Name: line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles
Uploaded: 2020-02-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles at JoVE.com

Bu çalışma Helsinki Üniversitesi proje finansmanı (WBS490302, WBS73714112) Helsinki Üniversitesi Hastanesi Devlet üniversite düzeyinde sağlık araştırmaları için fon (Y1014SUL05, TYH2016130), Finlandiya-Norveç Tıp Vakfı ve Selma ve Maja-Lisa Selander Fonu (Minerva Vakfı). Walter Paviciç'e değiştirilmiş MSPA protokolünü sağladığı ve ilgili teknik destek için teşekkür ederiz. Teemu Masalin'e (Helsinki Üniversitesi) video prodüksiyonunda bize yardımcı olduğu için minnettarız.

Bu çalışma Helsinki ve Uusimaa Hastanesi Bölgesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (etik onay D. No. 13/03/02/2015).
1. EV-ultracentrifugation tarafından TÜKENMIŞ FBS hazırlanması
<ol><li>FBS'yi (ultra) santrifüj tüplerine alın ve ultra santrifüj kovalara yerleştirin. Ultracentrifugation sorunsuz ve güvenli bir şekilde çalıştığından emin olmak için, birbirinden 10 mg içinde kova denge.</li>
	<li>Kovaları sallanan bir rotora yükleyin (SW28 tipi, k-faktör 24...

<ol>
	<li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenomics:+DNA+methylomes+and+histone-modification+maps.">Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).</li><li>Herman, J. G., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+cancer+in+association+with+promoter+hypermethylation.">Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation.</a> New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+Cancer:+The+Next+Generation.">Hallmarks of Cancer: The Next Generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+transposition+of+endogenous+retroviral+elements+in+hypomethylation+induced+tumors+in+mice.">Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice.</a> Oncogene. 27, 404-408 (2008).</li><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome.">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409, 860-921 (2001).</li><li>Rodriguez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+instability+correlates+with+genome-wide+DNA+demethylation+in+human+primary+colorectal+cancers.">Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers.</a> Cancer Research. 66, 8462 (2006).</li><li>Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetic+progenitor+origin+of+human+cancer.">The epigenetic progenitor origin of human cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).</li><li>Bock, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiQ+Analyzer:+visualization+and+quality+control+for+DNA+methylation+data+from+bisulfite+sequencing.">BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing.</a> Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).</li><li>Schouten, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+quantification+of+40+nucleic+acid+sequences+by+multiplex+ligation-dependent+probe+amplification.">Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification.</a> Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).</li><li>Nygren, A. O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation-Specific+MLPA+(MS-MLPA):+simultaneous+detection+of+CpG+methylation+and+copy+number+changes+of+up+to+40+sequences.">Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences.</a> Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).</li><li>El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).</li><li>Vallabhaneni, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+bone+marrow+mesenchymal+stem/stromal+cells+transport+tumor+regulatory+microRNA,+proteins,+and+metabolites.">Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites.</a> Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).</li><li>Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-+derived+microvesicles:+important+and+underappreciated+mediators+of+cell-to-cell+communication.">Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication.</a> Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).</li><li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+as+mediators+of+intercellular+communication+in+cancer-+the+emerging+science+of+cellular+"debris".">Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris".</a> Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).</li><li>Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+mediate+the+horizontal+transfer+of+an+active+LINE-1+retrotransposon.">Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).</li><li>Mannerstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+alterations+in+mesenchymal+stem+cells+by+osteosarcoma-derived+extracellular+vesicles.">Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles.</a> Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).</li><li>Shelke, G. V., L&#228;sser, C., Gho, Y. S., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+exosome+depletion+protocols+to+eliminate+functional+and+RNA-containing+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).</li><li>Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+bovine+serum+RNA+interferes+with+the+cell+culture+derived+extracellular+RNA.">Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA.</a> Scientific Reports. 6, 31175 (2016).</li><li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).</li><li>Puhka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+profiling+of+extracellular+vesicles+and+alternative+normalization+methods+reveal+enriched+metabolites+and+strategies+to+study+prostate+cancer-related+changes.">Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes.</a> Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).</li><li>Peltoniemi, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+enrichment+does+not+warrant+a+higher+graft+survival+in+lipofilling+of+the+breast:+A+prospective+comparative+study.">Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study.</a> Journal of Plastic, Reconstructive &amp; Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).</li><li>Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltom&#228;ki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE-1+hypomethylation+in+familial+and+sporadic+cancer.">LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer.</a> Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).</li><li>. L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2) Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269</a> (2000)</li><li>Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland Available from: <a target="_blank" href="https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes">https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes</a> (2018)</li><li>. Takara Bio Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview">https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview</a> (2018)</li><li>Pisanic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+interspersed+nuclear+element+1+retrotransposons+become+deregulated+during+the+development+of+ovarian+cancer+precursor+lesions.">Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions.</a> The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).</li></ol>

