Name: 3d multicolor dna fish tool to study nuclear architecture in human primary cells
Uploaded: 2020-01-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells at JoVE.com

Gli autori riconoscono l'assistenza tecnica dello strumento di imaging INGM (Istituto Nazionale di Genetica", "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM), Milano, Italia), in particolare C. Cordiglieri, per assistenza nell'arte 3D multicolore DNA FISH Acquisizione. Questo lavoro è stato sostenuto dalle seguenti sovvenzioni a B.B.: programma di punta italiano EPIGEN, Associazione Francese contre les Myopathies (AFM-Telethon, grant nr 18754) e GiovaniI, Ministero della Sanità Italiano (GR-2011-02349383). Questo lavoro è stato sostenuto dalla seguente sovvenzione a F.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321).

1. Procedure di preparazione ed etichettatura della sonda del DNA con traduzione nick
<ol><li>Purificare e pulire i cromosomi artificiali batterici (BAC), plasmidi o prodotti PCR con kit specifici (Tabella dei materiali), risospendere in ddH2O, controllare per elettroforesi su un gel di agarose e quantificare.</li>
	<li>Eseguire la traslazione del nick su 1,5,5 g di DNA dal punto 1,1 in un volume finale di 50 gradi, mescolando tutti i reagenti in un tubo DNA a bassa legatura di 0,5 mL second...

<ol>
	<li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+territories,+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells.">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture.">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li><li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+3D+genome.">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).</li><li>van Steensel, B., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+transcription+in+shaping+the+spatial+organization+of+the+genome.">The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).</li><li>Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+genome+organization+and+cognition.">Spatial genome organization and cognition.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).</li><li>Pombo, A., Dillon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+genome+architecture:+players+and+mechanisms.">Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).</li><li>Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+contact+permits+transcription+between+coregulated+genes.">Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes.</a> Cell. 155 (3), 606-620 (2013).</li><li>Therizols, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+decondensation+is+sufficient+to+alter+nuclear+organization+in+embryonic+stem+cells.">Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells.</a> Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).</li><li>Gonzalez-Sandoval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinuclear+Anchoring+of+H3K9-Methylated+Chromatin+Stabilizes+Induced+Cell+Fate+in+C.+elegans+Embryos.">Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos.</a> Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).</li><li>Hubner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+nuclear+landscapes+during+human+myelopoietic+cell+differentiation+maintains+co-aligned+active+and+inactive+nuclear+compartments.">Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).</li><li>Aymard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+long-range+contacts+unveils+clustering+of+DNA+double-strand+breaks+at+damaged+active+genes.">Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).</li><li>Sellou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poly(ADP-ribose)-dependent+chromatin+remodeler+Alc1+induces+local+chromatin+relaxation+upon+DNA+damage.">The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).</li><li>Krijger, P. H., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome.">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).</li><li>Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+TADs:+How+Alterations+of+Chromatin+Domains+Result+in+Disease.">Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease.</a> Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).</li><li>Cortesi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4q-D4Z4+chromatin+architecture+regulates+the+transcription+of+muscle+atrophic+genes+in+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy.">4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy.</a> Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).</li><li>Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+and+divergence+of+regulatory+strategies+at+Hox+Loci+and+the+origin+of+tetrapod+digits.">Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits.</a> PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).</li><li>Woltering, J. M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrapod+axial+evolution+and+developmental+constraints;+Empirical+underpinning+by+a+mouse+model.">Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model.</a> Mechanisms of Development. 138, 64-72 (2015).</li><li>de Laat, W., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3C-based+technologies+to+study+the+shape+of+the+genome.">3C-based technologies to study the shape of the genome.</a> Methods. 58 (3), 189-191 (2012).