Name: line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles
Uploaded: 2020-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles at JoVE.com

この研究は、ヘルシンキ大学プロジェクト資金(WBS490302、WBS73714112)ヘルシンキ大学病院国立大学レベルの健康研究のための資金(Y1014SUL05、TYH2016130)、フィンランドノルウェー医療財団、セルマとマジャ・リサ・セランダー基金(ミネルバ財団)。私たちは、変更されたMSPAプロトコルを提供し、関連する技術サポートのためにウォルター・パヴィッチに感謝します。ティーム・マザリン(ヘルシンキ大学)がビデオ制作を手伝ってくれたことに感謝しています。

この研究は、ヘルシンキとウシマ病院地区の倫理委員会によって承認されました(倫理承認第217/13/03/02/2015)。
1. 超遠心分離によるEV枯渇FBSの調製
<ol><li>FBSを(超)遠心管に入れ、超遠心分離機のバケツに入れ。超遠心分離がスムーズかつ安全に実行されるように、互いの10mg以内のバケットのバランスをとります。</li>
	<li>バケットをスイングローターにロードします(SW28、k?...

<ol>
	<li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenomics:+DNA+methylomes+and+histone-modification+maps.">Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).</li><li>Herman, J. G., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+cancer+in+association+with+promoter+hypermethylation.">Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation.</a> New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+Cancer:+The+Next+Generation.">Hallmarks of Cancer: The Next Generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+transposition+of+endogenous+retroviral+elements+in+hypomethylation+induced+tumors+in+mice.">Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice.</a> Oncogene. 27, 404-408 (2008).</li><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome.">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409, 860-921 (2001).</li><li>Rodriguez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+instability+correlates+with+genome-wide+DNA+demethylation+in+human+primary+colorectal+cancers.">Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers.</a> Cancer Research. 66, 8462 (2006).</li><li>Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetic+progenitor+origin+of+human+cancer.">The epigenetic progenitor origin of human cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).</li><li>Bock, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiQ+Analyzer:+visualization+and+quality+control+for+DNA+methylation+data+from+bisulfite+sequencing.">BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing.</a> Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).</li><li>Schouten, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+quantification+of+40+nucleic+acid+sequences+by+multiplex+ligation-dependent+probe+amplification.">Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification.</a> Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).</li><li>Nygren, A. O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation-Specific+MLPA+(MS-MLPA):+simultaneous+detection+of+CpG+methylation+and+copy+number+changes+of+up+to+40+sequences.">Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences.</a> Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).</li><li>El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).</li><li>Vallabhaneni, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+bone+marrow+mesenchymal+stem/stromal+cells+transport+tumor+regulatory+microRNA,+proteins,+and+metabolites.">Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites.</a> Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).</li><li>Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-+derived+microvesicles:+important+and+underappreciated+mediators+of+cell-to-cell+communication.">Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication.</a> Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).</li><li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+as+mediators+of+intercellular+communication+in+cancer-+the+emerging+science+of+cellular+"debris".">Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris".</a> Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).</li><li>Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+mediate+the+horizontal+transfer+of+an+active+LINE-1+retrotransposon.">Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).</li><li>Mannerstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+alterations+in+mesenchymal+stem+cells+by+osteosarcoma-derived+extracellular+vesicles.">Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles.</a> Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).</li><li>Shelke, G. V., L&#228;sser, C., Gho, Y. S., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+exosome+depletion+protocols+to+eliminate+functional+and+RNA-containing+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).</li><li>Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+bovine+serum+RNA+interferes+with+the+cell+culture+derived+extracellular+RNA.">Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA.</a> Scientific Reports. 6, 31175 (2016).</li><li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).</li><li>Puhka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+profiling+of+extracellular+vesicles+and+alternative+normalization+methods+reveal+enriched+metabolites+and+strategies+to+study+prostate+cancer-related+changes.">Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes.</a> Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).</li><li>Peltoniemi, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+enrichment+does+not+warrant+a+higher+graft+survival+in+lipofilling+of+the+breast:+A+prospective+comparative+study.">Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study.</a> Journal of Plastic, Reconstructive &amp; Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).</li><li>Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltom&#228;ki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE-1+hypomethylation+in+familial+and+sporadic+cancer.">LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer.</a> Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).</li><li>. L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2) Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269</a> (2000)</li><li>Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland Available from: <a target="_blank" href="https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes">https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes</a> (2018)</li><li>. Takara Bio Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview">https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview</a> (2018)</li><li>Pisanic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+interspersed+nuclear+element+1+retrotransposons+become+deregulated+during+the+development+of+ovarian+cancer+precursor+lesions.">Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions.</a> The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).</li></ol>

この研究は、MSPAを使用して特定の遺伝的要素のメチル化状態を検出し、定量化する方法を示しています。ここでの焦点はLINE-1でしたが、プローブは遺伝子や配列の範囲をターゲットに設計することができます。さらに、さまざまな用途に利用できるプローブミックスのリストが増えています。MSPAは、亜硫酸水素変換10を必要としないDNAメチル化分析のための簡単で堅牢な技...

