Name: 3d multicolor dna fish tool to study nuclear architecture in human primary cells
Uploaded: 2020-01-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells at JoVE.com

המחברים מכירים בסיוע הטכני של מתקן הדימות INGM (המכון הפוליטכני של המרכז הטכנולוגי "רומיאו אד אנריקה" (INGM), מילאנו, איטליה), במיוחד C. Cordiglieri, לקבלת סיוע במהלך 3D תמונות דג DNA מרובת צבעים רכישת. עבודה זו נתמכת על ידי המענקים הבאים כדי לבי: התוכנית הדגל האיטלקי epigen, האגודה הצרפתית דשנה Myopathies (afm-שידור, גרנט nr 18754) ו ג'ובאני ricercatori, משרד הבריאות האיטלקי (GR-2011-02349383). עבודה זו נתמכת על ידי המענק הבא פ: Fondazione קאריפלו (באנדו ג'ובאני, גרנט nr 2018-0321).

1. הכנה לבדיקת דנ א והליכי תיוג עם ניק תרגום
<ol><li>לטהר ולנקות כרומוזומים מלאכותיים בקטריאלי (BACs), פלמידים או מוצרי PCR עם ערכות ספציפיות (טבלה של חומרים), להשעות מחדש ב ddh2O, בדוק על ידי אלקטרופורזה על ג'ל agarose וככמת.</li>
	<li>לבצע את התרגום ניק על 1.5 ליטר 2 μg של ה-DNA משלב 1.1 בנפח הסופי של ...

<ol>
	<li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+territories,+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells.">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture.">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li><li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+3D+genome.">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).</li><li>van Steensel, B., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+transcription+in+shaping+the+spatial+organization+of+the+genome.">The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).</li><li>Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+genome+organization+and+cognition.">Spatial genome organization and cognition.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).</li><li>Pombo, A., Dillon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+genome+architecture:+players+and+mechanisms.">Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).</li><li>Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+contact+permits+transcription+between+coregulated+genes.">Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes.</a> Cell. 155 (3), 606-620 (2013).</li><li>Therizols, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+decondensation+is+sufficient+to+alter+nuclear+organization+in+embryonic+stem+cells.">Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells.</a> Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).</li><li>Gonzalez-Sandoval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinuclear+Anchoring+of+H3K9-Methylated+Chromatin+Stabilizes+Induced+Cell+Fate+in+C.+elegans+Embryos.">Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos.</a> Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).</li><li>Hubner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+nuclear+landscapes+during+human+myelopoietic+cell+differentiation+maintains+co-aligned+active+and+inactive+nuclear+compartments.">Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).</li><li>Aymard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+long-range+contacts+unveils+clustering+of+DNA+double-strand+breaks+at+damaged+active+genes.">Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).</li><li>Sellou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poly(ADP-ribose)-dependent+chromatin+remodeler+Alc1+induces+local+chromatin+relaxation+upon+DNA+damage.">The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).</li><li>Krijger, P. H., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome.">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).</li><li>Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+TADs:+How+Alterations+of+Chromatin+Domains+Result+in+Disease.">Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease.</a> Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).</li><li>Cortesi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4q-D4Z4+chromatin+architecture+regulates+the+transcription+of+muscle+atrophic+genes+in+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy.">4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy.</a> Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).</li><li>Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+and+divergence+of+regulatory+strategies+at+Hox+Loci+and+the+origin+of+tetrapod+digits.">Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits.</a> PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).</li><li>Woltering, J. M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrapod+axial+evolution+and+developmental+constraints;+Empirical+underpinning+by+a+mouse+model.">Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model.</a> Mechanisms of Development. 138, 64-72 (2015).</li><li>de Laat, W., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3C-based+technologies+to+study+the+shape+of+the+genome.">3C-based technologies to study the shape of the genome.</a> Methods. 58 (3), 189-191 (2012).