Encellede oppløsning tredimensjonal avbildning av intakte organoider

Vår protokoll kan brukes til å visualisere organoidenes strukturelle kompleksitet, slik at kartlegging av identitet, sulfat og distribusjon i disse 3D-strukturene ved encelleoppløsningen. Vår raske tre-dagers protokoll er fullt optimalisert for organoider av forskjellig opprinnelse og bruker en enkel prøveforberedelse, som inkluderer et giftfritt optisk clearingtrinn og en silisiumbasert monteringsmetode. Selv om vår protokoll er enkel, kan noen av dem kritiske trinn som organisert håndtering, eller lysbildeforberedelsen, forklares bedre gjennom visuell demonstrasjon enn gjennom tekst.

For å gjenopprette 100 til 500 mikrometer diameter organoider dyrket i kjeller membran ekstrakt i 24 brønnplater, vask hver sveis som skal høstes med PBS uten å forstyrre 3D matriser, og plasser platen på is. Tilsett en milliliter iskald restitusjonsløsning til hver brønn og legg platen på en horisontal shaker ved fire grader Celsius i 30 til 60 minutter. Dypp en milliliter pipettespiss i en 1% BSA i PBS-løsning og pipette opp og ned to ganger for å belegge hver spiss med BSA.

Deretter legger du til fem milliliter med 1% PBS BSA til ett 15 milliliter rør per tilstand, og inverterer røret to til tre ganger før du kaster løsningen, for å belegge innsiden av røret. For å samle organoider, bruk en belagt tupp for å forsiktig suspendere brønninnholdet fem til 10 ganger, og trekk alle organoidene fra hver tilstand i et enkelt belagt 15 milliliter rør. Skyll hver brønn med en milliliter iskald 1% PBS BSA for å sikre at alle organoider er samlet inn, og overfør vaskene til de aktuelle rørene.

Ta det endelige volumet i hvert rør opp til 10 milliliter med kald PBS, og sediment organoider ved sentrifugering for å oppnå en tett palett uten et synlig lag av 3D matrise. For å fikse organoider, bruk en belagt en milliliter pipettespiss for å forsiktig suspendere hver pellet i en milliliter iskald para formaldehyd, og fest ved fire grader Celsius i 45 minutter. Forsiktig re-suspendere organoider halvveis gjennom fikseringstiden.

Etter 45 minutter, tilsett 10 milliliter iskald PBS pluss tween 20 til hvert rør og bland forsiktig ved inversjon, før du plasserer rørene på fire grader Celsius i 10 minutter. For å blokkere organoidene, på slutten av inkubasjonen, spinn ned prøvene og re-suspendere pellets i minst 200 mikroliter av iskald organoid vaskebuffer per brønn som skal belagt. Deretter overfører organoider til individuelle brønner av en 24 brønner suspensjon plate for en 15 minutters inkubasjon ved fire grader Celsius.

For immunolabeling tilsett 200 mikroliter organoid vaskebuffer i en tom referansebrønn, og la organoidene bosette seg til bunnen av platen. Når organoidene har avgjort, vipp platen i en 45 graders vinkel for å tillate fjerning av alle unntatt de siste 200 mikroliter av vaskebuffer. Deretter legger du til 200 mikroliter organoid vaskebuffer som inneholder de primære antistoffene av interesse, og plasserer platen over natten på fire grader Celsius med mild gynge og risting ved 40 omdreininger per minutt.

Neste morgen legger du til en milliliter organoid vaskebuffer til hver brønn, og la organoidene bosette seg til bunnen av platen i tre minutter. Når organoidene har avgjort, fjern alle unntatt de siste 200 mikroliter fra hver brønn, og vask organoidene med tre to timers vasker med en milliliter fersk organoid vaskebuffer, og mild gynge og risting per vask. Etter den tredje vasken, la organoidene bosette seg på bunnen av platen i tre minutter før du fjerner alle unntatt de siste 200 mikroliter organoid vaskebuffer fra hver brønn.

