derivate dall'osteosarcoma. È inoltre dimostrata l'ultracentrifuga, una procedura popolare per separare le vesciche extracellulari dal siero bovino fetale.

Analisi della metilazione LINE-1 nelle cellule staminali mesenchietratta con Vescicoli Extracellulari Derivati dall'Osteosarcoma

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of ...

La metilazione del DNA è una delle firme epigenetiche più studiate. Molti tumori sono caratterizzati da cambiamenti nei livelli di metilazione del DNA, che sono associati all'espressione genica aberrante e ad altre anomalie genomiche. Lunghi elementi nucleari intervallati sono sequenze genomiche trasponibili ripetitive che normalmente hanno alti livelli di metilazione.Tuttavia, spesso diventano ipermetilati nel cancro, che si traducono nella loro attivazione e portano all'instabilità cromosomica. In questo studio, abbiamo trattato le cellule staminali mesenchimali con vescicole extracellulari derivate dall'osteosarcoma per vedere se i veicoli elettrici contro il cancro possono influenzare la metilazione LINE-1 nei MEC. Il siero bovino fetale, che è parte integrante dei mezzi di coltura cellulare dei mammiferi, contiene un gran numero di veicoli elettrici di origine bovina.Questi Ev interferiranno con l'analisi degli Ev da cellule di nostro interesse, quindi, quando si coltivano cellule per l'isolamento dell'EV, è importante utilizzare FBS impoverito da veicoli elettrici. Prendi FBS in tubi ultracentrifuge e posizionali in secchi ultracentrifugo. Bilanciare le benne entro 10 milligrammi l'una dall'altra prima di caricarle su un rotore oscillante.Posizionare il rotore nell'ultracentrifugo e correre a 100.000 G per 19 ore a quattro gradi Celsius. Dopo la corsa, raccogliere attentamente lo strato superiore di colore chiaro del supernatante e trasferirlo in un tubo da 50 millilitri. Non disturbare o pipettare il pellet marrone scuro in quanto contiene veicoli elettrici di FBS.Passare il supernatante attraverso un filtro da 0,22 micron in un nuovo tubo da 50 millilitri. Questo FBS sterilizzato con filtro e impoverito di veicoli elettrici può ora essere aggiunto ai mezzi di coltura cellulare quando si coltivano cellule per l'isolamento dell'EV. Raccogliere supporti condizionati da cellule osteosarcoma coltivate in mezzi esauriti dall'EV.Per rimuovere cellule e detriti cellulari, centrifugare il supporto condizionato a 2500 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il supernatante in tubi ultracentrifugo e bilanciarli come prima. Centrifuga i tubi a 100.000 G per due ore a quattro gradi Celsius.Scartare con cura il supernatante lasciando circa un millilitro sul fondo. Aggiungere circa 20 millilitri di PBS al tubo e pipettare delicatamente per lavare e sospendere di nuovo il pellet EV. Bilanciare i tubi ed eseguire un altro giro di ultracentrifugazione con le stesse impostazioni.Rimuovere con cura il supernatante e sospendere di nuovo il pellet EV in 200 microlitri di PBS mediante pipettazione delicata. Conservare i veicoli elettrici in tubi a bassa legatura. I veicoli elettrici purificati sono caratterizzati da gonfiore occidentale, analisi di tracciamento delle nanoparticelle e microscopia elettronica a trasmissione.Piastra 15.000 CBC per pozzo in una piastra da 24 pota. Dopo 24 ore, rimuovere i vecchi supporti, lavare le cellule con PBS e passare a supporti esauriti con EV. Trattare le celle con OS-EV nei punti di tempo pianificati.Dopo aver interrotto il trattamento con EV, estrarre il DNA dalle cellule utilizzando un metodo appropriato. Per l'analisi della metilazione, abbiamo utilizzato un metodo di amplificazione della sonda specifico per la metilazione su misura. Progetta le sonde LINE-1 personalizzate, come fatto in precedenza, da Pavicic e altri.Per le sonde di metilazione, selezionare tre sequenze contenenti il sito di restrizione HhaI all'interno dell'area promotore. Per le sonde di controllo, selezionare sette sequenze prive del sito di restrizione HhaI dal resto della sequenza LINE-1. Diluire 70 nanogrammi di campione di DNA nel tampone TE a cinque microlitri.Riscaldare i campioni per 10 minuti a 98 gradi Celsius, quindi raffreddare a 25 gradi Celsius. Aggiungere tre microlitri di miscela di ibridazione della sonda a ciascun campione ed eseguire il termociclo per consentire alle sonde di ibridarsi al DNA. A temperatura ambiente, aggiungere 30 microlitri di mix post-ibridazione a ciascun campione.Trasferire 10 microlitri in un secondo tubo. Posizionare entrambi i set di tubi nel termociclo e incubare a 48 gradi Celsius per almeno un minuto. Mentre i campioni sono a 48 gradi Celsius, aggiungere 10 microlitri di miscela di legatura al primo set di tubi e 10 microlitri di miscela legatura-digestione al secondo set di tubi.Esegui il prossimo programma termocilcer. Quindi, spin giù per i tubi e contemporaneamente impostare il termociclometro a 72 gradi Celsius. Aggiungere cinque microlitri di miscela di polimerasi a ciascun tubo e posizionare i tubi nel termociclo.Eseguire il programma PCR. Mentre il programma PCR è in esecuzione, preparare una soluzione di una