Name: line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles
Uploaded: 2020-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo financiamento do projeto da Universidade de Helsinque (WBS490302, WBS73714112) Financiamento do Hospital Estadual da Universidade de Helsinque para pesquisa em saúde de nível universitário (Y1014SUL05, TYH22016130), Fundação Médica Finlandesa-Norueguesa e Selma e Fundo Maja-Lisa Selander (Fundação Minerva). Agradecemos a Walter Pavicic por fornecer o protocolo MSPA modificado e pelo suporte técnico relacionado. Somos gratos a Teemu Masalin (Universidade de Helsinque) por nos ajudar na produção de vídeo.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Distrito Hospitalar de Helsinque e Uusimaa (aprovação ética d. 217/13/03/2015).
1. Preparação de FBS empobrecido por EV por ultracentrifugação
<ol><li>Pegue os tubos de centrífuga (ultra)centrífugas e coloque-os em baldes de ultracentrífugas. Para garantir que a ultracentrífuga corra de forma suave e segura, equilibre os baldes dentro de 10 mg um do outro.</li>
	<li>Carregue os baldes em um rotor balançando (tipo SW28, fator K 24...

<ol>
	<li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenomics:+DNA+methylomes+and+histone-modification+maps.">Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).</li><li>Herman, J. G., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+cancer+in+association+with+promoter+hypermethylation.">Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation.</a> New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+Cancer:+The+Next+Generation.">Hallmarks of Cancer: The Next Generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+transposition+of+endogenous+retroviral+elements+in+hypomethylation+induced+tumors+in+mice.">Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice.</a> Oncogene. 27, 404-408 (2008).</li><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome.">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409, 860-921 (2001).</li><li>Rodriguez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+instability+correlates+with+genome-wide+DNA+demethylation+in+human+primary+colorectal+cancers.">Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers.</a> Cancer Research. 66, 8462 (2006).</li><li>Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetic+progenitor+origin+of+human+cancer.">The epigenetic progenitor origin of human cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).</li><li>Bock, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiQ+Analyzer:+visualization+and+quality+control+for+DNA+methylation+data+from+bisulfite+sequencing.">BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing.</a> Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).</li><li>Schouten, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+quantification+of+40+nucleic+acid+sequences+by+multiplex+ligation-dependent+probe+amplification.">Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification.</a> Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).</li><li>Nygren, A. O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation-Specific+MLPA+(MS-MLPA):+simultaneous+detection+of+CpG+methylation+and+copy+number+changes+of+up+to+40+sequences.">Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences.</a> Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).</li><li>El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).</li><li>Vallabhaneni, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+bone+marrow+mesenchymal+stem/stromal+cells+transport+tumor+regulatory+microRNA,+proteins,+and+metabolites.">Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites.</a> Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).</li><li>Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-+derived+microvesicles:+important+and+underappreciated+mediators+of+cell-to-cell+communication.">Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication.</a> Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).</li><li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+as+mediators+of+intercellular+communication+in+cancer-+the+emerging+science+of+cellular+"debris".">Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris".</a> Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).</li><li>Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+mediate+the+horizontal+transfer+of+an+active+LINE-1+retrotransposon.">Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).</li><li>Mannerstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+alterations+in+mesenchymal+stem+cells+by+osteosarcoma-derived+extracellular+vesicles.">Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles.</a> Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).</li><li>Shelke, G. V., L&#228;sser, C., Gho, Y. S., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+exosome+depletion+protocols+to+eliminate+functional+and+RNA-containing+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).</li><li>Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+bovine+serum+RNA+interferes+with+the+cell+culture+derived+extracellular+RNA.">Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA.</a> Scientific Reports. 6, 31175 (2016).</li><li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).</li><li>Puhka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+profiling+of+extracellular+vesicles+and+alternative+normalization+methods+reveal+enriched+metabolites+and+strategies+to+study+prostate+cancer-related+changes.">Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes.</a> Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).</li><li>Peltoniemi, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+enrichment+does+not+warrant+a+higher+graft+survival+in+lipofilling+of+the+breast:+A+prospective+comparative+study.">Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study.</a> Journal of Plastic, Reconstructive &amp; Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).</li><li>Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltom&#228;ki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE-1+hypomethylation+in+familial+and+sporadic+cancer.">LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer.</a> Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).</li><li>. L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2) Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269</a> (2000)</li><li>Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland Available from: <a target="_blank" href="https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes">https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes</a> (2018)</li><li>. Takara Bio Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview">https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview</a> (2018)</li><li>Pisanic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+interspersed+nuclear+element+1+retrotransposons+become+deregulated+during+the+development+of+ovarian+cancer+precursor+lesions.">Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions.</a> The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).</li></ol>