</li><li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+decade+of+3C+technologies:+detailed+insights+into+nuclear+organization.">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes &amp; Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li><li>Finn, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Heterogeneity+and+Intrinsic+Variation+in+Spatial+Genome+Organization.">Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization.</a> Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).</li><li>Zheng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+chromatin+interactions+with+single-molecule+precision.">Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision.</a> Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).</li><li>Solovei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+on+tissue+cryosections.">Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).</li><li>Cremer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+3D+fluorescence+in+situ+hybridization+for+imaging+interphase+chromosomes.">Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+three-dimensional+localization+microscopy+across+large+volumes.">High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes.</a> Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).</li><li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT.">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+genomic+loci+in+living+human+cells+by+an+optimized+CRISPR/Cas+system.">Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system.</a> Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).</li><li>Nelles, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+RNA+Tracking+in+Live+Cells+with+CRISPR/Cas9.">Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9.</a> Cell. 165 (2), 488-496 (2016).</li><li>Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifaceted+FISH+approach+to+study+endogenous+RNAs+and+DNAs+in+native+nuclear+and+cell+structures.">A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures.</a> Current Protocol of Human Genetics. , 15 (2013).</li><li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).</li><li>Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+nuclear+positioning+of+the+monoallelically+expressed+astrocyte+marker+GFAP.">Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP.</a> Genes &amp; Development. 22 (4), 489-498 (2008).</li><li>Kraus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+structured+illumination+microscopy+of+nuclear+structures.">Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures.</a> Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).</li><li>Solovei, I., Cremer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-FISH+on+cultured+cells+combined+with+immunostaining.">3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).</li><li>Skinner, B. M., Johnson, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+morphologies:+their+diversity+and+functional+relevance.">Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance.</a> Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).</li><li>Schoenfelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pluripotent+regulatory+circuitry+connecting+promoters+to+their+long-range+interacting+elements.">The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements.</a> Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).</li><li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling.">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).</li><li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+super-resolution+imaging+of+chromosomes+and+in+situ+haplotype+visualization+using+Oligopaint+FISH+probes.">Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes.</a> Nature Communication. 6, 7147 (2015).</li><li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+design+and+synthesis+platform+for+visualizing+genomes+with+Oligopaint+FISH+probes.">Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).</li><li>Samacoits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+framework+to+study+sub-cellular+RNA+localization.">A computational framework to study sub-cellular RNA localization.</a> Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).</li><li>Cardozo Gizzi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy-Based+Chromosome+Conformation+Capture+Enables+Simultaneous+Visualization+of+Genome+Organization+and+Transcription+in+Intact+Organisms.">Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms.</a> Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).</li><li>Mateo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+DNA+folding+and+RNA+in+embryos+at+single-cell+resolution.">Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution.</a> Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).</li><li>Nir, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Walking+along+chromosomes+with+super-resolution+imaging,+contact+maps,+and+integrative+modeling.">Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling.</a> PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).</li><li>Bintu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+chromatin+tracing+reveals+domains+and+cooperative+interactions+in+single+cells.">Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li></ol>

