Name: line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles
Uploaded: 2020-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles at JoVE.com

Detta arbete finansierades av Helsingfors universitet projektfinansiering (WBS490302, WBS73714112) Helsingfors universitetssjukhus Statlig finansiering för universitetsforskning på universitetsnivå (Y1014SUL05, TYH2016130), Finsk-norska medicinska stiftelsen, och Selma och Maja-Lisa Selander-fonden (Minervastiftelsen). Vi tackar Walter Pavicic för att ha lämnat det ändrade MSPA-protokollet och för relaterad teknisk support. Vi är tacksamma mot Teemu Masalin (Helsingfors universitet) för att hjälpa oss med videoproduktion.

Studien godkändes av Helsingfors och Nylands universitets etikkommitté (etiskt godkännande D. nr 217/13/03/02/2015).
1. Beredning av EV-utarmat FBS genom ultracentrifugering
<ol><li>Ta FBS i (ultra)centrifugrör och placera dem i ultracentrifughinkar. För att säkerställa att ultracentrifugeringen går smidigt och säkert, balansera skoporna inom 10 mg från varandra.</li>
	<li>Ladda skoporna på en svängande rotor (typ SW28, k-faktor 246). Placera rotorn i ultracentrifugen och kör p?...

<ol>
	<li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenomics:+DNA+methylomes+and+histone-modification+maps.">Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).</li><li>Herman, J. G., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+cancer+in+association+with+promoter+hypermethylation.">Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation.</a> New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+Cancer:+The+Next+Generation.">Hallmarks of Cancer: The Next Generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+transposition+of+endogenous+retroviral+elements+in+hypomethylation+induced+tumors+in+mice.">Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice.</a> Oncogene. 27, 404-408 (2008).</li><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome.">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409, 860-921 (2001).</li><li>Rodriguez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+instability+correlates+with+genome-wide+DNA+demethylation+in+human+primary+colorectal+cancers.">Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers.</a> Cancer Research. 66, 8462 (2006).</li><li>Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetic+progenitor+origin+of+human+cancer.">The epigenetic progenitor origin of human cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).</li><li>Bock, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiQ+Analyzer:+visualization+and+quality+control+for+DNA+methylation+data+from+bisulfite+sequencing.">BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing.</a> Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).</li><li>Schouten, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+quantification+of+40+nucleic+acid+sequences+by+multiplex+ligation-dependent+probe+amplification.">Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification.</a> Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).</li><li>Nygren, A. O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation-Specific+MLPA+(MS-MLPA):+simultaneous+detection+of+CpG+methylation+and+copy+number+changes+of+up+to+40+sequences.">Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences.</a> Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).</li><li>El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).</li><li>Vallabhaneni, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+bone+marrow+mesenchymal+stem/stromal+cells+transport+tumor+regulatory+microRNA,+proteins,+and+metabolites.">Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites.</a> Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).</li><li>Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-+derived+microvesicles:+important+and+underappreciated+mediators+of+cell-to-cell+communication.">Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication.</a> Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).</li><li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+as+mediators+of+intercellular+communication+in+cancer-+the+emerging+science+of+cellular+"debris".">Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris".</a> Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).</li><li>Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+mediate+the+horizontal+transfer+of+an+active+LINE-1+retrotransposon.">Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).</li><li>Mannerstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+alterations+in+mesenchymal+stem+cells+by+osteosarcoma-derived+extracellular+vesicles.">Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles.</a> Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).</li><li>Shelke, G. V., L&#228;sser, C., Gho, Y. S., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+exosome+depletion+protocols+to+eliminate+functional+and+RNA-containing+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).</li><li>Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+bovine+serum+RNA+interferes+with+the+cell+culture+derived+extracellular+RNA.">Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA.</a> Scientific Reports. 6, 31175 (2016).</li><li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).</li><li>Puhka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+profiling+of+extracellular+vesicles+and+alternative+normalization+methods+reveal+enriched+metabolites+and+strategies+to+study+prostate+cancer-related+changes.">Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes.</a> Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).</li><li>Peltoniemi, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+enrichment+does+not+warrant+a+higher+graft+survival+in+lipofilling+of+the+breast:+A+prospective+comparative+study.">Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study.</a> Journal of Plastic, Reconstructive &amp; Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).</li><li>Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltom&#228;ki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE-1+hypomethylation+in+familial+and+sporadic+cancer.">LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer.</a> Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).</li><li>. L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2) Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269</a> (2000)</li><li>Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland Available from: <a target="_blank" href="https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes">https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes</a> (2018)</li><li>. Takara Bio Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview">https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview</a> (2018)</li><li>Pisanic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+interspersed+nuclear+element+1+retrotransposons+become+deregulated+during+the+development+of+ovarian+cancer+precursor+lesions.">Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions.</a> The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).</li></ol>