DNAメチル化は、ヒト細胞で起こる主要なエピジェネティック修飾である。DNAメチル化とは、CpGジヌクレオチド中のシトシン残基に対するメチル基の結合をいう。このようなジヌクレオチドは、通常、遺伝子1の5'領域のクラスター(CpG島)に見られる。正常な細胞では、これらのジヌクレオチドの大部分は非メチル化状態で存在し、DNA転写を可能にする。なお、多くの癌は、高メチル化CpG島および転写抑制2に関連しており、特に腫瘍抑制遺伝子において、癌3の様々な特徴に寄与する。
一方、長い散在核元素-1(LINE-1またはL1)は、CpG諸島で通常高レベルのメチル化を有する反復的でトランスポーザブルなDNA元素である。LINE-1のメチル化は転位を防ぎ、ゲノムの完全性を維持するのに役立つ。いくつかのタイプの癌において、LINE−1は、低メチル化され、活性化およびそれに続く経転媒性染色体不安定性4をもたらす。LINE-1はヒトゲノム5のほぼ17%を占め、そのメチル化状態は、世界のゲノムメチル化レベル6の指標として役立つ可能性がある。グローバルLINE-1ハイメチル化は、細胞から腫瘍表現型7への移行に先立つと考えられている。したがって、早期癌発症の潜在的なマーカーとしての約束を保持する。
現在、メチル化分析には、ピロースケンシング、メチル化特異的PCR、マイクロアレイ、クロマチン免疫沈降法1など、いくつかの方法があります。次世代シーケンシングの使用により、DNAメチル化の検出にゲノム全体のアプローチを組み込むことも可能になりました。これらの方法の多くは、非メチル化シトシンがウラシルに変換され、メチル化されたシトシンが変わらないバイサルファイト処理DNAに依存しています。しかし、亜硫酸水素塩処理DNAを使用すると、非メチル化シトシンからウラシルへの不完全な変換、配列の偏った増幅、シーケンシングエラーなど、いくつかの落とし穴があります。
メチル化特異的プローブ増幅(MSPA)において、メチル化感受性制限酵素HhaI9に対する制限部位(GCGC)を含む2つのオリゴヌクレオチド標的DNA配列からなるプローブ。プローブがDNAにハイブリダイズした後、各サンプルは2つのセットに分けられます。第1セットのプローブはライゲーションを受け、第2セットではプローブがライゲーションを受け、次いでメチル化されていないCGCG部位でHhaI媒介消化を行う。その後、両方のサンプルセットをPCRで増幅し、キャピラリー電気泳動により分離します。非メチル化部位のプローブはHhaIによって消化され、PCR中に増幅されず、ピークシグナルが発生しません。これに対して、メチル化部位のプローブは消化から保護され、PCR中に増幅され、その後ピークシグナル10を生成する。
MSPAには、代替方法に対していくつかの利点があります。まず、少量のDNA(50~100ng)を必要とし、ホルマリン固定パラフィン埋込サンプル10からDNAを分析するのに適しています。これは、亜硫酸水素塩処理DNAを必要としません;実際、この方法で修飾されるDNAには適していません。同時に多くのサンプルを分析することができ、MSPAプローブは複数の遺伝子または配列を同時に標的にするように設計することができます。さらに、プローブは、HhaI制限部位がCpG島10の典型的な配列に対応するように、メチル化DNAに対して特異的かつ感受性である。
本研究では、脂肪組織由来間葉系幹細胞(AT-MSC)におけるLINE-1メチル化に対する骨肉腫(OS)由来細胞外小胞(EV)の影響を調べた。図 1を参照してください。EVは、ほとんどの細胞タイプによって分泌されるナノスケールの膜結合小胞です。それらは、親細胞11、12からタンパク質、脂質、mRNA、マイクロRNA、および追加の分子を運びます。EVは細胞間通信を媒介し、いくつかの病態生理学的条件において重要な役割を果たす13、14。最近の研究では、癌由来のEVが能動的なLINE-1をレシピエント細胞15に移す可能性が示された。HOS-143B細胞系のEVは、他の遺伝的効果16に加えて、MSCにおけるLINE-1のメチル化状態を変化させることができることが以前に報告されている。
EV単離のために細胞を増殖させる場合、FBS由来のEVは他の供給源からのEVを妨害し、結果17、18を妨げる可能性があるため、成長培地にEV枯渇したウシ血清[FBS]を使用することが重要である。超遠心分離は、FBSからEVを枯渇させる最も一般的な方法の1つです。これは、限外濾過や商用EV枯渇FBS19などの代替手段と比較して、比較的簡単で費用対効果の高い手順です。ここで、このプロトコルは、超遠心分離によってEVで枯渇したFBSを調製する方法も示す。
この記事では、OS 細胞系からの EV の分離から、OS-EV 処理された MSC における LINE-1 のメチル化解析まで、前述の技術に関する詳細なプロトコルを紹介します (図 1)。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+01T1</td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>MSC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3730XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BlueStar Prestained Protein Marker</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>MWP03</td>
			<td>WB: protein marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin (clone C5C9)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2679</td>
			<td>WB, dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 (clone H5C6)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556019</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5703000010</td>
			<td>For conditioned media and cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810000010</td>
			<td>For spinning down 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>331374</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 + GlutaMAX medium</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>For AT-MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneScan 500 LIZ size standard</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4322682</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WGA2-10RXN</td>
			<td>for MSPA negative control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Di formamide</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4311320</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOS-143B cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-8303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp70 (clone 5G10)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554243</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-mouse</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32210</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-rabbit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LINE-1 probe-mix primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Sequences in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4306737</td>
			<td>also requires sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td>measure protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniProtean TGX 10% gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1034</td>
			<td>WB: gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM14C</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>WB: protein transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue XS</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740901.50</td>
			<td>for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>WB: blocking, antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Antibiotics for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tube, 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431064</td>
			<td>For storing Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-11015</td>
			<td>WB: total protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RKO cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2577</td>
			<td>for MSPA positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 + GlutaMAX</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>61870-010</td>
			<td>For HOS-143B cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA HhaI enzyme</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>SMR50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA reagent kit</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>EK1-FAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA P300 probe-mix</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>P300-100R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging rotor SW-28</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342207</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>FPE-204-030</td>
			<td>sterile filtering FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai 12</td>
			<td>FEI Company</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Gatan Orius SC 
			1000B CCD-camera 
			(Gatan Inc., USA); for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS, 1X tablets</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-7500-100</td>
			<td>WB: buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>WB: transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TCA0096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>for trypsinization of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 (clone 4A10)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB2702167</td>
			<td>WB, dilution 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles

メチル化特異的プローブ増幅(MSPA)は、DNAサンプルのメチル化レベルの相対的な差異を検出するために使用できる、シンプルで堅牢な手法です。それは、機知に富み、少量のDNAを必要とし、約4〜5時間の実作業を要します。提示された技術では、DNAサンプルはまず、メチル化または参照部位のいずれかでDNAを標的とするプローブに対してハイブリダイズされます。ハイブリダイズされたDNAは並列反応に分離され、1つはライゲーションのみを受け、もう1つは結紮を受け、もう1つは非メチル化GCGC配列でHhaI媒介消化を経る。得られたDNA断片はPCRにより増幅され、毛細管電気泳動によって分離される。メチル化GCGC部位はHhaIによって消化されず、ピークシグナルを生成しますが、非メチル化GCGC部位は消化され、ピーク信号は生成されません。各サンプルの消化済みおよび未消化のバージョンの制御正規化ピークを比較すると、DNAサンプルのメチル化投与量比が得られます。ここでは、MSPAは間葉系幹細胞における長い間在在核元素1(LINE-1)のメチル化状態に対する骨肉腫由来細胞外小胞(EV)の影響を検出するために使用される。LINE-1sは、通常、癌において低メチル化を受ける反復的なDNA元素であり、この能力において、バイオマーカーとして働く可能性がある。超遠心分離はまた、生物学的流体から細胞外小胞を分離するための費用対効果の高い方法として使用される(すなわち、EV枯渇した胎児ウシ血清[FBS]を調製し、骨肉腫条件化培地[差動遠心分離]からEVを単離する場合)。メチル化分析のために、カスタムLINE-1プローブは、LINE-1プロモーター配列と7つの制御部位の3つのメチル化部位を対象とするように設計されています。このプロトコルは、LINE-1メチル化分析のためのMSPAの使用を実証し、超遠心分離によるEV枯渇FBSの調製を記述する。

本研究の主な目的は、MS-EVがMSCに及ぼすエピジェネティックな影響を評価することであった。ウェスタンブロッティングによる代表的なEVマーカーCD63、Hsp70、TSG101の発現は、OS−EVの存在を確認した。(図2A)。カルネキシンシグナルの欠如は、OS−EV分離の純度を示した。TEMではさらなる純度の指標が認められ、様々なサイズの無傷の小胞が存在する(<strong class="...