השיטה הנוכחית מתארת את הפרוטוקול צעד אחר צעד לביצוע דג DNA תלת-צבעי תלת-ממדי על מגוון רחב של תאים ראשיים אנושיים. למרות שדגי ה-dna הוא טכנולוגיה בשימוש רחב, 3d דג ה-dna דגים על שנשמרו גרעיני interphase תלת-ממד עדיין קשה לבצע במעבדות רבות, בעיקר בשל המאפיינים של דגימות בשימוש23,<sup class="x...

Eukaryotes גבוה יותר צריך לדחוס באופן שיטתי וקומפקטי כמות עצומה של מידע גנטי ברגע 3d החלל של הגרעין1,2,3,4. היום, אנו יודעים כי הגנום הוא מרחב הורה בתאים ותחומים הקשורים טופולוגית5 וכי רמות מרובות של קיפול DNA ליצור קשרים בין אזורים גנומית שונים שעשויים לכלול לולאה כרומטין היווצרות6,7. הלולאה הדינמית 3d של כרומטין יכול להשפיע על תהליכים ביולוגיים רבים שונים כגון שעתוק8,9, בידול ופיתוח10,11, DNA תיקון12,13, בעוד רטבאליות שלה מעורבים במחלות שונות14,15,16 ופגמים התפתחותיים15,17,18.
גישות רבות פותחו כדי ללמוד את ארגון הגנום 3D. היווצרות כרומוזום טכנולוגיות מבוססות לכידת (C-טכנולוגיות, 3c, 4c, 5c, היי-C ונגזרים) פותחו כדי ללמוד ארגון הגנום בתאים קבועים3,4,19,20. גישות כאלה מבוססות על היכולת ללכוד את תדרי המגע בין הרוח גנומית בסמיכות פיזית. C-טכנולוגיות, בהתאם למורכבות שלהם, לתפוס את הארגון הגלובלי 3d הגנום וטופולוגיה גרעינית של אוכלוסייה תא3,4,19,20. עם זאת, אינטראקציות תלת מימד הן דינמיות בזמן ובמרחב, משתנה מאוד בין תאים בודדים המורכב מאינטראקציות של מולטיפלקס, והן הטרודוגני בהרחבה21,22.
3D מרובה הקרינה הפלואורסצנטית DNA באתרו היברידיזציה (דג) היא טכניקה המאפשרת ויזואליזציה של גנומית ספציפיים ברמת תא בודד, המאפשר חקירה ישירה של האדריכלות הגרעינית 3D בצורה משלימה C-טכנולוגיות. היא מייצגת טכנולוגיה המשמשת כיום לאימות בלתי משמעי של תוצאות C. 3D-DNA דגים מרובי צבעים משתמש בדיקות באמצעות פלואורוסקופים המשלימים את הרוח גנומית של אינטרסים. השימוש fluorophores שונים וציוד מיקרוסקופ מתאים לאפשר הדמיה עכשווית של מטרות מרובות בתוך החלל הגרעיני23,24. בשנים האחרונות, הדגים שולבו עם פיתוחים טכנולוגיים במיקרוסקופיה כדי להשיג את ההדמיה של מבנים בקנה מידה משובח ברזולוציה גבוהה25,26 או עם הגישות crispr-Cas עבור ההדמיה של חומצות גרעין ב הדמיה חיה27,28. למרות אימוץ רחב, 3D מרובת צבעים הגישה דג DNA הוא עדיין נחשב קשה במעבדות רבות כי החומר הביולוגי המשמש חייב להיות מותאם.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מקיף עבור 3D דג ה-DNA דגים (מתא/בדיקה הכנה לניתוח נתונים) החלים על מגוון רחב של תאים ראשוניים אנושיים, המאפשר ויזואליזציה של גנומית מרובים ושמירה על מבנה 3D של גרעינים. כדי ללמוד אדריכלות גרעינית, המבנה התלת-ממדי של גרעיני חייב להישמר. מסיבה זו, מנוגד פרוטוקולים קיימים אחרים29,30,31, אנו נמנעים מהשימוש במעבר אלכוהול ואחסון של שמיכות באלכוהול שיכולים להשפיע על מבנה כרומתין32. השיטה מותאמת מפני שנשמרו 3d DNA הפרוטוקולים דגים24,33 להיות מוחל על מגוון רחב של תאים ראשוניים אנושיים, הן מבודדות לשעבר vivo או תרבותי בתחום החוץ. יש החדירות ואת הפרמטרים הדפרוטמולוגיה עבור המאפיינים הגרעיניים שונים ומאפיינים ציטולוגיים (למשל, דרגות שונות של דחיסה גרעינית, שפע השלד ציטומה)34. פרמטרים אלה מתוארים בדרך כלל בפרוטוקולים אחרים24,33, מבלי לספק אפליה ברורה של ההליך בתוך סוגי תאים שונים. יתר על כן, פיתחנו כלי ספציפי בשם NuCLεD (מאתר הקשר הגרעיני ב 3D)16, מתן עקרונות לניתוח נתונים שישפרו את הקירבה 3d בין המקום האחר ואת התפלגות טופולוגית הגרעינית שלהם בתוך החלל הגרעיני באופן אוטומטי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin 488</td>
			<td>DBA</td>
			<td>DI7488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin 11 d-UTP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverlsips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>117500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CY3 d-UTP</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA53022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate (powder)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-203917A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin 11 d-UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093088910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21969-035 500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18010-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AMPD1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (C-G-A-T)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>BL0423A/C/G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644.2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Hyclone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutammine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15279-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278-5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennycillin/Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070-063 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>P6887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhasePrep BAC DNA Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NA0100-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Gel Extraction &#38; PCR Purification Combo Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K220001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubbercement</td>
			<td>Bostik</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidina Alexa fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S21374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1110379026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d multicolor dna fish tool to study nuclear architecture in human primary cells