Denna studie visar hur MSPA kan användas för att upptäcka och kvantifiera metyleringstatus en specifik genetisk faktor. LINE-1 var fokus här, men sonderna kan utformas för att rikta en rad gener och sekvenser. Dessutom finns det en växande lista över sondblandningar tillgängliga för olika applikationer. MSPA är en enkel och robust teknik för DNA-metyleringanalys som inte kräver bisulfitkonvertering10. Den fullständiga proceduren från provförberedelse till dataanalys tar cirka 2 daga...

DNA-metylering är en viktig epigenetisk modifiering som förekommer i mänskliga celler. DNA-metylering avser kopplingen mellan metylgrupper till cytosinrester i CpG-dinukleotids. Sådana dinucleotides finns vanligtvis i kluster (CpG öar) i 5 region av gener1. I normala celler finns de flesta av dessa dinukleotider i ett ometylat tillstånd, vilket möjliggör DNA-transkription. Förresten, många cancerformer är associerade med hypermetylerade CpG öar och transkriptomiska ljuddämpning2, särskilt i tumör suppressor gener, vilket i sin tur bidrar till olika kännetecken för cancer3.
Å andra sidan är långa interspersed nukleära element-1 (LINE-1s eller L1s) repetitiva, transposable DNA-element som normalt har höga halter av metylering på CpG öar. Metylering av LINE-1 förhindrar flyttning och hjälper till att upprätthålla genomintegritet. I flera typer av cancer är LINE-1 hypometylerad, vilket resulterar i aktivering och efterföljande retroinförlivande-medierad kromosomal instabilitet4. LINE-1 står för nästan 17% av det mänskligagenomet 5, och dess metylering status kan fungera som en indikator på globala genomiska metylering nivåer6. Global LINE-1 hypomethylation anses föregå övergången av celler till en tumör fenotyp7; Därför håller det löfte som en potentiell markör för tidig cancer debut.
För närvarande finns det flera metoder för metylering analys, inklusive pyrosequencing, metylering-specifika PCR, mikroarrayer, och kromatin immunoprecipitation1. Användningen av nästa generations sekvensering har också gjort det möjligt att införliva genomomfattande metoder för påvisande av DNA-metylering. Många av dessa metoder är beroende av bisulfit-behandlade DNA, där ometylerade cytosiner omvandlas till uracil och metylerade cytosiner förblir oförändrade. Arbeta med bisulfit-behandlat DNA har dock flera fallgropar, såsom ofullständiga omvandlingar av ometylerade cytosiner till uracil, partisk förstärkning av sekvenser och sekvensering fel8.
I metylering-specifik sondamplifiering (MSPA), sonder som består av två oligonukleotider mål DNA-sekvenser som innehåller en begränsning siten (GCGC) för metylering-känsliga begränsningsenzym HhaI9. Efter sonderna hybridisera till DNA, varje prov är uppdelad i två uppsättningar. Sonder i den första uppsättningen genomgår ligering, medan sonder i den andra uppsättningen genomgår ligering följt av HhaI-medierad matsmältning vid ometylerade CGCG platser. Båda uppsättningarna av prover förstärks sedan av PCR, och produkterna separeras med kapillärelektrofores. Sonder på ometylerade platser smälts av HhaI och förstärks inte under PCR, vilket resulterar i några toppsignaler. Däremot är sonder på metylerade platser skyddade mot matsmältningoch förstärks därför under PCR, därefter genererar toppsignaler10.
MSPA har flera fördelar jämfört med alternativa metoder. För det första kräver det en låg mängd DNA (50–100 ng) och är väl lämpad för analys av DNA från formalinfixat paraffininbäddade prover10. Det kräver inte bisulfit-behandlat DNA; I själva verket är det olämpligt för DNA som ändras på detta sätt. Många prover kan analyseras samtidigt, och MSPA-sonder kan utformas så att de riktar sig till flera gener eller sekvenser samtidigt. Dessutom är sonderna specifika och känsliga för metylerad DNA eftersom HhaI-begränsningsplatsen motsvarar en sekvens som är typisk för CpG-öarna10.
Denna studie undersökte effekterna av osteosarkom (OS)-härledda extracellulära blåsor (EVs) på LINE-1 metylering i fettvävnad-härledda mesenkymala stamceller (AT-MSCs; figur 1). EVs är nanoskala, membran-bundna blåsor utsöndras av de flesta celltyper. De bär proteiner, lipider, mRNA, microRNA och ytterligare molekyler från moderceller11,12. EVs förmedlar intercellulär kommunikation och spelar viktiga roller i flera patofysiologiska förhållanden13,14. En färsk studie visade att cancer-härledda EVs kan överföra aktiv LINE-1 till mottagare celler15. Det har tidigare rapporterats att EVs från HOS-143B cellinjen kan ändra metylering status LINE-1 i MSCs, utöver andra genetiska effekter16.
När celler odlas för EV isolering, är det viktigt att använda EV-utarmat fetalt nötkreatur serum [FBS] i tillväxtmediet, eftersom FBS-härledda EVs kan störa EVs från andra källor och hämma resultaten17,18. Ultracentrifugering är en av de vanligaste metoderna för utarmning av EVs från FBS. Det är ett relativt enkelt och kostnadseffektivt förfarande jämfört med alternativ som ultrafiltrering och kommersiella EV-utarmat FBS19. Här visar protokollet också hur man förbereder EV-utarmat FBS genom ultracentrifugering.
