Name: line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles
Uploaded: 2020-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av Universitetet i Helsinki prosjektfinansiering (WBS490302, WBS73714112) Helsinki Universitetssykehus Statlig finansiering for universitetsnivå helseforskning (Y1014SUL05, TYH2016130), finsk-Norsk Medisinsk Foundation, og Selma og Maja-Lisa Selander Fund (Minerva Foundation). Vi takker Walter Pavicic for å ha gitt den modifiserte MSPA-protokollen og for relatert teknisk støtte. Vi er takknemlige til Teemu Masalin (Universitetet i Helsinki) for å hjelpe oss med videoproduksjon.

Denne studien ble godkjent av Etikkkomiteen i Helsinki og Uusimaa Hospital District (etisk godkjenning D. Nr. 217/13/03/02/2015).
1. Utarbeidelse av EV-utarmet FBS ved ultracentrifugering
<ol><li>Ta FBS i (ultra)sentrifugerør og plasser dem i ultracentrifuge bøtter. For å sikre at ultracentrifugeringen går jevnt og trygt, balanserer bøttene innenfor 10 mg av hverandre.</li>
	<li>Legg bøttene på en svingende rotor (type SW28, k-faktor 246). Plasser rotoren i ultracentrifuge og kjør p?...

<ol>
	<li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenomics:+DNA+methylomes+and+histone-modification+maps.">Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).</li><li>Herman, J. G., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+cancer+in+association+with+promoter+hypermethylation.">Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation.</a> New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+Cancer:+The+Next+Generation.">Hallmarks of Cancer: The Next Generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+transposition+of+endogenous+retroviral+elements+in+hypomethylation+induced+tumors+in+mice.">Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice.</a> Oncogene. 27, 404-408 (2008).</li><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome.">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409, 860-921 (2001).</li><li>Rodriguez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+instability+correlates+with+genome-wide+DNA+demethylation+in+human+primary+colorectal+cancers.">Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers.</a> Cancer Research. 66, 8462 (2006).</li><li>Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetic+progenitor+origin+of+human+cancer.">The epigenetic progenitor origin of human cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).</li><li>Bock, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiQ+Analyzer:+visualization+and+quality+control+for+DNA+methylation+data+from+bisulfite+sequencing.">BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing.</a> Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).</li><li>Schouten, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+quantification+of+40+nucleic+acid+sequences+by+multiplex+ligation-dependent+probe+amplification.">Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification.</a> Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).</li><li>Nygren, A. O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation-Specific+MLPA+(MS-MLPA):+simultaneous+detection+of+CpG+methylation+and+copy+number+changes+of+up+to+40+sequences.">Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences.</a> Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).</li><li>El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).</li><li>Vallabhaneni, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+bone+marrow+mesenchymal+stem/stromal+cells+transport+tumor+regulatory+microRNA,+proteins,+and+metabolites.">Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites.</a> Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).</li><li>Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-+derived+microvesicles:+important+and+underappreciated+mediators+of+cell-to-cell+communication.">Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication.</a> Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).</li><li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+as+mediators+of+intercellular+communication+in+cancer-+the+emerging+science+of+cellular+"debris".">Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris".</a> Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).</li><li>Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+mediate+the+horizontal+transfer+of+an+active+LINE-1+retrotransposon.">Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).</li><li>Mannerstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+alterations+in+mesenchymal+stem+cells+by+osteosarcoma-derived+extracellular+vesicles.">Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles.</a> Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).</li><li>Shelke, G. V., L&#228;sser, C., Gho, Y. S., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+exosome+depletion+protocols+to+eliminate+functional+and+RNA-containing+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).</li><li>Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+bovine+serum+RNA+interferes+with+the+cell+culture+derived+extracellular+RNA.">Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA.</a> Scientific Reports. 6, 31175 (2016).</li><li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).</li><li>Puhka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+profiling+of+extracellular+vesicles+and+alternative+normalization+methods+reveal+enriched+metabolites+and+strategies+to+study+prostate+cancer-related+changes.">Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes.</a> Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).</li><li>Peltoniemi, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+enrichment+does+not+warrant+a+higher+graft+survival+in+lipofilling+of+the+breast:+A+prospective+comparative+study.">Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study.</a> Journal of Plastic, Reconstructive &amp; Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).</li><li>Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltom&#228;ki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE-1+hypomethylation+in+familial+and+sporadic+cancer.">LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer.</a> Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).</li><li>. L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2) Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269</a> (2000)</li><li>Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland Available from: <a target="_blank" href="https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes">https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes</a> (2018)</li><li>. Takara Bio Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview">https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview</a> (2018)</li><li>Pisanic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+interspersed+nuclear+element+1+retrotransposons+become+deregulated+during+the+development+of+ovarian+cancer+precursor+lesions.">Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions.</a> The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).</li></ol>