</li><li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+decade+of+3C+technologies:+detailed+insights+into+nuclear+organization.">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes &amp; Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li><li>Finn, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Heterogeneity+and+Intrinsic+Variation+in+Spatial+Genome+Organization.">Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization.</a> Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).</li><li>Zheng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+chromatin+interactions+with+single-molecule+precision.">Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision.</a> Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).</li><li>Solovei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+on+tissue+cryosections.">Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).</li><li>Cremer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+3D+fluorescence+in+situ+hybridization+for+imaging+interphase+chromosomes.">Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+three-dimensional+localization+microscopy+across+large+volumes.">High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes.</a> Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).</li><li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT.">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+genomic+loci+in+living+human+cells+by+an+optimized+CRISPR/Cas+system.">Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system.</a> Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).</li><li>Nelles, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+RNA+Tracking+in+Live+Cells+with+CRISPR/Cas9.">Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9.</a> Cell. 165 (2), 488-496 (2016).</li><li>Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifaceted+FISH+approach+to+study+endogenous+RNAs+and+DNAs+in+native+nuclear+and+cell+structures.">A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures.</a> Current Protocol of Human Genetics. , 15 (2013).</li><li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).</li><li>Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+nuclear+positioning+of+the+monoallelically+expressed+astrocyte+marker+GFAP.">Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP.</a> Genes &amp; Development. 22 (4), 489-498 (2008).</li><li>Kraus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+structured+illumination+microscopy+of+nuclear+structures.">Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures.</a> Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).</li><li>Solovei, I., Cremer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-FISH+on+cultured+cells+combined+with+immunostaining.">3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).</li><li>Skinner, B. M., Johnson, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+morphologies:+their+diversity+and+functional+relevance.">Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance.</a> Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).</li><li>Schoenfelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pluripotent+regulatory+circuitry+connecting+promoters+to+their+long-range+interacting+elements.">The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements.</a> Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).</li><li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling.">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).</li><li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+super-resolution+imaging+of+chromosomes+and+in+situ+haplotype+visualization+using+Oligopaint+FISH+probes.">Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes.</a> Nature Communication. 6, 7147 (2015).</li><li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+design+and+synthesis+platform+for+visualizing+genomes+with+Oligopaint+FISH+probes.">Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).</li><li>Samacoits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+framework+to+study+sub-cellular+RNA+localization.">A computational framework to study sub-cellular RNA localization.</a> Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).</li><li>Cardozo Gizzi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy-Based+Chromosome+Conformation+Capture+Enables+Simultaneous+Visualization+of+Genome+Organization+and+Transcription+in+Intact+Organisms.">Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms.</a> Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).</li><li>Mateo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+DNA+folding+and+RNA+in+embryos+at+single-cell+resolution.">Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution.</a> Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).</li><li>Nir, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Walking+along+chromosomes+with+super-resolution+imaging,+contact+maps,+and+integrative+modeling.">Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling.</a> PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).</li><li>Bintu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+chromatin+tracing+reveals+domains+and+cooperative+interactions+in+single+cells.">Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li></ol>