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LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

ここでは、骨肉腫由来細胞外小胞で治療した間葉系幹細胞における間葉系幹細胞における、メチル化特異的プローブ増幅法を用いて、LINE-1要素のメチル化レベルを解析する。ウシ胎児血清から細胞外小胞を分離するための一般的な手順である超遠心分離も実証されている。

骨肉腫由来細胞外小胞で治療した間葉系幹細胞のメチル化解析

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of ...

DNAメチル化は、最も研究されたエピジェネティックシグネチャの1つです。多くの癌は、異常な遺伝子発現および他のゲノム異常に関連するDNAメチル化レベルの変化によって特徴付けられる。長く介在する核元素は、通常はメチル化のレベルが高い反復的なトランスポス可能なゲノム配列です。しかし、癌では多くの場合、過剰メチル化され、活性化し、染色体不安定性を引き起こし得る。本研究では、骨肉腫由来の細胞外小胞を用いた間葉系幹細胞を治療し、がんEVがMECにおけるLINE-1メチル化に影響を及ぼすかどうかを調べた。哺乳類細胞培養培地の不可欠な構成要素であるウシ胎児血清には、多数のウシ由来のEVが含まれています。これらのEvsは、私たちの関心のある細胞からのEvsの分析を妨げるので、EVの分離のために細胞を成長させると、EV枯渇したFBSを使用することが重要です。超遠心チューブでFBSを取り、超遠心分離バケツに入れておきます。スイングローターにロードする前に、お互いの10ミリグラム以内にバケツのバランスを取ります。ローターを超遠心分離機に入れ、摂氏4度で19時間100,000 Gで走ります。実行後、上清の明るい色の上層を慎重に収集し、50ミリリットルのチューブに移します。暗褐色のペレットはFBSのEVを含んでいるため、邪魔したり、パイプを入れたりしないでください。上清を0.22ミクロンフィルターを通して新しい50ミリリットルチューブに入れる。このフィルター滅菌、EV枯渇したFBSは、EV分離のために細胞を成長させるときに細胞培養培地に添加できるようになりました。EVを使い果たした培地で増殖した骨肉腫細胞から、条件付き培地を収集する。細胞および細胞の破片を除去するために、2500 Gで条件付き培地を摂氏4度で20分間遠心する。上清を超遠心チューブに移し、以前と同じバランスをとります。チューブを摂氏4度で2時間100,000Gで遠心分離します。慎重に下部に1ミリリットルの周りに残して上清を捨てます.EVペレットを洗浄して再中断するために、約20ミリリットルのPBSをチューブとピペットに静かに加えます。チューブのバランスをとり、同じ設定で超遠心分離の別のラウンドを実行します。慎重に上清を除去し、穏やかなピペット処理により、PBSの200マイクロリットルでEVペレットを再懸濁します。EVは低結合チューブに保管してください。精製されたEVは、ウェスタンブロッティング、ナノ粒子追跡解析、透過型電子顕微鏡法を特徴とする。24ウェルプレートにウェルあたりプレート15,000 MSC。24時間後、古い培地を取り出し、PBSで細胞を洗浄し、EV枯渇培地に変更します。OS-EV を含むセルをスケジュールされたタイム ポイントで処理します。EV処理を停止した後、適切な方法を用いて細胞からDNAを抽出する。メチル化分析では、カスタムメイドのメチル化特異的プローブ増幅法を用いた。以前のように、PavicicなどによってカスタマイズされたLINE-1プローブを設計します。メチル化プローブの場合、プロモーター領域内にHhaI制限部位を含む3つの配列を選択する。制御プローブの場合、残りのLINE-1配列からHhaI制限部位を欠いた7つの配列を選択します。TEバッファー中のDNAサンプル70ナノグラムを5マイクロリットルに希釈する。サンプルを摂氏98度で10分間加熱し、摂氏25度まで冷却します。各サンプルに3マイクロリットルのプローブハイブリダイゼーションミックスを加え、サーモサイクラーを実行してプローブをDNAにハイブリダイズできるようにします。室温で、各サンプルに30マイクロリットルのポストハイブリダイゼーションミックスを加えます。10マイクロリットルを2チューブに移します。両方のチューブをサーモサイクラーに入れ、少なくとも1分間摂氏48度でインキュベートします。サンプルは摂氏48度ですが、チューブの最初のセットに10マイクロリットルのライゲーションミックスを加え、2番目のチューブセットにライゲーション-消化ミックスの10マイクロリットルを加えます。次のサーモチルカープログラムを実行します。次に、チューブを回転させ、同時にサーモサイクラーを摂氏72度に設定します。