השאלה העיקרית בביולוגיה התא הוא ארגון גנומית בתוך החלל הגרעיני וכיצד אדריכלות כרומטין יכול להשפיע על תהליכים כגון ביטוי גנים, זהות תא ובידול. גישות רבות שפותחו כדי ללמוד את ארכיטקטורת 3D של הגנום ניתן לחלק לשתי קטגוריות משלימות: לכידת כרומוזום טכנולוגיות מבוססות לכידה (C-טכנולוגיות) והדמיה. בעוד הראשון מבוסס על לכידת קונפורמציה כרומוזום ואינטראקציות DNA האבובית באוכלוסייה של תאים קבועים, האחרון, מבוסס על הזריחה DNA באתרו היברידיזציה (דג) על גרעיני תלת-ממד, מאפשר הדמיה עכשווית של הילה מרובים ברמת תא בודד (ססגוניות), בחינת האינטראקציות שלהם והפצה בתוך הגרעין (3d דג DNA מרובה צבעים). הטכניקה של 3D דג ה-DNA מרובת צבעים יש מגבלה של המחשה רק כמה מראש מראש, לא מאפשר ניתוח מקיף של האדריכלות הגרעינית. עם זאת, בהינתן את החוסן של תוצאותיה, 3D מרובת צבעים דג DNA בשילוב עם 3D-מיקרוסקופיה ושחזור תמונה היא שיטה אפשרית כדי לאמת את התוצאות C-טכנולוגיה מבוססת לחקור באופן משמעי את המיקום והארגון של המקום המסוים ברמת תא בודדת. כאן, אנו מציעים צעד אחר צעד שיטה של 3D מרובת צבעים דג DNA מתאים למגוון רחב של תאים הראשי האדם ולדון בכל הפעולות המעשיות, צעדים מכריעים, מושגים של 3D הדמיה וניתוח נתונים הדרושים כדי להשיג מוצלח אינפורמטיבי 3D תלת-צבעי דגי דנ א בתוך הקשרים ביולוגיים שונים.

השיטה של 3D דג ה-DNA דגים תיאר במאמר זה מאפשר הדמיה עכשווית של הרוח גנומית שונים בתוך שנשמרו גרעיני תלת-ממד (איור 1B). פרוטוקול זה מתיר את מדידת המרחקים בין האללים, ובין גנומית שונים כדי להעריך את קרבתו המרחבית, ולאמוד את מיקומם בתוך החלל הגרעיני (למשל, מרחק המקום מן הסנ?...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells at JoVE.com

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

3d-DNA דגים ססגוניות מייצג כלי להמחיש המקום גנומית מרובים בתוך גרעיני תלת-ממד משומרים, חד משמעית הגדרת אינטראקציות הדדית שלהם לוקליזציה בתוך החלל הגרעיני ברמת תא בודד. כאן, פרוטוקול צעד אחר צעד מתואר עבור קשת רחבה של תאים ראשוניים אנושיים.

3D מרובת צבעים דג DNA כלי ללמוד אדריכלות גרעינית בתאים ראשוניים אנושיים

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...