Bu çalışma, MSPA'nın belirli bir genetik elementin metilasyon durumunu tespit etmek ve ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. LINE-1 burada odak noktası oldu, ama sondalar genler ve diziler bir dizi hedef için tasarlanmış olabilir. Ayrıca, farklı uygulamalar için kullanılabilir prob karışımları büyüyen bir liste vardır. MSPA, bisülfit dönüşüm gerektirmeyen DNA metilasyon analizi için basit ve sağlam bir tekniktir10. Örnek hazırlamadan veri analizin...

DNA metilasyon insan hücrelerinde meydana gelen önemli bir epigenetik modifikasyondur. DNA metilasyon CpG dinükleotidlerde sitozin kalıntıları metil gruplarının bağlantı anlamına gelir. Bu tür dinükleotidler genellikle kümelerde (CpG adaları) genlerin 5' bölgesinde bulunur1. Normal hücrelerde, bu dinükleotidlerin çoğu metillenmemiş bir durumda bulunur, bu da DNA transkripsiyonuna izin verir. Bu arada, birçok kanser hipermethylated CpG adaları ve transkripsiyon ile ilişkili2, özellikle tümör baskılayıcı genlerde, hangi sırayla kanser çeşitli işaretleri katkıda3.
Öte yandan, uzun serpiştirilmiş nükleer elementler-1 (LINE-1s veya L1s) normalde CpG adalarında yüksek metilasyon seviyelerine sahip tekrarlayan, transposable DNA elemanlarıdır. LINE-1'in metilasyonunu önler ve genom bütünlüğünün korunmasına yardımcı olur. Çeşitli kanser türlerinde LINE-1 hipometilatlanır, aktivasyon ve sonraki retrotranspozisyon aracılı kromozomal instabilite ile sonuçlanır4. LINE-1 insan genomunun yaklaşık% 17 için hesaplar5, ve metilasyon durumu küresel genomik metilasyon düzeyleri nin bir göstergesi olarak hizmet verebilir6. Global LINE-1 hipometilasyonunun hücrelerin tümör fenotip7'yegeçişinden önce olduğu kabul edilir; bu nedenle, erken kanser başlangıcı için potansiyel bir belirteç olarak umut tutar.
Şu anda, pyrosequencing, metilasyona özgü PCR, mikrodiziler ve kromatin immünopresipitasyon1dahil olmak üzere metilasyon analizi için çeşitli yöntemler vardır. Yeni nesil sıralamanın kullanımı, DNA metilasyonunun saptanması için genom çapında yaklaşımların dahil edilmesine de mümkün kılmıştır. Bu yöntemlerin çoğu, metillenmemiş sitozinlerin urasil'e dönüştürüldüğü ve metillenmiş sitozinlerin değişmediği bisülfit le tedavi edilmiş DNA'ya dayanır. Ancak, bisülfit le tedavi DNA ile çalışan urasil metillenmemiş sitozinlerin eksik dönüşümleri gibi çeşitli tuzaklar vardır, dizilerin önyargılı amplifikasyon, ve sıralama hataları8.
Metilasyona özgü prob amplifikasyonda (MSPA), iki oligonükleotidden oluşan problar metilasyona duyarlı restriksiyon enzimi HhaI9için bir restriksiyon alanı (GCGC) içeren DNA dizilerini hedef alır. Sondalar DNA ile melezleştikten sonra, her örnek iki kümeye ayrılır. İlk sette problar ligasyondan geçerken, ikinci sette problar ligasyondan geçerken, metillenmemiş CGCG bölgelerinde HhaI aracılı sindirim emdirilir. Her iki numune seti de PCR ile güçlenir ve ürünler kılcal elektroforez ile ayrılır. Metillenmemiş bölgelerdeki problar HhaI tarafından sindirilir ve PCR sırasında yükseltilmez, bu da tepe sinyalleri ne olmaz. Buna karşılık, metillenmiş bölgelerdeki problar sindirime karşı korunur ve bu nedenle PCR sırasında yükseltilir ve daha sonra tepe sinyalleri10üretir.
MSPA'nın alternatif yöntemlere göre birçok avantajı vardır. İlk olarak, düşük miktarda DNA gerektirir (50-100 ng) ve formalin-sabit parafin gömülü örneklerden DNA analizi için uygundur10. Bu bisülfit tedavi DNA gerektirmez; aslında, bu şekilde modifiye DNA için uygun değildir. Birçok örnek aynı anda analiz edilebilir ve MSPA sondaları aynı anda birden fazla geni veya diziyi hedeflenecek şekilde tasarlanabilir. Ayrıca, hhaI kısıtlama alanı CpG adaları10tipik bir dizi karşılık gelir gibi problar metillenmiş DNA için özel ve duyarlıdır.
Bu çalışmada osteosarkom (OS) türetilmiş ekstrasellüler (EVs) line-1 metilasyon üzerinde yağ dokusu türetilmiş mezenkimal kök hücrelerde (AT-MSCs) etkileri araştırıldı; Şekil 1). EVs çoğu hücre türleri tarafından salgılanan nano ölçekli, membran bağlı veziküller vardır. Onlar proteinler, lipidler, mRNA, mikroRNA ve ana hücrelerden ek moleküller taşırlar11,12. EVs hücreiçi iletişim aracılık ve çeşitli patofizyolojik koşullarda önemli roller oynamaktadır13,14. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, kanser kaynaklı EV'lerin aktif LINE-1'i alıcı hücrelere aktarabileceğini gösterdi15. Daha önce HOS-143B hücre hattından EVs DIĞER genetik etkilere ek olarak, MSCs LINE-1 metilasyon durumunu değiştirebilirsiniz bildirilmiştir16.
EV izolasyonu için büyüyen hücreler, FBS kaynaklı EVs diğer kaynaklardan EVs müdahale ve sonuçları engelleyebilir beri, büyüme orta EV tükenmiş fetal sığır serumu [FBS] kullanmak önemlidir17,18. Ultracentrifugation FBS evleri tüketmek için en yaygın yöntemlerden biridir. Bu ultrafiltrasyon ve ticari EV tükenmiş FBS19gibi alternatiflerile karşılaştırıldığında nispeten basit ve uygun maliyetli bir işlemdir. Burada protokol, EV'in tüketmiş FBS'sinin ultrasantrifikasyon la nasıl hazırlanacağını da göstermektedir.