Denna artikel presenterar ett detaljerat protokoll för ovannämnda tekniker, från isolering av EVs från en OS-cellinje till metylering analys av LINE-1 i OS-EV behandlade MSCs(figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+01T1</td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>MSC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3730XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BlueStar Prestained Protein Marker</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>MWP03</td>
			<td>WB: protein marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin (clone C5C9)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2679</td>
			<td>WB, dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 (clone H5C6)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556019</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5703000010</td>
			<td>For conditioned media and cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810000010</td>
			<td>For spinning down 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>331374</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 + GlutaMAX medium</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>For AT-MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneScan 500 LIZ size standard</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4322682</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WGA2-10RXN</td>
			<td>for MSPA negative control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Di formamide</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4311320</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOS-143B cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-8303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp70 (clone 5G10)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554243</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-mouse</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32210</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-rabbit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LINE-1 probe-mix primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Sequences in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4306737</td>
			<td>also requires sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td>measure protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniProtean TGX 10% gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1034</td>
			<td>WB: gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM14C</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>WB: protein transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue XS</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740901.50</td>
			<td>for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>WB: blocking, antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Antibiotics for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tube, 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431064</td>
			<td>For storing Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-11015</td>
			<td>WB: total protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RKO cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2577</td>
			<td>for MSPA positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 + GlutaMAX</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>61870-010</td>
			<td>For HOS-143B cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA HhaI enzyme</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>SMR50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA reagent kit</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>EK1-FAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA P300 probe-mix</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>P300-100R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging rotor SW-28</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342207</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>FPE-204-030</td>
			<td>sterile filtering FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai 12</td>
			<td>FEI Company</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Gatan Orius SC 
			1000B CCD-camera 
			(Gatan Inc., USA); for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS, 1X tablets</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-7500-100</td>
			<td>WB: buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>WB: transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TCA0096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>for trypsinization of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 (clone 4A10)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB2702167</td>
			<td>WB, dilution 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles

Metylering-specifik sond förstärkning (MSPA) är en enkel och robust teknik som kan användas för att upptäcka relativa skillnader i metylering nivåer av DNA-prover. Det är påhittig, kräver små mängder DNA, och tar cirka 4-5 h praktiskt arbete. I den presenterade tekniken, DNA-prover först denatureras sedan hybridiseras till sonder som riktar DNA på antingen metylerade eller referensplatser som en kontroll. Hybridiserat DNA är uppdelad i parallella reaktioner, en genomgår endast ligering och den andra genomgår ligering följt av HhaI-medierad matsmältning vid ometylerade GCGC-sekvenser. De resulterande DNA-fragmentförstärks av PCR och separeras genom kapillärelektrofores. Metylerade GCGC platser inte smältav HhaI och producera toppsignaler, medan ometylerade GCGC platser smälts och inga toppsignaler genereras. Jämföra kontroll-normaliserade toppar av smälta och osmälta versioner av varje prov ger metylering doseringförhållandet av ett DNA-prov. Här används MSPA för att upptäcka effekterna av osteosarkom-härledda extracellulära blåsor (EVs) på metylering status långa interspersed nukleära element-1 (LINE-1) i mesenkymala stamceller. LINE-1s är repetitiva DNA-faktorer som vanligtvis genomgår hypometylering i cancer och, i denna egenskap, kan fungera som en biomarkör. Ultracentrifugation används också som en kostnadseffektiv metod för att separera extracellulära blåsor från biologiska vätskor (dvs. vid beredning av EV-utarmat fetalt nötkreaturserum [FBS] och isolerae nde organ från osteosarkom konditionerade medier [differentiell centrifugering]). För metyleringanalys är anpassade LINE-1-sonder utformade för att rikta in sig på tre metylationsplatser i LINE-1-promotorn och sju kontrollplatser. Detta protokoll visar användningen av MSPA för LINE-1 metylering analys och beskriver beredningen av EV-utarmat FBS genom ultracentrifugering.

Huvudsyftet med denna studie var att utvärdera de epigenetiska effekterna av OS-EVs på MSCs. OS-EVs isolerades från HOS-143B celler med hjälp av standard differentialcentrifugering metod. Uttryck för de typiska EV markörer CD63, Hsp70 och TSG101 av västra blotting bekräftade förekomsten av OS-EVs. (figur2A). Avsaknad av calnexin signal anges renhet OS-EV isolat. Ytterligare renhet observerades med TEM, med intakta blåsor av olika storlekar som förekommer<strong cl...

Watch this Scientific Journal Video about LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles at JoVE.com

LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

Beskrivs här är användningen av en metylering-specifik sond amplifiering metod för att analysera metylering nivåer av LINE-1 element i mesenkymala stamceller behandlas med osteosarkom-härledda extracellulära blåsor. Ultracentrifugering, ett populärt förfarande för att separera extracellulära blåsor från fetala bovin serum, visas också.

LINE-1 Mesenkymala stamceller behandlade med osteosarkom-härledda extracellulära blåsor

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of ...