3D רב צבעי DNA FISH מאפשר הדמיה של לוקוסים גנומיים מרובים בתוך גרעינים משומרים להגדיר באופן עמימות האינטראקציה ההדדית שלהם לוקליזציה ברמת תא יחיד. 3D רב צבע DNA דגים מאפשר חקירה ישירה של הארכיטקטורה הגרעינית. באופן כללי, היא פועלת בשילוב עם טכנולוגיות מבוססות לכידת כרומוזום מה שהופך את הטכניקה לכלי זמין לאימות נתוני C בתוך תאים בודדים.הפגנת ההליך תהיה פדריקה מרסקה. היא פוסט-דוק במעבדה שלי. התחל על ידי דגירה של תערובת תרגום ניק במיקסר תרמי ב 16 מעלות צלזיוס על פי אורך חומר ה- DNA ההתחלתי.בסוף הדגירה, לבדוק את גודל הבדיקות על 2.2% ג'ל אגרוז. עבור כל ניסוי DNA FISH, לזרז את הכמות המתאימה של בדיקה על פי חומר ה-DNA ההתחלתי שממנו הבדיקות יוצרו ב 150 microliters של מים מזוקקים כפולים, 20 מיקרוגרם של דנ"א זרע סלמון ללא תריס, 3.5 מיקרוגרם של דנ"א ספציפי של מינים, שלושה כרכים של 100%אתנול, ונפח 1/10 של שלושה נתרן אצטט טוחן במשך שעה אחת במינוס 80 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, צנטריפוגה המדגם במהירות מקסימלית במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס.לאחר השלכת supernatant, לשטוף את גלולה פעמיים עם 500 microliters של 70% אתנול. לאחר הכביסה השנייה, יש להתריע מחדש על גלולה בשני מיקרוליטרים של 100% formamide ולנער את הגשוש במשך 30 דקות ב 40 מעלות צלזיוס לפני הוספת נפח שווה של 4X מלוחים נתרן ציטראט ב 20%dextran סולפט. עבור קיבעון טרום טיפול ו permeabilization של תאים קטנים עם גרעינים קטנים כמות נמוכה של ציטופלסמה, תחילה להוסיף פעמיים 10 לתאים השישית ב 200 microliters של PBS ישירות על כיסויי זכוכית בארות בודדות של צלחת 24 היטב ולאפשר לתאים להתיישב במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, החלף במהירות את ה-PBS ב-300 מיקרוליטרים של 4% פרפורמלדהיד טריים בתוספת 0.1%Tween 20. לאחר 10 דקות, לשטוף את התאים הקבועים שלוש פעמים ב 300 microliters של 0.05% TPBS במשך חמש דקות לשטוף בטמפרטורת החדר. לאחר הכביסה האחרונה, לחלחל לתאי T עם 300 microliters של 0.5% TPBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני הטיפול בתאים עם 250 microliters לכל באר של קוקטייל RNAse מדולל 1:100 ב PBS במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, שוטפים את התאים ב-300 מיקרוליטרים של PBS ומוסיפים 300 מיקרוליטרים של 20% גליצרול ב-PBS לכל באר עם דגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, מניחים את הזכוכית על קרח יבש במשך 15 עד 30 שניות כדי להקפיא את התאים לפני הפשרה הדרגתית של הדגימות בטמפרטורת החדר והשרייתם ב-300 מיקרוליטרים של 20% גליצרול ב-PBS למשך 30 שניות. לאחר הקפאה/הפשרה של התאים שלוש פעמים נוספות כפי שהודגם זה בלבד, לשטוף את הדגימות 300 microliters של 0.5% TPBS במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו שתי שטיפות ב 300 microliters של 0.05% TPBS במשך חמש דקות לשטוף בטמפרטורת החדר.לאחר הכביסה האחרונה, לטפל בתאים עם 300 microliters של 0.1 חומצה הידרוכלורית נורמלית במשך 12 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו שתי שטיפות ב 300 microliters של נתרן ציטראט מלוחים. לאחר מכן לתקן את הדגימות לילה 300 microliters של 50% formamide ב 2X מלוחים נתרן ציטראט בטמפרטורת החדר. עבור קיבעון, טרום טיפול ו permeabilization של תאים גדולים עם כמות גבוהה של ציטופלסמה, לתקן, טרום טיפול ו permeabilize התאים בדומה כפי שהוכח עבור תאי T ראשוניים אנושיים ולטפל בדגימות עם 300 microliters של 0.0025%pepsin ב 0.01 חומצה הידרוכלורית נורמלית במשך כמה שניות עד חמש דקות.