Name: line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles
Uploaded: 2020-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles at JoVE.com

Эта работа была профинансирована финансированием проекта Хельсинкского университета (WBS490302, WBS73714112) Хельсинкский университет больницы государственного финансирования университетских исследований в области здравоохранения (Y1014SUL05, TYH2016130), Финско-норвежского медицинского фонда, и Сельма и Фонд Майя-Лиза Селандер (Фонд Минерва). Мы благодарим Вальтера Павича за предоставление измененного протокола MSPA и за соответствующую техническую поддержку. Мы благодарны Теему Масалину (Хельсинкский университет) за помощь в видеопроизводстве.

Данное исследование было одобрено Комитетом по этике Хельсинки и больницы Уусимаа (этическое утверждение Д. No 217/13/03/02/2015).
1. Подготовка EV-исчерпаны FBS путем ультрацентрифугации
<ol><li>Возьмите FBS в (ультра)центрифуговых труби и поместите их в ультрацентрифуге ведра. Чтобы у?...

<ol>
	<li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenomics:+DNA+methylomes+and+histone-modification+maps.">Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).</li><li>Herman, J. G., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+cancer+in+association+with+promoter+hypermethylation.">Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation.</a> New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+Cancer:+The+Next+Generation.">Hallmarks of Cancer: The Next Generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+transposition+of+endogenous+retroviral+elements+in+hypomethylation+induced+tumors+in+mice.">Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice.</a> Oncogene. 27, 404-408 (2008).</li><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome.">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409, 860-921 (2001).</li><li>Rodriguez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+instability+correlates+with+genome-wide+DNA+demethylation+in+human+primary+colorectal+cancers.">Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers.</a> Cancer Research. 66, 8462 (2006).</li><li>Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetic+progenitor+origin+of+human+cancer.">The epigenetic progenitor origin of human cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).</li><li>Bock, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiQ+Analyzer:+visualization+and+quality+control+for+DNA+methylation+data+from+bisulfite+sequencing.">BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing.</a> Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).</li><li>Schouten, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+quantification+of+40+nucleic+acid+sequences+by+multiplex+ligation-dependent+probe+amplification.">Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification.</a> Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).</li><li>Nygren, A. O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation-Specific+MLPA+(MS-MLPA):+simultaneous+detection+of+CpG+methylation+and+copy+number+changes+of+up+to+40+sequences.">Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences.</a> Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).</li><li>El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).</li><li>Vallabhaneni, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+bone+marrow+mesenchymal+stem/stromal+cells+transport+tumor+regulatory+microRNA,+proteins,+and+metabolites.">Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites.</a> Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).</li><li>Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-+derived+microvesicles:+important+and+underappreciated+mediators+of+cell-to-cell+communication.">Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication.</a> Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).</li><li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+as+mediators+of+intercellular+communication+in+cancer-+the+emerging+science+of+cellular+"debris".">Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris".</a> Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).</li><li>Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+mediate+the+horizontal+transfer+of+an+active+LINE-1+retrotransposon.">Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).</li><li>Mannerstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+alterations+in+mesenchymal+stem+cells+by+osteosarcoma-derived+extracellular+vesicles.">Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles.</a> Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).</li><li>Shelke, G. V., L&#228;sser, C., Gho, Y. S., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+exosome+depletion+protocols+to+eliminate+functional+and+RNA-containing+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).</li><li>Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+bovine+serum+RNA+interferes+with+the+cell+culture+derived+extracellular+RNA.">Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA.</a> Scientific Reports. 6, 31175 (2016).</li><li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).</li><li>Puhka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+profiling+of+extracellular+vesicles+and+alternative+normalization+methods+reveal+enriched+metabolites+and+strategies+to+study+prostate+cancer-related+changes.">Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes.</a> Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).</li><li>Peltoniemi, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+enrichment+does+not+warrant+a+higher+graft+survival+in+lipofilling+of+the+breast:+A+prospective+comparative+study.">Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study.</a> Journal of Plastic, Reconstructive &amp; Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).</li><li>Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltom&#228;ki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE-1+hypomethylation+in+familial+and+sporadic+cancer.">LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer.</a> Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).</li><li>. L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2) Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269</a> (2000)</li><li>Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland Available from: <a target="_blank" href="https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes">https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes</a> (2018)</li><li>. Takara Bio Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview">https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview</a> (2018)</li><li>Pisanic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+interspersed+nuclear+element+1+retrotransposons+become+deregulated+during+the+development+of+ovarian+cancer+precursor+lesions.">Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions.</a> The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).</li></ol>