Denne studien illustrerer hvordan MSPA kan brukes til å oppdage og kvantifisere metyleringsstatusen til et bestemt genetisk element. LINE-1 var fokusher, men sondene kan utformes for å målrette en rekke gener og sekvenser. Videre er det en voksende liste over sondeblandinger tilgjengelig for ulike applikasjoner. MSPA er en enkel og robust teknikk for DNA metylering analyse som ikke krever bisulfitt konvertering10. Den fullstendige prosedyren fra prøveforberedelse til dataanalyse tar rundt 2 da...

DNA metylering er en stor epigenetisk modifikasjon som forekommer i menneskelige celler. DNA-metylering refererer til koblingen av metylgrupper til cytosinrester i CpG dinukleotider. Slike dinukleotider finnes vanligvis i klynger (CpG-øyer) i 5'-regionen av gener1. I normale celler finnes de fleste av disse dinukleotider i en umetylert tilstand, noe som tillater DNA-transkripsjon. Forresten, mange kreftformer er forbundet med hypermethylated CpG øyer og transkripsjonomic deaktivering2, spesielt i tumor suppressor gener, som igjen bidrar til ulike kjennetegn på kreft3.
På den annen side er lange ispedd kjernefysiske elementer-1 (LINE-1s eller L1s) repeterende, transposable DNA-elementer som normalt har høye nivåer av metylering på CpG-øyene. Metylering av LINE-1 forhindrer translokasjon og bidrar til å opprettholde genomintegriteten. I flere typer kreft er LINE-1 hypomethylated, noe som resulterer i aktivering og påfølgende retrotransposition-mediert kromosomustabilitet4. LINE-1 står for nesten 17% av det menneskelige genomet5,og metyleringsstatusen kan tjene som en indikator på globale genomiske metyleringsnivåer6. Global LINE-1 hypometylering anses å gå forut for overgangen av celler til en tumor fenotype7; Derfor holder det løfte som en potensiell markør for tidlig kreft utbrudd.
For tiden er det flere metoder for metyleringsanalyse, inkludert pyrosequencing, metyleringsspesifikk PCR, mikroarrayer og kromatinimmunnedbør1. Bruken av neste generasjons sekvensering har også gjort det mulig å innlemme genomomfattende tilnærminger til påvisning av DNA-metylering. Mange av disse metodene er avhengige av bisulfittbehandlet DNA, hvor uformede cytosiner omdannes til uracil og metylerte cytosiner forblir uendret. Men, arbeider med bisulfitt behandlet DNA har flere fallgruver, for eksempel ufullstendige konverteringer av unmethylated cytosines til uracil, partisk forsterkning av sekvenser, og sekvensering feil8.
I metyleringsspesifikk probeforsterkning (MSPA) retter sonder bestående av to oligonucleotides DNA-sekvenser som inneholder et begrensningssted (GCGC) for det metyleringsfølsomme restriksjonsenzymet HhaI9. Etter at sondene hybridiserer til DNA, er hver prøve delt inn i to sett. Sonder i det første settet gjennomgår ligation, mens sonder i det andre settet gjennomgår ligation etterfulgt av HhaI-mediert fordøyelse på umetylerte CGCG-steder. Begge settene med prøver forsterkes deretter av PCR, og produktene er adskilt av kapillær elektroforese. Sonder på umetylerte steder fordøyes av HhaI og forsterkes ikke under PCR, noe som resulterer i ingen toppsignaler. Derimot er sonder på metylerte steder beskyttet mot fordøyelsen og forsterkes derfor under PCR, og genererer deretter toppsignaler10.
MSPA har flere fordeler fremfor alternative metoder. For det første krever det en lav mengde DNA (50–100 ng) og er godt egnet for analyse av DNA fra formalin-faste parafininnebygde prøver10. Det krever ikke bisulfittbehandlet DNA; faktisk er det uegnet for DNA som er modifisert på denne måten. Mange prøver kan analyseres samtidig, og MSPA-sonder kan utformes slik at de målretter mot flere gener eller sekvenser samtidig. I tillegg er sondene spesifikke og følsomme for metylert DNA da HhaI-begrensningsstedet tilsvarer en sekvens som er typisk for CpG-øyene10.
Denne studien undersøkte effekten av osteosarkom (OS)-avledet ekstracellulære vesikler (EV- er) på LINE-1-metylering i fettvevsavledede mesenchymale stamceller (AT-MSCer; Figur 1). EV-er er nanoskala, membranbundne vesikler utskilt av de fleste celletyper. De bærer proteiner, lipider, mRNA, microRNA og flere molekyler fra overordnede celler11,12. Ev-er medierer intercellulær kommunikasjon og spiller viktige roller i flere patofysiologiske forhold13,14. En fersk studie viste at kreftavledede EV-er kan overføre aktive LINE-1 til mottakerceller15. Det har blitt rapportert tidligere at EV fra HOS-143B cellelinjen kan endre metyleringstatus for LINE-1 i MSCer, i tillegg til andre genetiske effekter16.
Når voksende celler for EV isolasjon, er det viktig å bruke EV-utarmet føtal storfe serum [FBS] i vekstmediet, siden FBS-avledede EV-er kan forstyrre EV fra andre kilder og hemme resultatene17,18. Ultracentrifugering er en av de vanligste metodene for å tømme EV-er fra FBS. Det er en relativt enkel og kostnadseffektiv prosedyre sammenlignet med alternativer som ultrafiltrering og kommersiell EV-utarmet FBS19. Her demonstrerer protokollen også hvordan man forbereder EV-utarmet FBS ved ultracentrifugering.