Bu makalede, os-ev tedavi MSCs LINE-1 metilasyon analizi için bir işletim sistemi hücre hattından EVs izolasyonu, yukarıda belirtilen teknikler için ayrıntılı bir protokol sunar(Şekil 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+01T1</td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>MSC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3730XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BlueStar Prestained Protein Marker</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>MWP03</td>
			<td>WB: protein marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin (clone C5C9)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2679</td>
			<td>WB, dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 (clone H5C6)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556019</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5703000010</td>
			<td>For conditioned media and cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810000010</td>
			<td>For spinning down 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>331374</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 + GlutaMAX medium</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>For AT-MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneScan 500 LIZ size standard</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4322682</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WGA2-10RXN</td>
			<td>for MSPA negative control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Di formamide</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4311320</td>
			<td>for capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOS-143B cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-8303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp70 (clone 5G10)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554243</td>
			<td>WB, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-mouse</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32210</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-rabbit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>WB: secondary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LINE-1 probe-mix primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Sequences in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode</td>
			<td>Applied Biosystems, Life Technologies</td>
			<td>4306737</td>
			<td>also requires sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td>measure protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniProtean TGX 10% gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1034</td>
			<td>WB: gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM14C</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>WB: protein transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue XS</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740901.50</td>
			<td>for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>WB: blocking, antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Antibiotics for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tube, 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431064</td>
			<td>For storing Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-11015</td>
			<td>WB: total protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RKO cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2577</td>
			<td>for MSPA positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 + GlutaMAX</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>61870-010</td>
			<td>For HOS-143B cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA HhaI enzyme</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>SMR50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA reagent kit</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>EK1-FAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SALSA MLPA P300 probe-mix</td>
			<td>MRC-Holland</td>
			<td>P300-100R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging rotor SW-28</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>342207</td>
			<td>Ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>FPE-204-030</td>
			<td>sterile filtering FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai 12</td>
			<td>FEI Company</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Gatan Orius SC 
			1000B CCD-camera 
			(Gatan Inc., USA); for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS, 1X tablets</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-7500-100</td>
			<td>WB: buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>WB: transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TCA0096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>for trypsinization of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 (clone 4A10)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAB2702167</td>
			<td>WB, dilution 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