formamide millilitro contenente 2,5 microlitri di dimensioni standard. Pipet 10 microlitri di questa soluzione ad ogni fila di una piastra ottica da 96 pozzi.Dopo la PCR, diluire i campioni non digeriti e digeriti da uno a centonove a duecento, rispettivamente in acqua ultra pura. Aggiungere due microlitri di prodotto PCR diluito alla piastra del pozzo 96. Centrifugare la piastra a 200 G per 15-20 secondi per rimuovere le bolle d'aria.Effettuare l'analisi dei frammenti di campioni per elettroforesi capillare. L'apertura dell'elettroforesi capillare si traduce in un software di analisi dell'elettroferogramma. Selezionate un campione e impostate il pannello su MLPA dal menu.Fare clic sul pannello e premere il controllo D per applicare questa impostazione a tutti i campioni. Analogamente, impostare il metodo di analisi su microsatellite default per tutti i campioni. Selezionare tutti i campioni e fare clic sul pulsante di riproduzione verde per eseguire l'analisi, quindi selezionare tutti i campioni e fare clic sul pulsante del grafico per visualizzare i picchi della sonda.Ingrandire l'area di picco per una risoluzione più elevata dei singoli picchi. Assicurarsi che tutti i 10 picchi corrispondenti alle sonde della miscela di sonde LINE-1 siano etichettati. Nella scheda genotipi esportare i risultati nel formato CSV.Aprire il file CSV in un software di analisi dei dati e ordinare i dati in colonne. Etichettare i tre picchi del sito di metilazione in base alle loro dimensioni. I restanti sette picchi corrispondono alle sonde di controllo.Qui stiamo usando i picchi della sonda LINE-1 2M che hanno una dimensione di circa 117 coppie di basi. Per ogni campione, calcolare l'area di picco della somma di tutti e sette i picchi di controllo. Dividere l'area di picco di ogni sonda LINE-1 per questa somma.Per ciascun campione, dividere il valore del campione digerito per quello del campione non digerito per ottenere il rapporto di dosaggio della metilazione. L'analisi western del gonfiore ha confermato la presenza di OS-EV con segnali osservati per TSG101, HSP70 e CD63. L'assenza di segnale di calnexina indicava che il campione di veicoli elettrici era puro.Ulteriori indicazioni di purezza sono state osservate con TEM con vescicole intatte di varie dimensioni presenti nel campione OS-EV. La concentrazione di particelle OS-EV e la distribuzione delle dimensioni sono state misurate dall'NTA. L'80% dei veicoli elettrici era di dimensioni da 50 a 200 nanometri.Qui possiamo vedere i rapporti di dosaggio della metilazione di LINE-1 dai CBC in diversi punti di tempo del trattamento EV. La linea grigia rappresenta il livello di metilazione della linea di base dal punto di tempo zero. Al punto tre del tempo, c'è una diminuzione del rapporto medio di dosaggio della metilazione dopo la somministrazione di veicoli elettrici, indicando così l'ipermetilazione.Questo effetto ipermetilante dei veicoli elettrici è meno pronunciato al punto di tempo sette. Qui abbiamo mostrato una tecnica semplice, altamente sensibile e robusta per l'analisi della metilazione. Richiede una bassa quantità di DNA senza conversione di bisolfito ed è adatto anche per dna isolato da campioni incorporati nella paraffina.L'intero metodo, con le parti sperimentali e analitiche, dura circa due giorni. A causa di un elevato numero di copie di LINE-1 nel genoma, la metilazione di base di LINE-1 è alta nei campioni normali. Pertanto, le differenze nei livelli di metilazione dei campioni, osservate con questo metodo, possono essere sottili.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

L&#39;uso di Induced somatica Settore Analisi (ISSA) per studio dei geni e promotori coinvolti nella formazione del legno e Sviluppo secondaria dello stelo

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Ricerca

Genetica

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Ingegneria fattori artificiali per manipolare in modo specifico l&#39;alternanza di splicing nelle cellule umane

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analisi delle proteine ​​di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni fisiologiche di ossigeno

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

Analisi completa della metilazione del DNA usando un metodo basato sulla cattura di dominio di metile-CpG in pazienti con leucemia linfocitica cronica

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining per modificazioni del DNA: analisi computazionale delle immagini Confocal

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Enhanced Genome Editing con Cas9 ribonucleoproteina nelle Diverse cellule e degli organismi

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metodologia per la rilevazione accurata di metilazione del DNA mitocondriale

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Proteina endogena Tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identificazione di eventi di ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali del Mouse mediante Southern Blotting e reazione a catena della polimerasi

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...