Denne artikkelen presenterer en detaljert protokoll for de nevnte teknikkene, fra isolering av EV-er fra en OS-cellelinje til metyleringsanalyse av LINE-1 i OS-EV-behandlede MCer (figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+01T1</td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>MSC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3730XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BlueStar Prestained Protein Marker</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>MWP03</td>
			<td>WB: protein marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin (clone C5C9)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2679</td>
			<td>WB, dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 (clone H5C6)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556019</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5703000010</td>
			<td>For conditioned media and cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810000010</td>
			<td>For spinning down 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>331374</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 + GlutaMAX medium</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>For AT-MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneScan 500 LIZ size standard</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4322682</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WGA2-10RXN</td>
			<td>for MSPA negative control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Di formamide</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4311320</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOS-143B cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-8303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp70 (clone 5G10)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554243</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-mouse</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32210</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-rabbit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LINE-1 probe-mix primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Sequences in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4306737</td>
			<td>also requires sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td>measure protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniProtean TGX 10% gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1034</td>
			<td>WB: gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM14C</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>WB: protein transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue XS</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740901.50</td>
			<td>for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>WB: blocking, antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Antibiotics for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tube, 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431064</td>
			<td>For storing Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-11015</td>
			<td>WB: total protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RKO cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2577</td>
			<td>for MSPA positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 + GlutaMAX</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>61870-010</td>
			<td>For HOS-143B cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA HhaI enzyme</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>SMR50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA reagent kit</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>EK1-FAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA P300 probe-mix</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>P300-100R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging rotor SW-28</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342207</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>FPE-204-030</td>
			<td>sterile filtering FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai 12</td>
			<td>FEI Company</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Gatan Orius SC 
			1000B CCD-camera 
			(Gatan Inc., USA); for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS, 1X tablets</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-7500-100</td>
			<td>WB: buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>WB: transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TCA0096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>for trypsinization of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 (clone 4A10)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB2702167</td>
			<td>WB, dilution 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles

Metyleringsspesifikk probeforsterkning (MSPA) er en enkel og robust teknikk som kan brukes til å oppdage relative forskjeller i metyleringsnivåer av DNA-prøver. Det er ressurssterk, krever små mengder DNA, og tar rundt 4-5 t praktisk arbeid. I den presenterte teknikken blir DNA-prøver først denaturert og deretter hybridisert til sonder som retter seg mot DNA på enten metylerte eller referansesteder som en kontroll. Hybridisert DNA er delt inn i parallelle reaksjoner, en gjennomgår bare ligation og den andre gjennomgår ligation etterfulgt av HhaI-mediert fordøyelse på unmethylated GCGC sekvenser. De resulterende DNA-fragmentene forsterkes av PCR og skilles av kapillær elektroforese. Metylerte GCGC-nettsteder fordøyes ikke av HhaI og produserer toppsignaler, mens umetylerte GCGC-nettsteder fordøyes og ingen toppsignaler genereres. Sammenligning av de kontrollnormaliserte toppene av fordøyd og ufordøyd versjoner av hver prøve gir metylering dosering forholdet mellom en DNA-prøve. Her brukes MSPA til å oppdage effekten av osteosarkom-avledede ekstracellulære vesikler (EV-er) på metyleringsstatusen til lange interspersed kjernefysiske element-1 (LINE-1) i mesenchymale stamceller. LINE-1s er repeterende DNA-elementer som vanligvis gjennomgår hypometylering i kreft, og i denne kapasiteten kan tjene som en biomarkør. Ultracentrifugering brukes også som en kostnadseffektiv metode for å skille ekstracellulære vesikler fra biologiske væsker (dvs. ved utarbeidelse av EV-utarmet fosterstorfeserum [FBS] og isolere EV-er fra osteosarkomkondisjonerte medier [differensial sentrifugering]). For metyleringsanalyse er tilpassede LINE-1-sonder utformet for å målrette tre metyleringssteder i LINE-1-promotersekvensen og syv kontrollsteder. Denne protokollen demonstrerer bruk av MSPA for LINE-1 metyleringsanalyse og beskriver utarbeidelsen av EV-utarmet FBS ved ultracentrifugering.

Hovedmålet med denne studien var å evaluere de epigenetiske effektene av OS-EVs på MSCer. OS-EVs ble isolert fra HOS-143B-celler ved hjelp av standard differensialsentrifugeringsmetode. Uttrykk for de typiske EV-markørene CD63, Hsp70 og TSG101 ved vestlig blotting bekreftet tilstedeværelsen av OS-EV-er. (Figur 2A). Fravær av calnexin signal indikerte renhet av OS-EV isolat. Ytterligere indikasjon på renhet ble observert med TEM, med intakte vesikler av forskjellige st...

Watch this Scientific Journal Video about LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles at JoVE.com

LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

Beskrevet her er bruk av en metyleringsspesifikk probeforsterkningsmetode for å analysere metyleringsnivåer av LINE-1-elementer i mesenchymale stamceller behandlet med osteosarkom-avledede ekstracellulære vesikler. Ultracentrifugering, en populær prosedyre for å skille ekstracellulære vesikler fra føtal storfe serum, er også demonstrert.

LINE-1 Metyleringsanalyse i mesenchymale stamceller behandlet med osteosarkom-avledet ekstracellulære vesikler

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of ...