line-1 methylation analysis in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles

Metilasyona özgü prob amplifikasyon (MSPA), DNA örneklerinin metilasyon düzeylerindeki göreceli farklılıkları tespit etmek için kullanılabilen basit ve sağlam bir tekniktir. Beceriklidir, az miktarda DNA gerektirir ve yaklaşık 4-5 saat pratik çalışma gerektirir. Sunulan teknikte, DNA örnekleri önce denatüre edilir, sonra da dna'yı kontrol olarak metillenmiş veya referans alanlarda hedefleyen problarla melezlenir. Melezleştirilmiş DNA paralel reaksiyonlara ayrılır, biri sadece ligasyon, diğeri ise metillenmemiş GCGC dizilerinde HhaI aracılı sindirim inanılması ile ligasyondan geçilir. Ortaya çıkan DNA parçaları PCR ile yükseltilir ve kapiller elektroforez ile ayrılır. Metillenmiş GCGC siteleri HhaI tarafından sindirilmez ve pik sinyaller üretirken, metillenmemiş GCGC siteleri sindirilir ve pik sinyalleri üretilmez. Her bir numunenin sindirilmiş ve sindirilmemiş versiyonlarının kontrol-normalleştirilmiş zirvelerinin karşılaştırılması, bir DNA örneğinin metilasyon dozaj oranını sağlar. Burada, MSPA mezenkimal kök hücrelerde uzun serpiştirilmiş nükleer element-1 (LINE-1) metilasyon durumu osteosarkom kaynaklı ekstrasellüler (EVs) etkilerini tespit etmek için kullanılır. LINE-1'ler genellikle kanserde hipometilasyon geçiren tekrarlayan DNA elementleridir ve bu kapasitede biyomarker görevi görebilir. Ultracentrifugation ayrıca ekstrasellüler vezikülleri biyolojik sıvılardan ayırmak için uygun maliyetli bir yöntem olarak da kullanılmaktadır (örneğin, EV-tükenmiş fetal sığır serumu hazırlanırken [FBS] ve osteosarkom şartlı ortamdan eVs izole [diferansiyel santrifüj]). Metilasyon analizi için, özel LINE-1 probları LINE-1 organizatör dizisindeüç metilasyon sahasını ve yedi kontrol sahasını hedeflemek üzere tasarlanmıştır. Bu protokol LINE-1 metilasyon analizi için MSPA kullanımını gösterir ve ultracentrifugation tarafından EV-tükenmiş FBS hazırlanması açıklar.