Il metodo attuale descrive un protocollo passo dopo passo per eseguire DNA FISH multicolore 3D su una vasta gamma di cellule primarie umane. Anche se DNA FISH è una tecnologia di ampio uso, 3D multicolore DNA FISH su nuclei interfase 3D conservati è ancora difficile da eseguire in molti laboratori, principalmente a causa delle caratteristiche dei campioni utilizzati23,24.
La traduzione di nick probe è un passo fondamentale per il su...

Gli eucarioti più alti devono condensare e compattare sistematicamente un'enorme quantità di informazioni genetiche nel minuto spazio 3D del nucleo1,2,3,4. Oggi sappiamo che il genoma è spazialmente ordinato in compartimenti e domini topologicamente associati5 e che i molteplici livelli di riduzione del DNA generano contatti tra diverse regioni genomiche che possono comportare la formazione di loop della cromatina6,7. Il loop dinamico 3D della cromatina può influenzare molti processi biologici diversi come la trascrizione8,9, la differenziazione e lo sviluppo10,11, riparazione del DNA12,13, mentre le sue perturbazioni sono coinvolte in varie malattie14,15,16 e difetti dello sviluppo15,17,18.
Molti approcci sono stati sviluppati per studiare l'organizzazione del genoma 3D. Tecnologie basate sulla conformazione cromosomica (tecnologie C, 3C, 4C, 5C, Hi-C e derivati) sono state sviluppate per studiare l'organizzazione del genoma nelle cellule fisse3,4,19,20. Tali approcci si basano sulla capacità di catturare le frequenze di contatto tra loci genomici in prossimità fisica. Le tecnologie C, a seconda della loro complessità, catturano l'organizzazione globale del genoma 3D e la topologia nucleare di una popolazione cellulare3,4,19,20. Tuttavia, le interazioni 3D sono dinamiche nel tempo e nello spazio, altamente variabili tra singole cellule costituite da interazioni multiplex, e sono ampiamente eterogenee21,22.
La fluorescenza 3D multicolore del DNA nell'ibridazione situ (FISH) è una tecnica che consente la visualizzazione di loci genomici specifici a livello di singola cellula, consentendo lo studio diretto dell'architettura nucleare 3D in modo complementare alle tecnologie C. Rappresenta una tecnologia attualmente utilizzata per convalidare in modo inequivocabile i risultati C. IL DNA FISH multicolore 3D utilizza sonde etichettate fluorescentmente complementari ai loci genomici di interessi. L'uso di diversi fluorofori e attrezzature di microscopia idonee consentono la visualizzazione contemporanea di più obiettivi all'interno dello spazio nucleare23,24. Negli ultimi anni, FISH è stato combinato con i progressi tecnologici nella microscopia per ottenere la visualizzazione di strutture su scala fine ad alta risoluzione25,26 o con approcci CRISPR-Cas per la visualizzazione degli acidi nucleici nell'imaging dal vivo27,28. Nonostante l'ampia adozione, l'approccio 3D multicolore DNA FISH è ancora considerato difficile in molti laboratori perché il materiale biologico utilizzato deve essere adattato.
Qui, forniamo un protocollo completo per il DNA FISH multicolore 3D (dalla preparazione di cellule/sonde all'analisi dei dati) applicabile a un'ampia gamma di cellule primarie umane, consentendo la visualizzazione di più loci genomici e preservando la struttura 3D dei nuclei. Per studiare l'architettura nucleare, la struttura 3D dei nuclei deve essere preservata. Per questo motivo, a differenza di altri protocolli esistenti29,30,31, evitiamo l'uso di un gradiente di alcol e lo stoccaggio dei copricapi nell'alcool che possono influenzare la struttura della cromatina32. Il metodo è adattato dai protocolli 3D DNA FISH conservati24,33 da applicare a una vasta gamma di cellule primarie umane, sia isolate ex vivo che coltivate in vitro. Ci sono parametri di permeabilizzazione e deproteinizzazione per diverse morfologia nucleare e caratteristiche citologiche (ad esempio, diversi gradi di compattazione nucleare, abbondanza di citoscheletri)34. Questi parametri sono spesso generalmente descritti in altri protocolli24,33, senza fornire una chiara discriminazione della procedura all'interno di diversi tipi di cellule. Inoltre, abbiamo sviluppato uno strumento specifico chiamato NuCLsD (localizzatore di contatti nucleari in 3D)16, fornendo principi per l'analisi dei dati che miglioreranno la vicinanza 3D tra diversi loci e la loro distribuzione topologica nucleare all'interno dello spazio nucleare in modo automatizzato.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin 488</td>
			<td>DBA</td>
			<td>DI7488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin 11 d-UTP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverlsips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>117500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CY3 d-UTP</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA53022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate (powder)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-203917A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin 11 d-UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093088910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21969-035 500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18010-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AMPD1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (C-G-A-T)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>BL0423A/C/G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644.2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Hyclone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutammine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15279-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278-5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennycillin/Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070-063 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>P6887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhasePrep BAC DNA Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NA0100-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Gel Extraction &#38; PCR Purification Combo Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K220001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubbercement</td>
			<td>Bostik</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidina Alexa fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S21374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1110379026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d multicolor dna fish tool to study nuclear architecture in human primary cells