DNA-metylering är en av de mest studerade epigenetiska signaturerna. Många cancerformer kännetecknas av förändringar i DNA-metyleringsnivåer, som är förknippade med avvikande genuttryck och andra genomiska avvikelser. Långa varvata kärnelement är repetitiva transponerbara genomiska sekvenser som normalt har höga nivåer av metylering.De blir dock ofta hypermetylerade i cancer, vilket resulterar i deras aktivering och leder till kromosomal instabilitet. I denna studie behandlade vi mesenkymala stamceller med osteosarkom-härledda extracellulära vesiklar för att se om cancer EVs kan påverka LINE-1 metylering i MECs. Fetalt nötkreatur serum, som är en integrerad del av däggdjur cellodling media, innehåller ett stort antal nötkreatur-härledda EVs.Dessa Evs kommer att störa analys av Evs från celler av vårt intresse, därför, när växande celler för EV isolering, är det viktigt att använda EV-utarmat FBS. Ta FBS i ultracentrifugrör och placera dem i ultracentrifug hinkar. Balansera hinkarna till inom 10 milligram från varandra innan du laddar dem på en svängande rotor.Placera rotorn i ultracentrifugen och kör på 100, 000 G i 19 timmar vid fyra grader Celsius. Efter körningen, samla noggrant det ljusa övre lagret av supernatanten och överföra det till ett 50 milliliterrör. Stör inte eller pipet den mörkbruna pelleten eftersom den innehåller EVs från FBS.För översup supernatanten genom ett 0,22 mikronfilter till ett nytt 50 milliliterrör. Detta filter-steriliserade, EV-utarmat FBS kan nu läggas till cellkultur media när växande celler för EV isolering. Samla in betingade medier från osteosarkomceller som odlas i EV-utarmat media.För att avlägsna celler och cellskräp, centrifugera det konditionerade mediet vid 2500 G i 20 minuter vid fyra grader Celsius. Överför supernatanten till ultracentrifugrör och balansera dem som tidigare. Centrifugera rören vid 100, 000 G i två timmar vid fyra grader Celsius.Kassera försiktigt supernatanten som lämnar runt en milliliter i botten. Tillsätt cirka 20 milliliter PBS till röret och pipet försiktigt för att tvätta och åter upphäva EV pelleten. Balansera rören och genomför ytterligare en omgång ultracentrifugering med samma inställningar.Ta försiktigt bort supernatanten och dra upp EV-pelleten på åter 200 mikroliter av PBS genom skonsam pipettering. Förvara EVs i lågbindande rör. Renade elbilar kännetecknas av western blotting, nanopartikel spårning analys, och överföring elektronmikroskopi.Platta 15, 000 MSCs per brunn i en 24 brunnsplatta. Efter 24 timmar, ta bort gamla medier, tvätta cellerna med PBS, och ändra till EV-utarmat media. Behandla celler med OS-EVs vid de schemalagda tidspunkterna.Efter avslutad EV-behandling, extrahera DNA från cellerna med en lämplig metod. För metylering analys, vi använde en skräddarsydd metylering-specifika sond förstärkning metod. Designa de skräddarsydda LINE-1-sonderna, som tidigare gjorts, av Pavicic och andra.För metyleringsproberna väljer du tre sekvenser som innehåller HhaI-begränsningsplatsen inom promotorregionen. För kontrollavsökningar väljer du sju sekvenser som saknar HhaI-begränsningsplatsen från resten av sekvensen FÖR LINJE-1. Späd 70 nanogram DNA-prov i TE-buffert till fem mikroliter.Värm proverna i 10 minuter vid 98 grader Celsius sedan svalna till 25 grader Celsius. Lägg till tre mikroliter av sond hybridisering mix till varje prov och kör termocyklaren så att sonderna att hybridisera till DNA. Vid rumstemperatur, tillsätt 30 mikroliter av post-hybridisering mix till varje prov.Överför 10 mikroliter till ett andra rör. Placera båda uppsättningarna av rör i termocyklaren och inkubera i 48 grader Celsius i minst en minut. Medan proverna är på 48 grader Celsius, tillsätt 10 mikroliter av ligatur mix till den första uppsättningen av rör och 10 mikroliter av ligation-matsmältning mix till den andra uppsättningen av rör.Kör nästa termocylcerprogram. Snurra sedan ner rören och ställ samtidigt in termocyklaren till 72 grader Celsius. Lägg till fem mikroliter av polymeras mix till varje rör och placera rören i termocyklaren.Kör PCR-programmet. Medan PCR-programmet körs, förbereda en lösning av en milliliter formamid som innehåller 2,5 mikroliter av storlek-standard. Pipet 10 mikroliter av denna lösning till varje rad av en optisk 96 väl platta.Efter PCR, späd de osmälta och de smälta proverna till ett till hundra och ett till två