Это исследование иллюстрирует, как MSPA может быть использован для обнаружения и количественного состояния метилирования конкретного генетического элемента. LINE-1 был в центре внимания здесь, но зонды могут быть разработаны для целевой диапазон генов и последовательностей. Кроме того, с?...

Метилирование ДНК является одной из основных эпигенетических изменений, происходящих в клетках человека. Метилирование ДНК относится к связи метиловых групп с остатками цитозина в динуклеотидах CpG. Такие динуклеотиды обычно встречаются в кластерах (острова CpG) в 5' области генов1. В нормальных клетках большинство этих динуклеотидов существуют в неметилируемом состоянии, что позволяет транскрипцию ДНК. Кстати, многие виды рака связаны с гиперметилированными островами CpG и транскриптомическим глушителем2, особенно в генах супрессоров опухолей, которые, в свою очередь, способствуют различным признакам рака3.
С другой стороны, длинные перемежаются ядерные элементы-1 (LINE-1s или L1s) являются повторяющимися, транспозируемыми элементами ДНК, которые обычно имеют высокий уровень метилирования на островах CpG. Метилирование LINE-1 предотвращает транслокацию и помогает поддерживать целостность генома. В нескольких типах рака, LINE-1 гипометилируется, что приводит к активации и последующей ретротранспозиции опосредованной хромосомной нестабильности4. На ЛИНИю-1 приходится почти 17% генома человека5,а его метилирование может служить индикатором глобального уровня геномной метилирования6. Глобальная гипметилирование LINE-1 считается предшествуя переходу клеток к фенотипу опухоли7; поэтому, он имеет перспективу в качестве потенциального маркера для раннего начала рака.
В настоящее время существует несколько методов анализа метилирования, в том числе пиросекенекирование, метилирование конкретных ПЦР, microarrays, и хроматин иммунопрециптом1. Использование секвенирования следующего поколения также позволило включить подходы к выявлению метилирования ДНК в масштабах всего генома. Многие из этих методов опираются на бисульфит-обработанную ДНК, в которой неметилированные цитозины преобразуются в урацил, а метилированные цитозины остаются неизменными. Тем не менее, работа с бисульфит-обработанной ДНК имеет несколько подводных камней, таких как неполные преобразования неметилированных цитозинов в uracil, предвзятое усиление последовательностей, и секвенирование ошибок8.
В метилациляции конкретных усилитель зондов (MSPA), зонды, состоящие из двух олигонуклеотидов целевой ДНК последовательностей, содержащих место ограничения (GCGC) для метилирования чувствительных ограничения фермента HhaI9. После того, как зонды гибридизируются с ДНК, каждый образец делится на два набора. Зонды в первом комплекте проходят перевязку, в то время как зонды во втором наборе проходят перевязку, а затем HhaI-опосредованного пищеварения на неметилированных участках CGCG. Оба набора образцов затем усиливаются ПЦР, и продукты разделены капиллярным электрофорасом. Зонды на неметилированных участках перевариваются HhaI и не усиливаются во время ПЦР, в результате чего нет пиковых сигналов. В отличие от этого, зонды на метилированных участках защищены от пищеварения и поэтому усиливаются во время ПЦР, впоследствии генерируя пиковые сигналы10.
MSPA имеет ряд преимуществ перед альтернативными методами. Во-первых, он требует низкого количества ДНК (50-100 нг) и хорошо подходит для анализа ДНК из формированного фиксированного парафина встроенных образцов10. Он не требует бисульфит-обработанной ДНК; на самом деле, это не подходит для ДНК, которая модифицируется таким образом. Многие образцы могут быть проанализированы в то же время, и MSPA зонды могут быть разработаны таким образом, что они нацелены на несколько генов или последовательностей одновременно. Кроме того, зонды являются специфическими и чувствительными для метилированных ДНК, как HhaI ограничение сайт соответствует последовательности, которая характерна для островов CpG10.
Это исследование исследовало влияние остеосаркомы (ОС) полученных внеклеточных пузырьков (EVs) на LINE-1 метилирования в жировой ткани полученных мезенхимальных стволовых клеток (AT-MSCs; Рисунок 1). EVs являются наноразмерными, мембранными пузырьками, выделяемыми большинством типов клеток. Они несут белки, липиды, мРНК, микроРНК, и дополнительные молекулы из родительских клеток11,12. EVs посредничает межклеточной связи и играют важную роль в нескольких патофизиологических условиях13,14. Недавнее исследование показало, что полученные раком EVs могут передавать активную ЛИНИЮ-1 клеткам-реципиентам15. Ранее сообщалось, что ЭВ из клеточной линии HOS-143B могут изменить метилирование статусLINE-1 в МСК, в дополнение к другим генетическим эффектам16.
При выращивании клеток для изоляции EV, важно использовать EV-обеденной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) в среде роста, так как FBS полученных EVs может мешать EVs из других источников и препятствовать результатам17,18. Ультрацентрифугация является одним из наиболее распространенных методов для истощения EVs от FBS. Это относительно простая и экономичная процедура по сравнению с альтернативами, такими как ультрафильтрация и коммерческий EV-обеденный FBS19. Здесь протокол также демонстрирует, как подготовить EV-исчерпаны FBS ультрацентрифугации.