Una delle principali domande nella biologia cellulare è l'organizzazione genomica all'interno dello spazio nucleare e come l'architettura della cromatina possa influenzare processi come l'espressione genica, l'identità cellulare e la differenziazione. Molti approcci sviluppati per studiare l'architettura 3D del genoma possono essere suddivisi in due categorie complementari: tecnologie basate sulla cattura della conformazione cromosomica (tecnologie C) e imaging. Mentre il primo si basa sulla cattura della conformazione cromosomica e delle interazioni del DNA prossimale in una popolazione di cellule fisse, la seconda, basata sulla fluorescenza del DNA nell'ibridazione situ (FISH) su nuclei conservati in 3D, consente la visualizzazione contemporanea più loci a livello di singola cellula (multicolore), esaminando le loro interazioni e la distribuzione all'interno del nucleo (3D DNA multicolore FISH). La tecnica del DNA FISH multicolore 3D ha una limitazione di visualizzare solo pochi loci predeterminati, non permettendo un'analisi completa dell'architettura nucleare. Tuttavia, data la robustezza dei suoi risultati, 3D DNA FISH multicolore in combinazione con 3D-microscopia e ricostruzione dell'immagine è un possibile metodo per convalidare i risultati basati sulla tecnologia C e per studiare in modo inequivocabile la posizione e l'organizzazione di loci specifici a livello di singola cellula. Qui, proponiamo un metodo passo dopo passo di 3D multicolore DNA FISH adatto per una vasta gamma di cellule primarie umane e discutere tutte le azioni pratiche, passaggi cruciali, nozioni di imaging 3D e analisi dei dati necessari per ottenere un multicolore 3D di successo e informativo DNA FISH all'interno di diversi contesti biologici.

Il metodo del DNA FISH multicolore 3D descritto in questo articolo consente la visualizzazione contemporanea di diversi loci genomici all'interno dei nuclei 3D conservati (Figura 1B). Questo protocollo consente la misurazione delle distanze tra gli alleli e dei diversi loci genomici per valutarne la vicinanza spaziale e per valutarne la posizione all'interno dello spazio nucleare (ad esempio, la distanza loci dal centroide o dalla periferia dei nuclei)16</s...

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3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

IL DNA FISH multicolore 3D rappresenta uno strumento per visualizzare più loci genomici all'interno dei nuclei 3D conservati, definendo inequivocabilmente le loro interazioni reciproche e la localizzazione all'interno dello spazio nucleare a livello di singola cellula. Qui, un protocollo passo dopo passo è descritto per un ampio spettro di cellule primarie umane.

3D Multicolor DNA FISH Tool per studiare l'architettura nucleare nelle cellule primarie umane

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...