hundra, respektive i ultra rent vatten. Tillsätt två mikroliter av utspädd PCR-produkt till 96 brunnsplattan. Centrifugera plattan vid 200 G i 15 till 20 sekunder för att avlägsna luftbubblor.Genomför fragmentanalys av prover genom kapillärelektrofores. Öppna kapillärelektroforesresultaten i en elektroferogramanalysprogramvara. Välj ett prov och ställ in panelen på MLPA på menyn.Klicka på panelen och tryck på kontroll D för att tillämpa denna inställning på alla prover. På ett liknande sätt, ställ in analysmetoden till microsatellite standard för alla prover. Välj alla prover och klicka på den gröna play-knappen för att köra analys, välj sedan alla prover och klicka på grafknappen för att visualisera probetops.Zooma in toppregionen för en högre upplösning av de enskilda topparna. Se till att alla 10 toppar som motsvarar sonderna från PROBEBlanden LINE-1 är märkta. Exportera resultaten i CSV-formatet i genotyper-fliken .Öppna CSV-filen i en dataanalysprogramvara och sortera datan i kolumner. Märk de tre metyleringsplatstopparna baserat på deras storlekar. De återstående sju topparna motsvarar kontrollsonderna.Här använder vi LINE-1 2M sondtoppar som har en storlek på ungefär 117 baspar. För varje prov beräknar du summatoppens yta för alla sju kontrolltoppar. Dela upp toppområdet för varje LINE-1-sond med den här summan.För varje prov, dela upp värdet av det smälta provet med det osmälta provets värde för att erhålla kvoten för metylationsdosering. Western blotting analys bekräftade förekomsten av OS-EVs med signaler som observerats för TSG101, HSP70 och CD63. Avsaknad av calnexin signal anges att EV provet var ren.Ytterligare indikation på renhet observerades med TEM med intakta vesiklar av olika storlekar som finns i OS-EV-provet. OS-EV partikelkoncentration och storleksfördelning mättes av NTA. 80% av elbilarna var i storleksintervallet 50 till 200 nanometer.Här kan vi se metylation doseringsförhållanden av LINE-1 från MSCs vid olika tidpunkter i EV behandling. Den grå linjen representerar metyleringsnivån originalplan från tidspunkt noll. Vid tidpunkt tre, det finns en minskning av den genomsnittliga metylering dosering förhållandet efter administrering av EVs, därigenom indikerar hypermetrin.Denna hypermetylating effekt av EVs är mindre uttalad vid tidpunkt punkt sju. Här har vi visat en enkel, mycket känslig, och robust teknik för metyleringsanalys. Det kräver en låg mängd DNA utan bisulfit konvertering inblandade och det är också lämplig för DNA isolerade från paraffin-inbäddade prover.Hela metoden, med de experimentella och analytiska delarna, tar cirka två dagar. På grund av ett högt kopiertal av LINE-1 i genomet är baslinjemetylering av LINE-1 hög i normala prover. Därför kan skillnaderna i metyleringsnivåer av prover, som observerats med denna metod, vara subtila.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Användning av inducerad Somatic Sector Analysis (ISSA) för att studera gener och projektansvariga i trä Bildning och sekundär Stem utveckling

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Engineering Artificiella Faktorer att specifikt Manipulera alternativ splitsning i humana celler

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analys av Cap-bindande proteiner i mänskliga celler som utsätts för fysiologiska syreförhållanden

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

Omfattande DNA-metyleringsanalys med användning av en metyl-CpG-bindande domänfångningsbaserad metod i patienter med kronisk lymfocytisk leukemi

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunfärgning för DNA ändringar: tillämpad analys av Confocal bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Högeffektiva gen störningar av murina och mänskliga hematopoetiska stamceller av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Förbättrad genomet redigering med Cas9 ribonukleoprotein i olika celler och organismer

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metodik för korrekt upptäckt av mitokondrie-DNA metylering

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogen Protein taggning i mänskliga inducerade pluripotenta stamceller med CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifiering av homolog rekombination händelser i mus embryonala stamceller med södra Blotting och Polymerase Chain Reaction

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...