Bu çalışmanın temel amacı OS-EV'lerin MSC'ler üzerindeki epigenetik etkilerini değerlendirmektir. OS-EV'ler standart diferansiyel santrifüj yöntemi kullanılarak HOS-143B hücrelerinden izole edilmiştir. Tipik EV belirteçleri CD63, Hsp70 ve TSG101'in batı lekeleme ile ifade edilerek OS-EV'lerin varlığı doğrulandı. (Şekil 2A). Calnexin sinyalinin yokluğu OS-EV izole saflık gösterdi. TEM ile ek saflık göstergesi gözlendi, çeşitli boyutlarda bozulmamı...

Watch this Scientific Journal Video about LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles at JoVE.com

LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

Burada açıklanan osteosarkom kaynaklı ekstrasellüler ile tedavi mezenkimal kök hücrelerde LINE-1 elemanlarının METilasyon düzeylerini analiz etmek için bir metilasyon özgü prob amplifikasyon yönteminin kullanımıdır. Ekstrasellüler vezikülleri fetal sığır serumundan ayırmak için popüler bir prosedür olan ultrasantrifüj de gösterilmiştir.

Osteosarkom Türetilmiş Ekstrasellüler Ile Tedavi Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerde LINE-1 Metilasyon Analizi

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of ...

DNA metilasyon en çok çalışılan epigenetik imzalardan biridir. Birçok kanser DNA metilasyon düzeylerinde değişiklikler ile karakterizedir, hangi anormal gen ekspresyonu ve diğer genomik anormallikler ile ilişkilidir. Uzun serpiştirilmiş nükleer elementler, normalde yüksek metilasyon seviyelerine sahip tekrarlayan transpoze genomik dizilerdir.Ancak, genellikle kanserde hipermethylated olur, onların aktivasyonu neden ve kromozomal istikrarsızlık yol açar. Bu çalışmada, kanser EVs MECs LINE-1 metilasyon etkileyebilir olup olmadığını görmek için osteosarkom türetilmiş ekstrasellüler ile mezenkimal kök hücreleri tedavi. Memeli hücre kültürü ortamının ayrılmaz bir bileşeni olan fetal büyükbaş serum, çok sayıda büyükbaş kaynaklı EV içerir.Bu Evs bizim ilgi hücrelerinden Evs analizi ile müdahale edecek, bu nedenle, EV izolasyon için büyüyen hücreler, EV tükenmiş FBS kullanmak önemlidir. Ultracentrifuge tüpler fbs alın ve ultracentrifuge kova yerleştirin. Kovaları sallanan bir rotora yüklemeden önce birbirinin 10 miligramı kadar dengeleyin.Rotoru ultracentrifuge'a yerleştirin ve 100,000 G'de 19 saat boyunca dört santigrat derecede çalıştırın. Çalışmadan sonra, dikkatle supernatant açık renkli üst tabakası toplamak ve 50 mililitrelik bir tüp aktarın. FBS'den evs içerdiğinden koyu kahverengi peleti rahatsız etmeyin veya boruyla titretmeyin.Supernatant'ı 0,22 mikron filtreden yeni bir 50 mililitrelik tüpe geçirin. Bu filtre sterilize, EV-tükenmiş FBS şimdi EV izolasyon u için hücreleri büyürken hücre kültürü ortama eklenebilir. EV-tükenmiş ortamda yetiştirilen osteosarkom hücrelerinden koşullandırılmış ortam toplamak.Hücreleri ve hücre enkazını temizlemek için, şartlandırılmış ortamı 2500 G'de 4 santigrat derecede 20 dakika santrifüj edin. Supernatant'ı ultracentrifuge tüplere aktarın ve daha önce olduğu gibi dengeleyin. Tüpleri 100, 000 G'de iki saat boyunca dört santigrat derecede santrifüj edin.Dikkatle alt kısmında bir mililitre etrafında bırakarak supernatant atın. EV peletini yıkamak ve yeniden askıya almak için boruya yaklaşık 20 mililitre PBS ekleyin ve hafifçe pipet. Tüpleri dengeleyin ve aynı ayarlarla başka bir ultracentrifugation turu gerçekleştirin.Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve 200 mikrolitre PBS'de NAZIK pipetleme ile EV peletini yeniden askıya alın. EVs'leri düşük bağlayıcı tüplerde saklayın. Saflaştırılmış EVs batı lekeleme, nanopartikül izleme analizi ve iletim elektron mikroskopisi ile karakterizedir.Plaka 15, 000 MSCs iyi bir 24 kuyu plaka başına. 24 saat sonra, eski ortamları çıkarın, hücreleri PBS ile yıkayın ve EV'in tüketen ortamına değiştirin. Hücreleri planlanan saat noktalarında OS-EV'lerle tedavi edin.EV tedavisini durdurduktan sonra, uygun bir yöntem kullanarak hücrelerden DNA ayıklayın. Metilasyon analizi için, özel yapım metilasyona özgü prob amplifikasyon yöntemi kullandık. Pavicic ve diğerleri tarafından daha önce yapıldığı gibi özelleştirilmiş LINE-1 problarını tasarla.Metilasyon probları için, organizatör bölgesi içindeki HhaI kısıtlama bölgesini içeren üç dizi seçin. Kontrol sondaları için LINE-1 dizisinin geri kalanından HhaI kısıtlama alanı olmayan yedi dizi seçin. TE tamponundaki 70 nanogram DNA örneğini beş mikrolitreye seyreltin.Örnekleri 98 derecede 10 dakika ısıtın ve ardından 25 santigrat dereceye kadar soğutun. Her numuneye üç mikrolitre prob hibridizasyon karışımı ekleyin ve probların DNA ile melezlemesi için termocycler çalıştırın. Oda sıcaklığında, her numuneye 30 mikrolitre hibritleştirme sonrası karışımı ekleyin.İkinci bir tüpe 10 mikrolitre aktarın. Her iki tüp setini de termocycler'a yerleştirin ve en az bir dakika boyunca 48 derecede kuluçkaya yatırın. Numuneler 48 santigrat derecede yken, ilk tüp setine 10 mikrolitre ligasyon karışımı ve ikinci tüp setine 10 mikrolitre ligasyon-sindirim karışımı ekleyin.Bir sonraki termocylcer programını çalıştırın. Daha sonra tüpleri aşağı doğru çevirin ve termocycler'ı aynı anda 72 santigrat dereceye ayarlayın. Her tüpe beş mikrolitre polimeraz karışımı ekleyin ve tüpleri termocycler'a yerleştirin.PCR programını çalıştırın. PCR programı çalışırken, 2,5 mikrolitre boyut standardı içeren bir mililitre formamid çözeltisi hazırlayın. Bir optik 96 kuyu plaka her satır için bu çözeltinin Pipet 10 mikrolitre.PCR'den sonra, sindirilmemiş ve sindirilmiş numuneleri ultra saf suda sırasıyla 1'den 1'e 200'e seyreltin. 96 kuyu plakasına iki mikrolitre seyreltilmiş PCR ürün ekleyin. Hava kabarcıklarını temizlemek için plakayı 200 G'de 15 ila 20 saniye santrifüj edin.Kapiller elektroforez ile numunelerin parça analizini yapın. Bir elektroferogram analiz yazılımı ile kapiller elektroforez sonuçlarını açın. Bir örnek seçin ve menüden paneli MLPA olarak ayarlayın.Bu ayarı tüm örneklere uygulamak için panele tıklayın ve D denetimine basın. Benzer şekilde, analiz yöntemini tüm numuneler için mikrouydu varsayılanı olarak ayarlayın. Tüm örnekleri seçin ve analizi çalıştırmak için yeşil play düğmesine tıklayın, sonra tüm örnekleri seçin ve sonda zirveleri görselleştirmek için grafik düğmesine tıklayın.Tek tek zirvelerin daha yüksek çözünürlüğü için en yüksek bölgeyi yakınlaştırın. LINE-1 prob karışımındaki problara karşılık gelen 10 tepenin tamamının etiketlenmiş