Este estudo ilustra como o MSPA pode ser usado para detectar e quantificar o estado de metilação de um elemento genético específico. Line-1 era o foco aqui, mas as sondas podem ser projetadas para atingir uma gama de genes e sequências. Além disso, há uma lista crescente de mixes de sondas disponíveis para diferentes aplicações. MSPA é uma técnica simples e robusta para análise de metilação de DNA que não requer conversão bisulfite10. O procedimento completo da preparação da amo...

A metilação de DNA é uma grande modificação epigenética que ocorre em células humanas. A metilação de DNA refere-se à ligação de grupos de metila a resíduos de citosina em dinucleotídeos cpg. Tais dinucleotídeos são geralmente encontrados em aglomerados (ilhas CpG) na região de 5' genes1. Em células normais, a maioria desses dinucleotídeos existem em um estado não metilado, o que permite a transcrição do DNA. Aliás, muitos cânceres estão associados a ilhas cpg hipermetiladas e silenciamento transcrita2, especialmente em genes supressores tumorais, que por sua vez contribuem para várias marcas do câncer3.
Por outro lado, elementos nucleares longos intercalados-1 (LINE-1 s ou L1s) são elementos repetitivos e transposáveis de DNA que normalmente têm altos níveis de metilação nas ilhas CpG. A metilação da LINHA-1 previne a translocação e ajuda a manter a integridade do genoma. Em vários tipos de câncer, a LINE-1 é hipometificada, resultando em ativação e subsequente instabilidade cromossômica mediada pela retrotransposição4. A LINHA-1 é responsável por quase 17% do genoma humano5,e seu status de metilação pode servir como um indicador dos níveis globais de metilação genômica6. A hipometração global line-1 é considerada para preceder a transição das células para um fenótipo tumoral7; portanto, mantém a promessa como um marcador potencial para o início precoce do câncer.
Atualmente, existem vários métodos para análise de metilação, incluindo pirosequenciamento, PCR específico de metilação, micromatrizes e imunoprecipitação de cromatina1. O uso do sequenciamento de próxima geração também possibilitou incorporar abordagens em todo o genoma à detecção da metilação do DNA. Muitos desses métodos dependem de DNA tratado com bisulfite, no qual citosinas não metiladas são convertidas em citosinas uracil e metiladas permanecem inalteradas. No entanto, trabalhar com DNA tratado com bisulfite tem várias armadilhas, como conversões incompletas de citosinas não metiladas ao uracil, amplificação tendenciosa de sequências e erros de sequenciamento8.
Na amplificação de sondaespecífica de metilação (MSPA), sondas compostas por duas oligonucleotídeas têm como alvo sequências de DNA contendo um local de restrição (GCGC) para a enzima de restrição sensível à metilação HhaI9. Após as sondas hibridizarem para o DNA, cada amostra é dividida em dois conjuntos. Sondas no primeiro set passam por ligação, enquanto as sondas no segundo set passam por ligação seguidas por hhaI mediada digestão em sites CGCG não metilados. Ambos os conjuntos de amostras são então amplificados pelo PCR, e os produtos são separados por eletroforese capilar. Sondas em locais não metilados são digeridas por HhaI e não são amplificadas durante o PCR, resultando em sinais de pico. Em contrapartida, as sondas em locais metilados são protegidas da digestão e, portanto, são amplificadas durante o PCR, gerando posteriormente sinais de pico10.
O MSPA tem várias vantagens em relação a métodos alternativos. Primeiro, requer uma baixa quantidade de DNA (50-100 ng) e é adequado para análise de DNA de amostras incorporadas de parafina fixafixa 10. Não requer DNA tratado com bisulfite; na verdade, é inadequado para DNA que é modificado desta forma. Muitas amostras podem ser analisadas ao mesmo tempo, e as sondas MSPA podem ser projetadas de tal forma que visam vários genes ou sequências simultaneamente. Além disso, as sondas são específicas e sensíveis para dna metilado, pois o local de restrição HhaI corresponde a uma sequência típica das ilhas CpG10.
Este estudo investigou os efeitos das vesículas extracelulares derivadas do osteossarcoma (OS) na metilação LINE-1 em células-tronco mesenquimal derivadas de tecido adiposo (AT-MSCs; Figura 1). Os EVs são nanoescala, vesículas ligadas à membrana secretadas pela maioria dos tipos de células. Eles carregam proteínas, lipídios, mRNA, microRNA e moléculas adicionais das células-mãe11,12. Os EVs mediam a comunicação intercelular e desempenham papéis importantes em várias condições patosfisias13,14. Um estudo recente mostrou que os EVs derivados do câncer podem transferir o LINE-1 ativo para células receptoras15. Foi relatado anteriormente que os EVs da linha celular HOS-143B podem alterar o estado de metilação da LINHA-1 em MSCs, além de outros efeitos genéticos16.