שימו לב לתאים תחת מיקרוסקופ אופטי ועצרו את התגובה עם שתי שטיפות של חמש דקות ב-300 מיקרוליטרים של מגנזיום כלוריד 50 מילימולרי ברגע שהגרעין חופשי מהציטופלסמה אך הגרעינים עדיין נראים ושלם. עבור 3D רב צבעי DNA דגים, denature בדיקות הכלאה ב 80 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ומיד למקם את הבדיקות על קרח. טען את הבדיקות על שקופית מיקרוסקופ נקייה והצב קו כיסוי אחד של תאים על כל טיפת בדיקה.לאטום את הקצוות כיסוי עם מלט גומי. כאשר המלט התייבש לחלוטין, denature את הדגימות על בלוק חימום 75 מעלות צלזיוס. לאחר ארבע דקות, מייבשים את הדגימות ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה בקופסה מתכתית הצפה באמבט מים.למחרת בבוקר, לקלף את מלט גומי עם שקופיות שקוע 2X מלוחים נתרן ציטראט בזהירות להרים את כיסויים. מניחים כל כיסוי לתוך בארות בודדות של צלחת שש באר המכילה שני מיליליטר של ציטראט נתרן מלוחים טריים ל הבאר במשך שתי שטיפות של חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב 90 מהפכות לדקה. בסוף הדגירה, לשטוף את הכיסויים לזמן קצר בשני מיליליטר של 0.2%Tween 20 ב 4X מלוחים נתרן ציטראט.לגילוי DNA FISH תלת-צבעי תלת-צבעי, העבר את הכיסויים לתוך בארות בודדות של צלחת חדשה של 24 בארות וחסום כל כריכה לא ספציפית ב-300 מיקרוליטרים של חיץ חסימה למשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-20 מהפכות לדקה. בסוף הדגירה, לטפל בדגימות עם הריכוז המתאים של אנטי digoxigenin ו / או סטרפטבידין מדולל במאגר חסימה במשך 35 דקות בתא חשוך ורטוב ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, להעביר את הדגימות בארות בודדות של צלחת שש באר ולשטוף את הדגימות שלוש פעמים בשני מיליליטר של 0.2% Tween 20 ו 4X מלוחים נתרן ציטראט במשך חמש דקות לכל לשטוף עם רועד ב 90 מהפכות לדקה.לאחר הכביסה האחרונה, לצייד את הדגימות בשני מיליליטר של PBS לפני העברת coverslips לצלחת חדשה 24 באר עבור לאחר תיקון ב 300 microliters של 2% פורמלדהיד ב PBS לכל גם במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים הקבועים חמש פעמים לזמן קצר ב 300 microliters של PBS, ואחריו כתמים עם DAPI מדולל ב ננוגרם אחד למיליליטר ב 300 microliters של PBS במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את הכיסויים חמש פעמים נוספות PBS ולהסתן את הדגימות עם מדיום הרכבה מתאים.לאחר מכן רכשו תמונות תלת-מימד באמצעות מערכת מיקרוסקופ. 3D רב צבעי DNA דגים מאפשר הדמיה עכשווית של לוקוסים גנומיים שונים בתוך גרעיני 3D משומרים. להכנת בדיקת דנ"א, גודל בדיקה של פחות מ-200 זוגות בסיסים מבטיח הליך מוצלח של DNA FISH צבעוני תלת-צבעי.בדיקות דגים DNA תת אופטימלי המיוצר על ידי תרגום ניק יכול להיות מעוכל באופן חלקי או יתר. מעל בדיקות מתעכלות יגרום אות לא ספציפי עקב אובדן של ספציפיות בהכלאה ועלייה כתוצאה מכך של הרקע. עבור לימפוציטים T ראשוניים אנושיים ותאים קטנים עם גרעינים קטנים כמות נמוכה של ציטופלסמה, 12 דקות 0.1 טיפול חומצה הידרוכלורית נורמלי מומלץ לקדם נגישות גרעינית לבדיקות DNA ולשמור על השלמות הגרעינית.עיכול פפסין ציטופלסמי אינו נחוץ כדי לקבל אות טוב של DNA FISH בתאים קטנים. עבור myoblasts ראשוני אנושי ותאים שיש להם גרעינים גדולים ציטופלסמה בשפע, עם זאת, צעד pepsinization הוא היסוד. פפסיניזציה קצרה ותת-אופטימלית של ציטוסקלטון תעכב את כניסת הגשוש לתוך הגרעינים המסתיימים בהיעדר אות DNA FISH.עם זאת, אם התאים הם over pepsinized, הגרעינים לא יישארו שלמים לאבד את המבנה 3D שלהם. דג דנ"א רב-צבעי תלת-צבעי מוצלח יגרום לנוכחות אות בתוך הגרעינים. אני מציע לעבוד עם חומר ביולוגי טרי, לבדוק בדיקות לפני ביצוע 3D רב צבעי DNA FISH, הכנת פתרונות טריים להיות מדויק עם זמני הדגירה והטמפרטורות.זכור כי formamide ו HCL הם חומרים מסוכנים תמיד יש להשתמש ברדס אדים כימיים עם חומרים חד פעמיים מתאימים.