В этой статье представлен подробный протокол для вышеупомянутых методов, от изоляции ЭВ от линии ячейки ОС до анализа метилирования LINE-1 в ОС-EV обработанных MSCs (Рисунок 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+01T1</td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>MSC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3730XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BlueStar Prestained Protein Marker</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>MWP03</td>
			<td>WB: protein marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin (clone C5C9)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2679</td>
			<td>WB, dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 (clone H5C6)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556019</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5703000010</td>
			<td>For conditioned media and cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810000010</td>
			<td>For spinning down 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>331374</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 + GlutaMAX medium</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>For AT-MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneScan 500 LIZ size standard</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4322682</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WGA2-10RXN</td>
			<td>for MSPA negative control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Di formamide</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4311320</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOS-143B cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-8303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp70 (clone 5G10)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554243</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-mouse</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32210</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-rabbit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LINE-1 probe-mix primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Sequences in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4306737</td>
			<td>also requires sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td>measure protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniProtean TGX 10% gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1034</td>
			<td>WB: gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM14C</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>WB: protein transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue XS</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740901.50</td>
			<td>for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>WB: blocking, antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Antibiotics for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tube, 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431064</td>
			<td>For storing Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-11015</td>
			<td>WB: total protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RKO cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2577</td>
			<td>for MSPA positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 + GlutaMAX</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>61870-010</td>
			<td>For HOS-143B cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA HhaI enzyme</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>SMR50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA reagent kit</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>EK1-FAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA P300 probe-mix</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>P300-100R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging rotor SW-28</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342207</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>FPE-204-030</td>
			<td>sterile filtering FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai 12</td>
			<td>FEI Company</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Gatan Orius SC 
			1000B CCD-camera 
			(Gatan Inc., USA); for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS, 1X tablets</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-7500-100</td>
			<td>WB: buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>WB: transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TCA0096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>for trypsinization of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 (clone 4A10)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB2702167</td>
			<td>WB, dilution 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles

Метилирование-специфическое усиление зонда (MSPA) является простой и надежной техникой, которая может быть использована для обнаружения относительных различий в уровнях метилирования образцов ДНК. Это находчивый, требует небольшого количества ДНК, и занимает около 4-5 ч практической работы. В представленной технике образцы ДНК сначала денатурируются, а затем гибридизируются с зондами, нацеленными на ДНК либо на метилированные, либо на эталонные участки в качестве контроля. Гибридизированная ДНК разделена на параллельные реакции, одна из них проходит только перевязку, а другая проходит перевязку, а затем HhaI-опосредованного пищеварения в неметилированных последовательностях GCGC. Полученные фрагменты ДНК усиливаются ПЦР и разделены капиллярным электрофорезом. Метилированные участки GCGC не усваиваются HhaI и производят пиковые сигналы, в то время как неметилированные участки GCGC усваиваются и пиковые сигналы не генерируются. Сравнение контрольно-нормализованных пиков переваренных и непереваренных версий каждого образца обеспечивает соотношение дозировки метилирования образца ДНК. Здесь MSPA используется для обнаружения влияния внеклеточных пузырьков, полученных от остеосаркомы (ЭВ) на метилирование долго перемежаемого ядерного элемента-1 (LINE-1) в мезенхимальных стволовых клетках. LINE-1s являются повторяющимися элементами ДНК, которые обычно подвергаются гипометилиации при раке и, в этом качестве, может служить в качестве биомаркера. Ультрацентррифегоция также используется в качестве экономически эффективного метода для отделения внеклеточных пузырьков от биологических жидкостей (т.е. при подготовке сыворотки крупного рогатого скота, истощенной евреем, и изоляции ЭВ от остеосаркомы кондиционированных средств массовой информации (дифференцированной центрифугации). Для анализа метилирования, пользовательские зонды LINE-1 предназначены для целевых трех метиловых сайтов в последовательности промоторов LINE-1 и семи контрольных участков. Этот протокол демонстрирует использование MSPA для анализа метилирования LINE-1 и описывает подготовку EV-исчерпаны FBS ультрацентррифегации.

Основной целью данного исследования была оценка эпигенетического воздействия ОС-ЭВ на MSCs. OS-EVs были выделены из клеток HOS-143B с использованием стандартного метода центрифугации дифференциального дифференциала. Выражение типичных маркеров EV CD63, Hsp70 и TSG101 западным и западным блоттингом п?...

Watch this Scientific Journal Video about LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles at JoVE.com

LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

Описано здесь использование метилирования конкретных зонд амплификации метод для анализа уровней метилирования элементов LINE-1 в мезенхимальных стволовых клеток, обработанных остеосаркомы полученных внеклеточных пузырьков. Ультрацентррифугация, популярная процедура отделения внеклеточных пузырьков от сыворотки крупного рогатого скота плода, также продемонстрирована.

LINE-1 Метилирование Анализ в мезенхимальных стволовых клеток, обработанных остеосаркомы производные внеклеточные vesicles

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of ...