Ao cultivar células para isolamento ev, é importante usar o soro bovino fetal esgotado por EV [FBS] no meio de crescimento, uma vez que os EVs derivados do FBS podem interferir com EVs de outras fontes e dificultar os resultados17,18. Ultracentrifugação é um dos métodos mais comuns para esgotar EVs da FBS. É um procedimento relativamente simples e econômico em comparação com alternativas como ultrafiltração e FBS19emesquetes comerciais de EV . Aqui, o protocolo também demonstra como preparar o FBS esgotado por EV por ultracentrifugação.
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para as técnicas acima mencionadas, desde o isolamento de EVs de uma linha de células OS até a análise de metilação da LINHA-1 em MSCs tratados com OS-EV(Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+01T1</td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>MSC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3730XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BlueStar Prestained Protein Marker</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>MWP03</td>
			<td>WB: protein marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin (clone C5C9)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2679</td>
			<td>WB, dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 (clone H5C6)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556019</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5703000010</td>
			<td>For conditioned media and cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810000010</td>
			<td>For spinning down 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>331374</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 + GlutaMAX medium</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>For AT-MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneScan 500 LIZ size standard</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4322682</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WGA2-10RXN</td>
			<td>for MSPA negative control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Di formamide</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4311320</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOS-143B cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-8303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp70 (clone 5G10)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554243</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-mouse</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32210</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-rabbit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LINE-1 probe-mix primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Sequences in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4306737</td>
			<td>also requires sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td>measure protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniProtean TGX 10% gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1034</td>
			<td>WB: gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM14C</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>WB: protein transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue XS</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740901.50</td>
			<td>for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>WB: blocking, antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Antibiotics for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tube, 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431064</td>
			<td>For storing Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-11015</td>
			<td>WB: total protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RKO cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2577</td>
			<td>for MSPA positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 + GlutaMAX</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>61870-010</td>
			<td>For HOS-143B cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA HhaI enzyme</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>SMR50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA reagent kit</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>EK1-FAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA P300 probe-mix</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>P300-100R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging rotor SW-28</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342207</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>FPE-204-030</td>
			<td>sterile filtering FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai 12</td>
			<td>FEI Company</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Gatan Orius SC 
			1000B CCD-camera 
			(Gatan Inc., USA); for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS, 1X tablets</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-7500-100</td>
			<td>WB: buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>WB: transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TCA0096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>for trypsinization of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 (clone 4A10)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB2702167</td>
			<td>WB, dilution 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles

A amplificação de sondas específicas de metilação (MSPA) é uma técnica simples e robusta que pode ser usada para detectar diferenças relativas nos níveis de metilação de amostras de DNA. É engenhoso, requer pequenas quantidades de DNA, e leva cerca de 4-5 h de trabalho prático. Na técnica apresentada, as amostras de DNA são primeiro desnaturadas e hibridizadas para sondas que visam DNA em locais metilados ou de referência como controle. O DNA hibrilado é separado em reações paralelas, uma passando apenas por ligadura e outra passando por ligadura seguida de digestão mediada por HhaI em sequências de GCGC não metiladas. Os fragmentos de DNA resultantes são amplificados pelo PCR e separados por eletroforese capilar. Os locais de GCGC metilados não são digeridos pelo HhaI e produzem sinais de pico, enquanto os locais de GCGC não metilados são digeridos e nenhum sinal de pico é gerado. Comparar os picos normalizados de controle de versões digeridas e não digeridas de cada amostra fornece a razão de dosagem de metilação de uma amostra de DNA. Aqui, o MSPA é usado para detectar os efeitos das vesículas extracelulares derivadas de osteossarcoma (EVs) sobre o estado de metilação do elemento nuclear longo-1 (LINE-1) em células-tronco mesenquimicas. Line-1 s são elementos repetitivos de DNA que normalmente sofrem hipometiação no câncer e, nesta capacidade, podem servir como um biomarcador. A ultracentrifugação também é usada como um método econômico para separar vesículas extracelulares de fluidos biológicos (ou seja, ao preparar o soro bovino fetal empobrecido por EV [FBS] e isolando OsVs da mídia condicionada pela osteossarcoma [centrífuga diferencial]). Para análise de metilação, as sondas LINE-1 personalizadas são projetadas para atingir três locais de metilação na sequência de promotores line-1 e sete locais de controle. Este protocolo demonstra o uso do MSPA para análise de metilação LINE-1 e descreve a preparação do FBS empobrecido por EV por ultracentrifugação.

O principal objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos epigenéticos dos OS-EVs em MSCs. Os OS-EVs foram isolados das células HOS-143B usando o método diferencial padrão de centrífuga. A expressão dos marcadores EV típicos CD63, Hsp70 e TSG101 por manchas ocidentais confirmou a presença de OS-EVs. (Figura 2A). Ausência de sinal de calnexina indicou pureza do isolado OS-EV. Observou-se indicação adicional de pureza com TEM, com vesículas intactas de vários taman...

Watch this Scientific Journal Video about LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles at JoVE.com

LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

Descrito aqui está o uso de um método específico de amplificação de sondas para analisar os níveis de metilação de elementos LINE-1 em células-tronco mesenquimicas tratadas com vesículas extracelulares derivadas de osteossarcoma. A ultracentrífugação, procedimento popular para separar vesículas extracelulares do soro bovino fetal, também é demonstrado.

Análise de metilação LINE-1 em células-tronco mesenquimicas tratadas com vesículas extracelulares derivadas de Osteosarcoma

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of ...