3d-multicolor-dna-fish-tool-to-study-nuclear-architecture-human

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which specifically binds the pre-mRNA target and an effector domain. Previously, we have taken advantage of the unique RNA binding mode of the PUF domain in human Pumilio 1 to generate a programmable RNA binding scaffold, which was used to engineer various artificial RBPs to manipulate RNA metabolism. Here, a detailed protocol is described to construct Engineered Splicing Factors (ESFs) that are specifically designed to modulate the alternative splicing of target genes. The protocol includes how to design and construct a customized PUF scaffold for a specific RNA target, how to construct an ESF expression plasmid by fusing a designer PUF domain and an effector domain, and how to use ESFs to manipulate the splicing of target genes. In the representative results of this method, we have also described the common assays of ESF activities using splicing reporters, the application of ESF in cultured human cells, and the subsequent effect of splicing changes. By following the detailed protocols in this report, it is possible to design and generate ESFs for the regulation of different types of Alternative Splicing (AS), providing a new strategy to study splicing regulation and the function of different splicing isoforms. Moreover, by fusing different functional domains with a designed PUF domain, researchers can engineer artificial factors that target specific RNAs to manipulate various steps of RNA processing.

This report describes a bioengineering method to design and construct novel Artificial Splicing Factors (ASFs) that specifically modulate the splicing of target genes in mammalian cells. This method can be further expanded to engineer various artificial factors to manipulate other aspects of RNA metabolism.

הנדסה גורמים מלאכותיים כדי לתמרן באופן ספציפי שחבור אלטרנטיבי בתאים אנושיים

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

Immunostaining עבור שינויים DNA: ניתוח חישובית של תמונות קונפוקלי

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible chromatin. In this paper we present an improved ATAC-seq protocol that reduces contaminating mitochondrial DNA reads. While previous ATAC-seq protocols have struggled with an average of 50% contaminating mitochondrial DNA reads, the optimized&#160;lysis buffer introduced in this protocol reduces mitochondrial DNA contamination to an average of 3%. This improved ATAC-seq protocol allows for a near 50% reduction in the sequencing cost. We demonstrate how these high-quality ATAC-seq libraries can be prepared from activated CD4+ lymphocytes, providing step-by-step instructions from CD4+ lymphocyte isolation from whole blood through data analysis. This improved ATAC-seq protocol has been validated in a wide range of cell types and will be of immediate use to researchers studying chromatin accessibility.

Here, we present a protocol to perform an assay for transposase-accessible chromatin sequencing (ATAC-seq) on activated CD4+ human lymphocytes. The protocol has been modified to minimize contaminating mitochondrial DNA reads from 50% to 3% through the introduction of a new lysis buffer.

האטא ק-seq Assay עם זיהום נמוכה דנ א מיטוכונדריאלי של ראשי האדם CD4 + לימפוציטים מסוג T

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

מסכי אחד-היברידית משופרת שמרים לזהות גורם שעתוק מחייב את רצפי דנ א אנושי

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, etc.) of this bacterium have been lacking. A Multi-Locus Variable-number tandem-repeat Analysis (MLVA) assay was therefore developed as an easily accessible and unambiguous tool for high-resolution genotyping of recovered isolates. For the MLVA assay presented here, DNA is extracted from cultured Y. ruckeri samples by boiling bacterial cells in water, followed by use of supernatant as template for PCR. Primer-pairs targeting ten Variable-number tandem-repeat (VNTR) loci, interspersed throughout the Y. ruckeri genome, are distributed equally amongst two five-plex PCR reactions running under identical cycling conditions. Forward primers are labelled with either of three fluorescent dyes. Following amplicon confirmation by gel electrophoresis, PCR products are diluted and subjected to capillary electrophoresis. From the resulting electropherogram profiles, peaks representing each of the VNTR loci are size-called and employed for calculating VNTR repeat counts in silico. Resulting ten-digit MLVA profiles are then&#160;used to generate Minimum spanning trees enabling epizootiological evaluation by cluster analysis. The highly portable output data, in the form of numerical MLVA profiles, can rapidly be compared across labs and placed in a spatiotemporal context. The entire procedure from cultured colony to epizootiological evaluation may be completed for up to 48 Y. ruckeri isolates within a single working day.