DNA-metylering er en av de mest studerte epigenetiske signaturene. Mange kreftformer er preget av endringer i DNA-metyleringsnivåer, som er forbundet med avvikende genuttrykk og andre genomiske abnormiteter. Lange ispedd kjernefysiske elementer er repeterende transponerbare genomiske sekvenser som normalt har høye nivåer av metylering.Imidlertid blir de ofte hypermetylert i kreft, noe som resulterer i aktivering og fører til kromosomal ustabilitet. I denne studien behandlet vi mesenchymale stamceller med osteosarkom-avledede ekstracellulære vesikler for å se om kreft-EV-er kan påvirke LINE-1-metylering i MECer. Føtal storfe serum, som er en integrert komponent i pattedyr celle kultur media, inneholder et stort antall storfe-avledet EV.Disse Evs vil forstyrre analyse av Evs fra celler av vår interesse, derfor, når du vokser celler for EV-isolasjon, er det viktig å bruke EV-utarmet FBS. Ta FBS i ultracentrifuge rør og plassere dem i ultracentrifuge bøtter. Balansere bøtter til innenfor 10 milligram av hverandre før du laster dem på en svingende rotor.Plasser rotoren i ultracentrifuge og kjør på 100 000 G i 19 timer ved fire grader Celsius. Etter løpet, forsiktig samle det lyse øvre laget av supernatant og overføre den til en 50 milliliter tube. Ikke forstyrr eller pipet den mørkebrune pelleten, da den inneholder EV-er fra FBS.Send supernatanten gjennom et 0,22 mikronfilter inn i et nytt 50 milliliter rør. Denne filtersteriliserte, EV-utarmede FBS kan nå legges til cellekulturmedier når de vokser celler for EV-isolasjon. Samle inn betingede medier fra osteosarkomceller dyrket i EV-utarmet media.For å fjerne celler og celleavfall, sentrifuger det bedede mediet ved 2500 G i 20 minutter ved fire grader Celsius. Overfør supernatant til ultracentrifuge rør og balansere dem som tidligere. Sentrifuger rørene ved 100.000 G i to timer ved fire grader Celsius.Kast forsiktig det overnaturlige som etterlater seg rundt en milliliter nederst. Tilsett rundt 20 milliliter PBS til røret og pipet forsiktig for å vaske og re-suspendere EV pellet. Balansere rørene og utfør en ny runde med ultracentrifugation med de samme innstillingene.Fjern forsiktig det overnaturlige og suspender EV-pelleten forsiktig i 200 mikroliter PBS ved skånsom pipettering. Oppbevar EV-ene i lavbindingsrør. Rensede EV-er er preget av vestlig blotting, nanopartikkelsporingsanalyse og overføring av elektronmikroskopi.Plate 15 000 MSCer per brønn i en 24 brønnplate. Etter 24 timer fjerner du gamle medier, vasker cellene med PBS og bytter til EV-utarmet medium. Behandle celler med OS-EV-er på de planlagte tidspunktene.Etter å ha stoppet EV-behandlingen, trekk ut DNA fra cellene ved hjelp av en passende metode. For metyleringsanalyse brukte vi en skreddersydd metyleringsspesifikk sondeforsterkningsmetode. Design de tilpassede LINE-1 sondene, som gjort tidligere, av Pavicic og andre.For metyleringssonder velger du tre sekvenser som inneholder HhaI-begrensningsområdet i promoterregionen. For kontrollsonder velger du syv sekvenser som mangler HhaI-restriksjonsstedet fra resten av LINE-1-sekvensen. Fortynn 70 nanogram DNA-prøve i TE-buffer til fem mikroliter.Varm prøvene i 10 minutter ved 98 grader Celsius og avkjøl deretter til 25 grader Celsius. Legg til tre mikroliter probehybridiseringsblanding i hver prøve og kjør termocycleren slik at sondene kan hybridiseres til DNA. Ved romtemperatur, legg til 30 mikroliter etter hybridiseringsblanding til hver prøve.Overfør 10 mikroliter til et annet rør. Plasser begge rørsettene i termocycleren og inkuber ved 48 grader Celsius i minst ett minutt. Mens prøvene er på 48 grader Celsius, legg til 10 mikroliter ligation blanding til det første settet med rør og 10 mikroliter ligation-fordøyelse blanding til det andre settet med rør.Kjør neste thermocylcer program. Deretter spinner du ned rørene og setter termocycleren samtidig til 72 grader Celsius. Tilsett fem mikroliter polymeraseblanding til hvert rør og plasser rørene i termocycleren.Kjør PCR-programmet. Mens PCR-programmet kjører, kan du lage en løsning på en milliliter formamid som inneholder 2,5 mikroliter størrelsesstandard. Pipet 10 mikroliter av denne oppløsningen til hver rad av en optisk 96 brønnplate.Etter PCR fortynnes de ufordøyde og de fordøyde prøvene til henholdsvis ett til hundre og ett til to