A metilação de DNA é uma das assinaturas epigenéticas mais estudadas. Muitos cânceres são caracterizados por mudanças nos níveis de metilação do DNA, que estão associados à expressão genética aberrante e outras anormalidades genômicas. Longos elementos nucleares intercalados são sequências genômicas transpossíveis repetitivas que normalmente têm altos níveis de metilação.No entanto, muitas vezes eles se tornam hipermetilados no câncer, o que resulta em sua ativação e leva à instabilidade cromossômica. Neste estudo, tratamos células-tronco mesenquimais com vesículas extracelulares derivadas de osteossarcoma para ver se os EVs de câncer podem afetar a metilação LINE-1 em MECs. O soro bovino fetal, que é um componente integral da mídia de cultura celular de mamíferos, contém um grande número de EVs derivados de bovinos.Estes Evs interferirão na análise de Evs a partir de células de nosso interesse, portanto, quando as células de crescimento para o isolamento de EV, é importante usar FBS esgotados pelo EV. Pegue FBS em tubos ultracentrífugas e coloque-os em baldes ultracentrífugas. Equilibre os baldes para dentro de 10 miligramas um do outro antes de carregá-los em um rotor balançando.Coloque o rotor no ultracentrifuuge e corra a 100.000 G durante 19 horas a quatro graus Celsius. Após a corrida, colete cuidadosamente a camada superior de cor clara do supernasal e transfira-a para um tubo de 50 mililitros. Não perturbe ou encoresta a pelota marrom escura, pois contém EVs da FBS.Passe o supernante através de um filtro de 0,22 míclica em um novo tubo de 50 mililitros. Este FBS esterilizado por filtro, esgotado por EV, agora pode ser adicionado aos meios de cultura celular ao cultivar células para o isolamento de EV. Coletar mídia condicionada de células osteossarcoma cultivadas em mídia esgotada pelo EV.Para remover células e detritos celulares, centrifugar a mídia condicionada a 2500 G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o supernatante para tubos ultracentrífugas e equilibre-os como anteriormente. Centrifugar os tubos a 100.000 G por duas horas a quatro graus Celsius.Descarte cuidadosamente o supernatante deixando em torno de um mililitro na parte inferior. Adicione cerca de 20 mililitros de PBS ao tubo e cano suavemente, a fim de lavar e suspender a pelota EV. Equilibre os tubos e realize outra rodada de ultracentrifugação com as mesmas configurações.Remova cuidadosamente o supernascer e suspenda a pelota EV em 200 microliters de PBS por tubulação suave. Armazene os EVs em tubos de baixa ligação. Os EVs purificados são caracterizados por manchas ocidentais, análise de rastreamento de nanopartículas e microscopia eletrônica de transmissão.Placa 15.000 MSCs por poço em uma placa de 24 poços. Após 24 horas, remova a mídia antiga, lave as células com PBS e mude para mídia esgotada pelo EV. Trate as células com OS-EVs nos pontos de hora programados.Depois de parar o tratamento de EV, extraia DNA das células usando um método apropriado. Para análise de metilação, utilizamos um método de amplificação de sonda específico para metilação feito sob medida. Projete as sondas LINE-1 personalizadas, como feito anteriormente, pela Pavicic e outras.Para sondas de metilação, selecione três sequências contendo o local de restrição hhaI dentro da região do promotor. Para testes de controle, selecione sete sequências sem o local de restrição HhaI do resto da sequência LINE-1. Diluir 70 nanogramas de amostra de DNA no buffer te para cinco microliters.Aqueça as amostras por 10 minutos a 98 graus Celsius e esfrie até 25 graus Celsius. Adicione três microliters de mistura de hibridização da sonda a cada amostra e execute o termociclador para permitir que as sondas hibridizem ao DNA. À temperatura ambiente, adicione 30 microliters de mistura pós-hibridização a cada amostra.Transfira 10 microliters para um segundo tubo. Coloque ambos os conjuntos de tubos no termociclador e incubar a 48 graus Celsius por pelo menos um minuto. Enquanto as amostras estão a 48 graus Celsius, adicione 10 microliters de mistura de ligadura ao primeiro conjunto de tubos e 10 microliters de mistura de ligadura-digestão ao segundo conjunto de tubos.Execute o próximo programa termociclcer. Em seguida, gire os tubos e, simultaneamente, coloque o termociclador a 72 graus Celsius. Adicione cinco microliters de mistura de polimerase a cada tubo e coloque os tubos no termociclador.Execute o programa PCR. Enquanto o programa PCR estiver em execução, prepare uma solução de uma formamida mililitro contendo 2,5 microliters de tamanho padrão. Pipet 10 microliters desta solução para cada linha de uma placa óptica de 96 poços.Após pcr, diluir as