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

The Multi-Locus Variable-number tandem-repeat Analysis (MLVA) assay presented here enables inexpensive, robust and portable high-resolution genotyping of the fish-pathogenic bacterium Yersinia ruckeri. Starting from pure cultures, the assay employs multiplex PCR and capillary electrophoresis to produce ten-loci MLVA profiles for downstream applications.

משתנה רב-לוקוס-ניתוח חוזר של מספר מחזור של הדג -חיידק הפתוגניים באמצעות מולטיפלקס ואלקטרופורזה קפיסימית

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is pathogenic, one must query many databases to determine whether the gene of interest is linked to a genetic disease, whether the specific variant has been reported before, and what functional data is available in model organism databases that may provide clues about the gene&#8217;s function in human. MARRVEL (Model organism Aggregated Resources for Rare Variant ExpLoration) is a one-stop data collection tool for human genes and variants and their orthologous genes in seven model organisms including in mouse, rat, zebrafish, fruit fly, nematode worm, fission yeast, and budding yeast. In this Protocol, we provide an overview of what MARRVEL can be used for and discuss how different datasets can be used to assess whether a variant of unknown significance (VUS) in a known disease-causing gene or a variant in a gene of uncertain significance (GUS) may be pathogenic. This protocol will guide a user through searching multiple human databases simultaneously starting with a human gene with or without a variant of interest. We also discuss how to utilize data from OMIM, ExAC/gnomAD, ClinVar, Geno2MP, DGV and DECHIPHER. Moreover, we illustrate how to interpret a list of ortholog candidate genes, expression patterns, and GO terms in model organisms associated with each human gene. Furthermore, we discuss the value protein structural domain annotations provided and explain how to use the multiple species protein alignment feature to assess whether a variant of interest affects an evolutionarily conserved domain or amino acid. Finally, we will discuss three different use-cases of this website. MARRVEL is an easily accessible open access website designed for both clinical and basic researchers and serves as a starting point to design experiments for functional studies.

Here, we present a protocol to access and analyze many human and model organism databases efficiently. This protocol demonstrates the use of MARRVEL to analyze candidate disease-causing variants identified from next-generation sequencing efforts.

ניווט MARRVEL, כלי מבוסס אינטרנט המשלבת גנומיקה האנושית ומודל האורגניזם גנטיקה מידע

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

במחקר פונקציונלי Vivo של מחלות-הקשורים משתנים אנושיים נדירים באמצעות Drosophila ילה

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported for in vitro differentiation of keratinocytes cultured in two-dimensional (2D) submerged manners using various induction conditions. Described here is a procedure for 2D in vitro keratinocyte differentiation method by contact inhibition and subsequent molecular characterization by RNA-seq. In brief, keratinocytes are grown in defined keratinocyte medium supplemented with growth factors until they are fully confluent. Differentiation is induced by close contacts between the keratinocytes and further stimulated by excluding growth factors in the medium. Using RNA-seq analyses, it is shown that both 1) differentiated keratinocytes exhibit distinct molecular signatures during differentiation and 2) the dynamic gene expression pattern largely resembles cells during epidermal stratification. As for comparison to normal keratinocyte differentiation, keratinocytes carrying mutations of the transcription factor p63 exhibit altered morphology and molecular signatures, consistent with their differentiation defects. In conclusion, this protocol details the steps for 2D in vitro keratinocyte differentiation and its molecular characterization, with an emphasis on bioinformatic analysis of RNA-seq data. Because RNA extraction and RNA-seq procedures have been well-documented, it is not the focus of this protocol. The experimental procedure of in vitro keratinocyte differentiation and bioinformatic analysis pipeline can be used to study molecular events during epidermal differentiation in healthy and diseased keratinocytes.

Presented here is a stepwise procedure for in vitro differentiation of human primary keratinocytes by contact inhibition followed by characterization at the molecular level by RNA-seq analysis.

אפיון של בידול במבחנה של Keratinocytes האדם העיקרי על ידי ניתוח RNA-Seq

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...