hundre, henholdsvis i ultra rent vann. Tilsett to mikroliter fortynnet PCR-produkt til 96-brønnplaten. Sentrifuger platen ved 200 G i 15 til 20 sekunder for å fjerne luftbobler.Utfør fragmentanalyse av prøver ved kapillær elektroforese. Åpne kapillærelektroforese resulterer i en elektroferogram analyse programvare. Velg en prøve, og sett panelet til MLPA fra menyen.Klikk på panelet og trykk på kontroll D for å bruke denne innstillingen på alle eksemplene. På samme måte setter du analysemetoden til mikrosatellittstandard for alle prøver. Velg alle eksemplene og klikk på den grønne avspillingsknappen for å kjøre analyse, velg deretter alle eksemplene og klikk på grafknappen for å visualisere sondetoppene.Zoom inn på toppområdet for en høyere oppløsning av de enkelte toppene. Kontroller at alle de 10 toppene som tilsvarer probene fra LINE-1-probeblandingen er merket. I kategorien Genotyper eksporterer du resultatene i CSV-formatet.Åpne filen CSV i en dataanalyseprogramvare og sorter dataene i kolonner. Merk de tre metyleringssiden topper basert på deres størrelser. De resterende syv toppene tilsvarer kontrollsondene.Her bruker vi LINE-1 2M sondetopper som har en størrelse på omtrent 117 basispar. For hvert utvalg beregner du sumtoppområdet for alle de syv kontrolltoppene. Del toppområdet for hver LINE-1-sonde med denne summen.For hver prøve, dele verdien av den fordøyde prøven ved den ufordøyde prøven for å oppnå metylering dosering forholdet. Western blotting analyse bekreftet tilstedeværelsen av OS-EV-er med signaler observert for TSG101, HSP70 og CD63. Fravær av calnexin signal indikerte at EV-prøven var ren.Ytterligere indikasjon på renhet ble observert med TEM med intakte vesikler av ulike størrelser som finnes i OS-EV-prøven. OS-EV partikkelkonsentrasjon og størrelsesfordeling ble målt ved NTA. 80% av EV-ene var i størrelsesområdet 50 til 200 nanometer.Her kan vi se metylering doseringsforholdene på LINE-1 fra MSCer på forskjellige tidspunkter i EV-behandlingen. Den grå linjen representerer baseline metyleringsnivå fra punkt null. På tidspunkt tre er det en reduksjon i gjennomsnittlig metyleringsdoseringsforhold etter administrering av EV-er, og indikerer dermed hypermetylering.Denne hypermetyleringseffekten av EV-ene er mindre uttalt på tidspunkt syv. Her har vi vist en enkel, svært følsom og robust teknikk for metyleringsanalyse. Det krever en lav mengde DNA uten bisulfittkonvertering involvert, og det er også egnet for DNA isolert fra parafin-innebygde prøver.Hele metoden, med eksperimentelle og analytiske deler, tar rundt to dager. På grunn av et høyt kopinummer på LINE-1 i genomet, er baselinemetylering av LINE-1 høy i normale prøver. Derfor kan forskjellene i metyleringsnivåer av prøver, som observert med denne metoden, være subtile.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Bruk av indusert Somatisk Sector Analysis (ISSA) for å studere gener og arrangører involvert i Wood Dannelse og Sekundær Stem Development

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Ingeniør Kunstige Faktorer å Spesifikt Manipulere alternativ spleising i humane celler

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analyse av Cap-bindende proteiner i humane celler eksponert for Fysiologiske oksygenforholdene

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

Omfattende DNA-metyleringsanalyse ved bruk av en metyl-CpG-bindende domene-fangstbasert metode i kroniske lymfocytiske leukemi-pasienter

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining for DNA modifikasjoner: beregningsorientert analyse av AC Confocal bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Svært effektiv Gene avbrudd i Murine og menneskelig blodkreft stamfar celler av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Forbedret genomet redigering med Cas9 Ribonucleoprotein i ulike celler og organismer

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metodikk for nøyaktig påvisning av Mitokondrielt DNA metylering

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein merking i menneskelig indusert Pluripotent stilk celler med CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifikasjon av homologe rekombinasjon hendelser i mus embryonale stamceller Southern Blotting og polymerasekjedereaksjons

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...