Tilsett 200 mikroliter organoid vaskebuffer som inneholder de riktige sekundære antistoffene til hver brønn for en overnattingsinkubasjon ved fire grader celsius med mild gynge og risting. Neste morgen, vask organoidene med tre to timers vasker i en milliliter frisk organoid vaskebuffer per vask, som demonstrert. Etter siste vask, overfør organoidene til en 1,5 milliliter tube per brønn, og samle organoider ved sentrifugering.

For optisk rydding av organoider, fjern så mye vaskebuffer fra hvert rør som mulig, uten å forstyrre organoidene, og bruk en modifisert 200 mikroliter pipettespiss for å legge til minst 50 mikroliter FUnGI til hver pellet. Etter en 20 minutters inkubasjon ved romtemperatur kan organoidene lagres i opptil en uke ved fire grader Celsius, eller i opptil seks måneder ved minus 20 grader Celsius. For å forberede lysbilder for organoid avbildning ved konfokal mikroskopi, fyll en 10 milliliter sprøyte med silikontetningsmasse og fest en modifisert 200 mikroliterpipettespiss til sprøyten.

Bruk sprøyten til å tegne et rektangel på en etter to centimeter midt i et lysbilde, og bruk en annen modifisert 200 mikroliter pipettespiss til å plassere klarerte organoider i midten av rektangelet. For å plassere et deksel slip over organoider, plasser venstre side av dekselet slip ned først, før sakte senke dekselet slip fra venstre til høyre til det ikke er fanget luft. Deretter forsiktig påfør trykk på alle kantene på dekselet slip å feste den til silikon tetningsmasse.

Hvis du vil se for deg organoidene, plasserer du lysbildet på scenen i et konfokal laserskanningsmikroskop, og velger et multisenking 25 X-mål for konfokal avbildning. Sett mikroskopet til de riktige oppkjøpsinnstillingene, og velg en lav lasereffekt for å redusere bleking av bilder. Bruk Z-stakkmodus til å definere øvre grenser i den nedre enden, og sett Z-trinnstørrelsen til optimal.

Når du avbilder store organoidstrukturer, eller flere organoider sammen, bruk flisleggingsmodus med en 10% overlapping og angi interesseområdet. Når alle parameterne er angitt, får du en 3D-gjengitt representasjon av bildebehandlingen i bildebehandlingsprogramvaren, og optimaliserer egenskapene for lysstyrke, kontrast og 3D-gjengivelse. Eksporter deretter RGB øyeblikksbilder av resultatene som TIFF-filer.

Styrken av 3D-bildebehandling sammenlignet med 2D-bildebehandling illustreres av disse bildene av musepattedyrkjertel organoider som ble generert som demonstrert. Det sentrale laget av disse representative organoidene består av søyleformede K8/K18 positive armaturceller, og det ytre laget inneholder langstrakte K5 positive basilikumceller, og rekafisering av morfologien til brystkjertelen in vivo. Denne polariserte organisasjonen er utfordrende å sette pris på fra en 2D optisk del av samme organoid.

Et annet eksempel på en kompleks struktur som er umulig å tolke uten 3D-informasjon er nettverket av MRP2 positive canaliculi som letter innsamlingen av gallevæsken av menneskelige leverorganoider. Videre gir den oppnådde kvaliteten og oppløsningen mulighet for halvautomatisk segmentering og bildeanalyse. Dermed kan totale celletall og tilstedeværelsen av markører kvantifiseres i spesifikke cellulære undertyper i hele organoider.

Ved å segmentere kjernene i en hel organoid som inneholder 140 celler, kan tre celler som viser høy positivitet for Ki67 cellesyklusmarkør identifiseres. Det optiske clearingmiddelet, FUnGI, overgår uklart og fruktose-glyserolrydding i fluorescerende signalkvalitet dypt inne i et organoid. Med FUnGI ryddet organoider som viser en samlet forbedret fluorescens intensitet sammenlignet med uklare organoider.

Vær oppmerksom på at eventuelle rester av BME i prøven kan føre til redusert antistoffpenetrasjon og kan føre til høyt bakgrunnssignal. I tillegg bør cystiske organoider ikke optisk ryddes hvis de kollapser. Med små tilpasninger til protokollen kan prøvene brukes med super oppløsning konfokal, multi foton og lysarkmikroskopi.