Метилирование ДНК является одним из наиболее изученных эпигенетических подписей. Многие виды рака характеризуются изменениями в уровнях метилирования ДНК, которые связаны с аномальным экспрессией генов и другими геномными аномалиями. Длинные перемежаются ядерные элементы повторяющиеся транспонируемые геномные последовательности, которые обычно имеют высокий уровень метилирования.Однако они часто становятся гиперметилированными при раке, что приводит к их активации и приводит к хромосомной нестабильности. В этом исследовании, мы лечили мезенхимальных стволовых клеток с остеосаркомы полученных внеклеточных пузырьков, чтобы увидеть, является ли рак EVs может повлиять на LINE-1 метилирования в MECs. Фетальная сыворотка крупного рогатого скота, которая является неотъемлемым компонентом средств массовой информации культуры клеток млекопитающих, содержит большое количество эв, полученных из крупного рогатого скота.Эти Evs будет вмешиваться в анализ Evs из клеток, представляющих наш интерес, поэтому, при выращивании клеток для изоляции EV, важно использовать EV-исчерпаны FBS. Возьмите FBS в ультрацентрифуг трубки и поместите их в ультрацентрифуг ведра. Сбалансировать ведра в пределах 10 миллиграммов друг от друга до загрузки их на размахивая ротором.Поместите ротор в ультрацентрифуг и запустите при 100 000 Г в течение 19 часов при четырех градусах Цельсия. После пробежки тщательно соберите светлый верхний слой супернатанта и перенесите его в 50-миллилитровую трубку. Не беспокоить или трубчатые темно-коричневые гранулы, как он содержит EVs от FBS.Перейдите супернатант через фильтр 0,22 микрона в новую 50-миллилитровую трубку. Этот фильтр-стерилизованный, EV-обедненный FBS теперь можно добавить к средствам культуры клетки когда растущие клетки для изоляции EV. Сбор условных средств массовой информации из остеосаркомы клеток, выращенных в EV-истощенных средств массовой информации.Чтобы удалить клетки и клеточный мусор, центрифуга условных средств массовой информации на 2500 G в течение 20 минут при четырех градусах по Цельсию. Перенесите супернатант в ультрацентрифуговые трубки и сбалансируете их, как и раньше. Центрифуга труб при 100 000 Г в течение двух часов при четырех градусах Цельсия.Тщательно отбросьте супернатант, оставив около одного миллилитра внизу. Добавить около 20 миллилитров PBS в трубку и трубчатые мягко для того, чтобы вымыть и повторно приостановить EV гранулы. Сбалансировать трубки и провести еще один раунд ультрацентрифугации с теми же настройками.Аккуратно удалите супернатант и повторно приостановите гранулы EV в 200 микролитров PBS нежным пипетки. Храните EVs в низкосвязных трубках. Очищенные EVs характеризуются западным blotting, анализом отслеживания наночастиц, и микроскопией электрона передачи.Плита 15 000 MSCs на колодец в 24 хорошо пластины. Через 24 часа удалите старые средства массовой информации, вымойте клетки с помощью PBS и перевестите на EV-обедненные средства массовой информации. Лечить ячейки с OS-EVs в запланированные точки времени.После остановки лечения EV, извлечь ДНК из клеток с помощью соответствующего метода. Для анализа метилирования мы использовали индивидуальный метод усиления метилирования. Дизайн индивидуальных зондов LINE-1, как это было сделано ранее, Pavicic и другие.Для метилирования зондов выберите три последовательности, содержащие место ограничения HhaI в регионе промоутера. Для контрольных зондов выберите семь последовательностей, не имеющих места ограничения HhaI, из остальной части последовательности LINE-1. Разбавить 70 нанограммов образца ДНК в буфере TE до пяти микролитров.Нагрейте образцы в течение 10 минут при температуре 98 градусов по Цельсию, затем охладим до 25 градусов по Цельсию. Добавьте три микролитров смеси гибридизации зонда к каждому образцу и запустите термоциклер, чтобы позволить зондам гибридизироваться с ДНК. При комнатной температуре добавьте в каждый образец 30 микролитров постмиоциализации.Перенесите 10 микролитров на вторую трубку. Поместите оба набора трубок в термоциклер и инкубировать при 48 градусах по Цельсию, по крайней мере одну минуту. В то время как образцы находятся на 48 градусов по Цельсию, добавить 10 микролитров перевязки смеси в первый набор труб и 10 микролитров перевязки пищеварения смесь для второго набора труб.Запустите следующую программу термоцильцера. Затем скручиваем трубы и одновременно устанавливаем термоциклер до 72 градусов по Цельсию. Добавьте пять микролитров смеси полимеразы в каждую трубку и поместите трубки в термоциклер.Запустите программу PCR. Пока работает программа PCR, подготовь решение из одного миллилитрового формамида, содержащего 2,5 микролитров стандартного размера. Pipet 10 микролитров этого раствора для каждого ряда оптической пластины 96 хорошо.