3D multicolor DNA FISH consente la visualizzazione di più loci genomici all'interno di nuclei conservati per definire in modo ambiguo la loro interazione reciproca e localizzazione a livello di singola cellula. 3D multicolor DNA FISH consente lo studio diretto dell'architettura nucleare. In generale, funziona in combinazione con tecnologie basate sulla cattura cromosoma rendendo la tecnica uno strumento disponibile per la convalida dei dati C all'interno di singole cellule.A dimostrare la procedura sarà Federica Marasca. È un postdoc nel mio laboratorio. Inizia incubando il mix di traduzione nick in un miscelatore termico a 16 gradi Celsius in base alla lunghezza del materiale del DNA iniziale.Al termine dell'incubazione, controllare le dimensioni delle sonde su un gel di agarosio al 2,2%. Per ogni esperimento DNA FISH, precipitare la quantità appropriata di sonda in base al materiale del DNA di partenza da cui sono state prodotte le sonde in 150 microlitri di acqua distillata doppia, 20 microgrammi di DNA di sperma di salmone non etichettato, 3,5 microgrammi di DNA Cot-1 specifico per specie, tre volumi di etanolo al 100% e un 1/10° volume di tre acetati di sodio molare per un'ora a meno 80 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, centrifugare il campione alla massima velocità per un'ora a quattro gradi Celsius.Dopo aver scartato il supernatante, lavare il pellet due volte con 500 microlitri di 70%etanolo. Dopo il secondo lavaggio, rimescolare il pellet in due microlitri di formamide al 100% e agitare la sonda per 30 minuti a 40 gradi Celsius prima di aggiungere un volume uguale di citrato di sodio salino 4X nel solfato di dextran al 20%. Per il pretrattamento di fissazione e la permeabilizzazione di piccole cellule con piccoli nuclei e una bassa quantità di citoplasma, aggiungere prima due volte 10 alla sesta cellula in 200 microlitri di PBS direttamente su coverlips di vetro in singoli pozzi di una piastra da 24 porri e lasciare che le cellule si sistemino per 30 minuti a temperatura ambiente.Al termine dell'incubazione, sostituire rapidamente il PBS con 300 microlitri di paraformaldeide appena preparata integrata con 0,1% Tween 20. Dopo 10 minuti, lavare le celle fisse tre volte in 300 microlitri dello 0,05%TPBS per cinque minuti per lavaggio a temperatura ambiente. Dopo l'ultimo lavaggio, permeabilizzare le cellule T con 300 microlitri dello 0,5%TPBS per 10 minuti a temperatura ambiente prima di trattare le cellule con 250 microlitri per pozzo di cocktail RNAse diluito 1:100 in PBS per un'ora a 37 gradi Celsius.Al termine dell'incubazione, sciacquare le cellule in 300 microlitri di PBS e aggiungere 300 microlitri di glicerolo al 20% in PBS a ciascun pozzo con un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. La mattina seguente, posizionare il bicchiere sul ghiaccio secco per 15-30 secondi per congelare le cellule prima di scongelare gradualmente i campioni a temperatura ambiente e immergerli in 300 microlitri di 20%glicerolo in PBS per 30 secondi. Dopo aver congelato/scongelato le cellule altre tre volte come appena dimostrato, lavare i campioni in 300 microlitri dello 0,5%TPBS per cinque minuti a temperatura ambiente, seguiti da due lavaggi in 300 microlitri dello 0,05%TPBS per cinque minuti per lavaggio a temperatura ambiente.Dopo l'ultimo lavaggio, trattare le cellule con 300 microlitri di acido cloridrico normale 0,1 per 12 minuti a temperatura ambiente, seguiti da due risciacqui in 300 microlitri di citrato di sodio salino. Quindi fissare i campioni durante la notte in 300 microlitri di 50% formamide in citrato di sodio salino 2X a temperatura ambiente. Per la fissazione, il pretrattamento e la permeabilizzazione di grandi cellule con un'elevata quantità di citoplasma, fissare, pretrattare e permeabilizzare le cellule in modo simile a quanto dimostrato per le cellule T primarie umane e trattare i campioni con 300 microlitri dello 0,0025%pepsina in 0,01 normale acido cloridrico per alcuni secondi fino a cinque minuti.Osservare le cellule al microscopio ottico e interrompere la reazione con due lavaggi di cinque minuti in 300 microlitri di cloruro di magnesio millimolare non appena i nuclei sono liberi dal citoplasma ma i nucleoli sono ancora visibili e intatti. Per il DNA FISH multicolore 3D, denaturare le sonde di ibridazione a 80 gradi Celsius per cinque minuti e posizionare immediatamente le sonde sul ghiaccio. Caricare le sonde su uno scivolo al microscopio pulito e posizionare un coverslip di celle su ogni goccia di sonda.Sigillare i bordi delle coperture con cemento di gomma. Quando il cemento si è asciugato completamente, denaturare i campioni su un blocco riscaldante di 75 gradi Celsius. Dopo quattro minuti, idrizzare i campioni a 37 gradi Celsius durante la notte in una scatola metallica che galleggia in un bagno d'acqua.La mattina dopo, staccare il cemento di gomma e con gli scivoli immersi in citrato di sodio salino 2X sollevare con cura le copertine. Posizionare ogni coverlip in singoli pozzi di una piastra a sei pozzetti contenente due millilitri di citrato di sodio salino fresco per pozzo per due