olduğundan emin olun. Genotipler sekmesinde, sonuçları CSV biçiminde dışa aktarın.CSV dosyasını bir veri analizi yazılımında açın ve verileri sütunlara sıralayın. Üç metilasyon alanı tepenoktalarını boyutlarına göre etiketle. Geri kalan yedi tepe kontrol sondalarına karşılık gelir.Burada yaklaşık 117 baz çifti boyutuna sahip LINE-1 2M prob zirveleri kullanıyoruz. Her örnek için, yedi denetim tepe noktasının toplam tepe alanını hesaplayın. Her LINE-1 sondasının en yüksek alanını bu toplama bölün.Her örnek için, metilasyon dozaj oranını elde etmek için sindirilmemiş numunenin değeri ne kadar sindirilmiş numuneye bölün. Batı lekeleme analizi, TSG101, HSP70 ve CD63 için gözlenen sinyallerile OS-EVs varlığını doğruladı. Kalneksin sinyalinin yokluğu EV örneğinin saf olduğunu gösterdi.OS-EV örneğinde bulunan çeşitli boyutlarda bozulmamış veziküller ile TEM ile ek saflık göstergesi gözlenmiştir. OS-EV parçacık konsantrasyonu ve boyut dağılımı NTA ile ölçüldü. EV'lerin %80'i 50 ila 200 nanometre arasındaydı.Burada EV tedavisinin farklı zaman noktalarında MSCs LINE-1 metilasyon doz oranları görebilirsiniz. Gri çizgi, sıfır noktasından temel metilasyon düzeyini temsil eder. Üçüncü noktada, EVs'nin uygulanmasından sonra ortalama metilasyon dozaj oranında bir azalma vardır ve bu da hipermetilasyon gösterir.EVs bu hipermetilasyon etkisi zaman yedi noktada daha az belirgindir. Burada metilasyon analizi için basit, son derece hassas ve sağlam bir teknik gösterdik. Bisülfit dönüşümü olmayan düşük miktarda DNA gerektirir ve parafinle gömülü örneklerden izole edilmiş DNA için de uygundur.Tüm yöntem, deneysel ve analitik parçalar ile, yaklaşık iki gün sürer. Genomdaki LINE-1 kopya sayısının yüksek olması nedeniyle, LINE-1'in temel metilasyonları normal numunelerde yüksektir. Bu nedenle, bu yöntemde gözlendiği gibi, numunelerin metilasyon düzeylerindeki farklılıklar ince olabilir.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Ahşap Formasyonu ve İkincil Kök Gelişimi ile ilgilendim Genler ve Promoters incelenmesi için Kaynaklı Somatik Sektör Analizi (ISSA) Kullanımı

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Yapay Faktörler Mühendislik Özellikle İnsan Hücreleri alternatif bağlantı işleyin için

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Fizyolojik Oksijen Koşullarına Maruz İnsan hücrelerinde Cap-bağlayıcı proteinlerin analizi

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

Kronik Lenfositik Lösemi Hastalarında Metil-CpG-Bağlayıcı Alan Yakalamaya Dayalı Bir Yöntem Kullanarak Kapsamlı DNA Metilasyon Analizi

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

DNA değişiklikler için Immunostaining: Confocal görüntülerin sayısal analiz

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Mitokondrial DNA metilasyonu doğru algılanması için metodoloji

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endojen Protein insan etiketleme Pluripotent kök hücre kullanarak CRISPR/Cas9 indüklenen

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Fare embriyonik kök hücre kullanarak Southern blot ve polimeraz zincir reaksiyonu Homolog rekombinasyon olaylar tanımlaması

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...