После ПЦР разбавляют непереваренные и переваренные образцы до одной-одной сотни и от одной до двухсот, соответственно, в ультра чистой воде. Добавьте два микролитров разбавленного ПЦР-продукта к пластине 96 хорошо. Центрифуга пластины на 200 G в течение 15 до 20 секунд, чтобы удалить пузырьки воздуха.Проведение фрагментарного анализа образцов капиллярным электрофорезом. Открытие капиллярного электрофореза приводит к программному обеспечению для анализа электроферограммы. Выберите образец и установите панель на MLPA из меню.Нажмите на панель и нажмите управление D, чтобы применить этот параметр ко всем образцам. Аналогичным образом установите метод анализа на микроспутник по умолчанию для всех образцов. Выберите все образцы и нажмите на зеленую кнопку воспроизведения для запуска анализа, затем выберите все образцы и нажмите на кнопку графика, чтобы визуализировать пики зонда.Увеличьте масштаб пиковой области для более высокого разрешения отдельных пиков. Убедитесь, что все 10 пиков, соответствующих зондам из смеси зонда LINE-1, помечены. Во вкладке генотипов экспортировать результаты в формате CSV.Откройте файл CSV в программном обеспечении для анализа данных и сортируете данные в столбцы. Наклеить этикетку на три пика метилирования в зависимости от их размеров. Остальные семь пиков соответствуют контрольных зондам.Здесь мы используем пики зонда LINE-1 2M размером примерно 117 базовых пар. Для каждого образца вычислите область пиковой суммы всех семи контрольных пиков. Разделите пиковую площадь каждого зонда LINE-1 на эту сумму.Для каждого образца разделите значение переваренного образца на непереваренный образец для получения соотношения дозы метилирования. Западный анализ blotting подтвердил наличие OS-EVs с сигналами, наблюдаемыми для TSG101, HSP70 и CD63. Отсутствие сигнала кальнексина указывает на чистоту образца EV.Дополнительное указание на чистоту наблюдалось с TEM с нетронутыми пузырьками различных размеров, присутствующими в образце OS-EV. Концентрация и распределение размеров частиц OS-EV измерялись NTA. 80% EV были в диапазоне размеров от 50 до 200 нанометров.Здесь мы можем увидеть коэффициенты дозы метилирования LINE-1 от MSCs в разное время точки лечения EV. Серая линия представляет базовый уровень метилирования от нулевой точки времени. В третий момент, есть снижение среднего коэффициента дозы метилирования после введения EVs, тем самым указывая на гиперметилирование.Этот гиперметилирующий эффект EVs менее выражен в точке времени семь. Здесь мы показали простой, очень чувствительный и надежный метод метилирования анализа. Это требует низкого количества ДНК без бисульфита преобразования участие, а также подходит для ДНК изолированы от парафина встроенных образцов.Весь метод, с экспериментальными и аналитическими частями, занимает около двух дней. Из-за большого количества копий LINE-1 в геноме, базовое метилирование LINE-1 является высоким в нормальных образцах. Таким образом, различия в уровнях метилирования образцов, как наблюдается с помощью этого метода, могут быть тонкими.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Использование Индуцированные анализа соматической сектора (ISSA) для изучения генов и промоутеров, участвующих в формировании древесины и вторичного развития Stem

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Инженерной искусственных факторов в частности Манипулирование альтернативного сплайсинга в клетках человека

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Анализ Cap-связывающих белков в человеческих клетках, подвергнутых Физиологические кислорода Условия

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

Комплексный анализ метилирования ДНК с использованием метода Methyl-CpG-связывающего домена для захвата у пациентов с хронической лимфоцитарной лейкемией

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Иммуноокрашивания для модификации ДНК: Вычислительный анализ конфокальный изображений

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Высокоэффективные гена срыв мышиных и человека гемопоэтических предшественников клеток ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Расширение редактирования с Cas9 рибонуклеопротеида в различных клеток и организмов геном

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Методология для точного обнаружения метилирования митохондриальной ДНК

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Эндогенного белка, пометки в человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием ТРИФОСФАТЫ/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Определение события гомологичная рекомбинация в мышиных эмбриональных стволовых клеток с использованием южный Blotting и цепной реакции полимеразы

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...