amostras não digeridas e digeridas para um a cento e um a duzentos, respectivamente em água ultra pura. Adicione dois microliters de produto PCR diluído à placa de 96 poços. Centrifugar a placa a 200 G por 15 a 20 segundos para remover bolhas de ar.Realizar a análise de fragmentos de amostras por eletroforese capilar. Abrir a eletroforese capilar resulta em um software de análise de eletroferógrama. Selecione uma amostra e defina o painel para MLPA no menu.Clique no painel e pressione o controle D para aplicar esta configuração em todas as amostras. Da mesma forma, defina o método de análise como padrão de microsatélite para todas as amostras. Selecione todas as amostras e clique no botão de reprodução verde para executar a análise e selecione todas as amostras e clique no botão gráfico para visualizar os picos da sonda.Aproxime-se da região de pico para uma maior resolução dos picos individuais. Certifique-se de que todos os 10 picos correspondentes aos testes da mistura de sonda LINE-1 estejam rotulados. Na guia genótipos, exporte os resultados no formato CSV.Abra o arquivo CSV em um software de análise de dados e classifique os dados em colunas. Rotule os três picos do local de metilação com base em seus tamanhos. Os sete picos restantes correspondem às sondas de controle.Aqui estamos usando os picos da sonda LINE-1 2M que têm um tamanho de aproximadamente 117 pares de base. Para cada amostra, calcule a área de pico de soma de todos os sete picos de controle. Divida a área de pico de cada sonda LINE-1 por esta soma.Para cada amostra, divida o valor da amostra digerida pela amostra não digerida para obter a razão de dosagem de metilação. A análise de manchas ocidentais confirmou a presença de OS-EVs com sinais observados para TSG101, HSP70 e CD63. A ausência de sinal de calnexin indicou que a amostra de EV era pura.Foi observada indicação adicional de pureza com TEM com vesículas intactas de vários tamanhos presentes na amostra os-EV. A concentração de partículas e distribuição de tamanho do OS-EV foi medida pela NTA. 80% dos EVs estavam na faixa de tamanho de 50 a 200 nanômetros.Aqui podemos ver as razões de dosagem de metilação de LINE-1 de MSCs em diferentes pontos de tempo do tratamento EV. A linha cinza representa o nível de metilação da linha de base a partir do ponto zero do tempo. No ponto três, há uma diminuição na relação média de dosagem de metilação após a administração de EVs, indicando assim hipermetilação.Este efeito de hipermetilação dos EVs é menos pronunciado no ponto sete do tempo. Aqui mostramos uma técnica simples, altamente sensível e robusta para análise de metilação. Requer uma baixa quantidade de DNA sem conversão de bisullfita envolvida e também é adequado para DNA isolado de amostras incorporadas à parafina.Todo o método, com as partes experimentais e analíticas, leva cerca de dois dias. Devido a um alto número de cópias de LINE-1 no genoma, a metilação de linha de base de LINE-1 é alta em amostras normais. Portanto, as diferenças nos níveis de metilação das amostras, como observado com este método, podem ser sutis.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

O uso de Induced Somatic Análise Sector (ISSA) para estudar genes e promotores envolvidos na formação da madeira e Desenvolvimento secundária da haste

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Genética

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Engenharia de fatores artificiais para manipular Especificamente splicing alternativo em células humanas

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Análise de proteínas Cap-ligação em células humanas expostas a condições de oxigênio fisiológicos

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

Análise abrangente de metilação de DNA usando um método baseado em captação de domínio de ligação de metil-CpG em pacientes com leucemia linfocítica crônica

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining para modificações do DNA: análise computacional de imagens Confocal

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Maior genoma edição com Cas9 Ribonucleoprotein em diversas células e organismos

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metodologia para detecção precisa de metilação do DNA mitocondrial

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Proteína endógena de marcação em humanos induzida por células-tronco pluripotentes usando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identificação de eventos de recombinação homóloga em células-tronco embrionárias de camundongo usando Southern Blotting e reação em cadeia da polimerase

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...