lavaggi di cinque minuti a 37 gradi Celsius con scuotimento a 90 giri al minuto. Al termine dell'incubazione, sciacquare brevemente le copertine in due millilitri dello 0,2% Tween 20 in citrato di sodio salino 4X.Per il rilevamento 3D di DNA FISH multicolore, trasferire le coverlips in singoli pozzi di una nuova piastra da 24 porri e bloccare qualsiasi legame non specifico in 300 microlitri di tampone di blocco per 20 minuti a 37 gradi Celsius e 20 giri al minuto. Al termine dell'incubazione, trattare i campioni con l'appropriata concentrazione di anti-digoxigenina e/o streptavidina diluita in tampone di blocco per 35 minuti in una camera scura e umida a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, trasferire i campioni su singoli pozzi di una piastra a sei poggiagli e lavare i campioni tre volte in due millilitri dello 0,2% Tween 20 e 4X citrato di sodio salino per cinque minuti per lavaggio con scuotimento a 90 giri al minuto.Dopo l'ultimo lavaggio, equilibrare i campioni in due millilitri di PBS prima di trasferire le coverlips su una nuova piastra da 24 porri per il post-fissaggio in 300 microlitri di formaldeide al 2% in PBS per pozzo per due minuti a temperatura ambiente. Lavare le cellule fisse cinque volte brevemente in 300 microlitri di PBS, seguiti dalla colorazione con DAPI diluita a un nanogrammo per millilitro in 300 microlitri di PBS per cinque minuti a temperatura ambiente. Lavare le coverlips altre cinque volte in PBS e montare i campioni con un mezzo di montaggio appropriato.Quindi acquisire immagini 3D con un sistema di microscopio. 3D multicolor DNA FISH consente la visualizzazione contemporanea di diversi loci genomici all'interno di nuclei 3D conservati. Per la preparazione della sonda DEL DNA, una dimensione della sonda inferiore a 200 coppie di basi garantisce una procedura DNA FISH multicolore 3D di successo.Le sonde SUBOPTIMAL DNA FISH prodotte dalla traduzione nick possono essere parzialmente o sovradigerite. Le sonde sovra digerite si tradurranno in un segnale non specifico a causa di una perdita di specificità nell'ibridazione e di un conseguente aumento dello sfondo. Per i linfociti T primari umani e le piccole cellule con piccoli nuclei e una bassa quantità di citoplasma, si raccomanda un normale trattamento con acido cloridrico di 12 minuti 0,1 per promuovere l'accessibilità dei nuclei alle sonde del DNA e preservare l'integrità nucleare.La digestione della pepsina citoplasmatica non è necessaria per ottenere un segnale di DNA FISH nelle piccole cellule. Per i mioblasti e le cellule primarie umane che hanno grandi nuclei e abbondante citoplasma, tuttavia, la fase di pepsinizzazione è fondamentale. Una pepsinizzazione del citoscheletro breve e non ottimale ostacolerà l'ingresso della sonda nei nuclei terminando in assenza di un segnale FISH di DNA.Tuttavia, se le cellule sono sovranenizzate, i nuclei non rimarranno intatti perdendo la loro struttura 3D. Un DNA FISH multicolore 3D di successo si tradurrà nella presenza di segnale all'interno dei nuclei. Suggerisco di lavorare con materiale biologico fresco, testare sonde prima di eseguire il DNA FISH multicolore 3D, preparare soluzioni fresche ed essere precisi con i tempi di incubazione e le temperature.Ricorda che la formamide e l'HCL sono sostanze pericolose e devono sempre essere utilizzate in una cappa aspirante chimica con materiali monouso appropriati.

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Misura parallela di circadiano Clock espressione genica e la secrezione dell&#39;ormone in colture cellulari primarie umane

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Ricerca

Genetica

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Ingegneria fattori artificiali per manipolare in modo specifico l&#39;alternanza di splicing nelle cellule umane

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining per modificazioni del DNA: analisi computazionale delle immagini Confocal

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq analisi con DNA mitocondriale bassa contaminazione da primaria umana CD4 + linfociti T

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Schermi di monoibrido lievito avanzata per identificare il fattore di trascrizione associazione a sequenze di DNA umano

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

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Multi-locus Numero variabile Tandem-ripetizione Analisi del batterio patogeno del pesce Yersinia ruckeri di Multiplex PCR e elettroforesi capillare

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

Navigazione MARRVEL, uno strumento basato sul Web che integra la genomica umana e le informazioni di genetica degli organismi modello

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

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Studio funzionale in vivo sulle varianti umane rare associate alla malattia utilizzando la Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Caratterizzazione della differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani mediante analisi RNA-Seq

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...