各チューブに5マイクロリットルのポリメラーゼミックスを加え、チューブをサーモサイクラーに入れます。PCR プログラムを実行します。PCRプログラムの実行中に、サイズ標準の2.5マイクロリットルを含む1ミリリットルフォルマミドの溶液を調製します。この溶液の10マイクロリットルを光学96ウェルプレートの各列にピペットする。PCR後、未消化のサンプルと消化したサンプルを、それぞれ1~100~200に希釈し、超純水で希釈します。希釈PCR製品を2マイクロリットルの96ウェルプレートに加えます。気泡を取り除くために15〜20秒間200Gでプレートを遠心します。毛細管電気泳動によるサンプルのフラグメント分析を行う。毛管電気泳動を開くと、電気泳動解析ソフトウェアが得られます。サンプルを選択し、メニューから MLPA にパネルを設定します。パネルをクリックし、コントロールDを押して、この設定をすべてのサンプルに適用します。同様に、すべてのサンプルのマイクロサテライトのデフォルトに解析方法を設定します。すべてのサンプルを選択し、緑の再生ボタンをクリックして分析を実行し、すべてのサンプルを選択してグラフボタンをクリックしてプローブのピークを視覚化します。個々のピークの解像度を高くするには、ピーク領域を拡大します。LINE-1 プローブミックスのプローブに対応する 10 個のピークがすべてラベル付けされていることを確認します。[遺伝子タイプ] タブで、結果を CSV 形式でエクスポートします。データ分析ソフトウェアで CSV ファイルを開き、データを列に並べ替えます。3つのメチル化部位のピークにサイズに基づいてラベルを付けます。残りの7つのピークは、制御プローブに対応しています。ここでは、約117塩基対のサイズを持つLINE-1 2Mプローブピークを使用しています。各サンプルについて、7 つのコントロールのピークの合計ピーク領域を計算します。LINE-1プローブのピーク面積をこの合計で割ります。各サンプルについて、消化されたサンプルの値を未消化試料の値で割って、メチル化投与量比を求める。ウェスタンブロッティング分析では、TSG101、HSP70、およびCD63に対して観測された信号を持つOS-EVの存在を確認しました。カルネキシンシグナルの不在は、EVサンプルが純粋であることを示した。純度の追加の指標は、OS-EVサンプルに存在する様々なサイズの無傷の小胞を有するTEMで観察された。OS-EV粒子濃度及びサイズ分布をNTAにより測定した。EVの80%は50〜200ナノメートルのサイズ範囲であった。ここでは、EV治療の異なる時点でのMSCからのLINE-1のメチル化投与量比を見ることができます。灰色の線は、ポイント 0 からのベースラインメチル化レベルを表します。ポイント3では、EVの投与後の平均メチル化投与量比の低下があり、それによりハイパーメチル化を示す。このEVの過メチル化効果は、ポイント7ではあまり顕著ではありません。ここでは、メチル化分析のための単純で、高感度で、堅牢な手法を示しました。バイサルファイト変換を伴わない少量のDNAを必要とし、パラフィン埋め込みサンプルから単離されたDNAにも適しています。実験と分析の部分を含む全体の方法は、約2日かかります。ゲノム中のLINE-1のコピー数が多いため、通常サンプルではLINE-1のベースラインメチル化が高くなっています。したがって、この方法で観察されるサンプルのメチル化レベルの差は微妙であり得る。

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

木部形成に関与する遺伝子およびプロモーターを研究するための誘導性体細胞セクター分析（ISSA）の使用とセカンダリステム開発

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

具体的にはヒト細胞における選択的スプライシングを操作するために工学人工要因

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

生理的酸素条件に曝露されたヒト細胞におけるキャップ結合タンパク質の解析

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

慢性リンパ球性白血病患者におけるメチル-CpG結合ドメイン捕捉に基づく包括的DNAメチル化解析

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 CRISPR/Cas9 を使用して

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

南しみが付くことおよびポリメラーゼの連鎖反応を使用してマウス胚性幹細胞での相同組換えイベントの識別

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...