Afklaring og Imaging Candida albicans Biofilms

Candida albicans biofilm som mange biologiske prøver er stærkt gennemskinnelige til uigennemsigtig i deres hjemland. I disse protokoller viser vi, at ved hjælp af afklaringsmetoder kan den interne struktur af faste intakte biofilm afbildes ved optisk sektionsmikroskopi. Med enkle, billige og relativt hurtige behandlingstrin kan faste intakte biofilm gøres gennemsigtige for 3D-billedbehandling ved konfokal scanning af fluorescensmikroskopi.

Demonstrere denne procedure i dag vil være Katie Lagree, en post-ph.d.-forsker her, og mig selv. For at begynde biofilm vækst i en 12-brønd plade, forberede pladen som beskrevet i tekstprotokollen. Placer pladen på en 60 RPM orbital mixer i en befugtet 37 grader Celsius luft inkubator i 90 minutter for at give tid til celle vedhæftning.

Efter 90 minutter fjernes de mellemstore og ikke-tilknyttede celler og vaskes med sterilt medium eller PBS. Den podede substrata overføres til en anden multi-brøndplade, der indeholder forvarmt glødetrådningsmedium. Returner pladen til 37 grader Celsius befugtet omgivende luft inkubator og vokse biofilm op til 48 timer med 60 RPM orbital blanding for beluftning.

Hent 48-timers pladen fra inkubatoren, og fjern kulturmediet fra hver prøve. Udskift mediet med PBS og inkuber i flere minutter for at fortynde serumproteiner væk. Når PBS er fjernet, fyldes brøndene med fiksativ.

Der tilsættes tilstrækkelig fiksativ volumen til hver skål til at nedsænke al biofilmvækst, herunder på de indre sider af skålen. Indstil den overdækkede skål på en langsom orbital mixer i 20 minutter. Når fikseringseativen er fjernet som beskrevet i tekstprotokollen, forberedes farvning ved at dræne PBS og hurtigt fylde brøndene op med en opløsning, der indeholder PBS og den nødvendige plet.

Biofilmen må ikke løbe af i mere end nogle få sekunder. Tilsæt pletten til fadet. Den nødvendige mængde plet afhænger af biofilmmassen.

Sæt derefter den overdækkede skål på en langsom orbital mixer natten over og beskytte mod lys med folie eller et stykke sort papir. Ved hjælp af pincet overføres den faste farvede biofilm fra PBS til fem milliliter 50/50 PBS-methanol i et 20 milliliterglas med biofilmen opad. Bland manuelt med orbital bevægelse med et minuts mellemrum i fem minutter.

Fjern opløsningsmidlet til en affaldsflaske, der er forsigtig for at undgå kontakt mellem pipetten og biofilmen eller biofilmen og hætteglasset. Genopfyld forsigtigt med tre milliliter pæn methanol. Bland manuelt med orbital bevægelse med et minuts mellemrum i tre minutter.

Fjern nu opløsningsmidlet til en affaldsflaske og fyld straks op med fem milliliter methanol. Efter manuel blanding med orbital bevægelse med et minuts mellemrum i fem til 10 minutter, skal du fjerne opløsningsmidlet til affaldsflasken. Straks genopfyldes med tre milliliter methanol.

Biofilm ser ofte mere uigennemsigtige ud på dette tidspunkt end deres oprindelige udseende. Opløsningsmidlet fjernes på affaldsflasken, og hætteglasset skal straks fyldes op med fem milliliter 50/50 methanol-methylsalicylat. Bland manuelt med orbital bevægelse med et minuts mellemrum i fem til 10 minutter.

Biofilmen skal være halvgennemsigtig i dette blandede opløsningsmiddel. Efter fjernelse af opløsningsmidlet til en affaldsflaske genopfyldes hætteglasset forsigtigt med tre milliliter pænt methylsalicylat. Bland manuelt med orbital bevægelse med et minuts mellemrum i tre minutter.

Gentag processen igen med fem milliliter pænt methylsalicylat, der blandes manuelt med et minuts mellemrum i fem til 10 minutter. På dette tidspunkt bør biofilmen være gennemsigtig. Opløsningsmidlet fjernes på affaldsflasken, og hætteglasset skal straks fyldes op med tre milliliter pænt methylsalicylat.

Den forarbejdede biofilm er stabil i dette opløsningsmiddel. Hvis du bruger et omvendt mikroskop, skal du bruge en opløsningsmiddelfast skål, der har en dækglasbund, og klargør afstandsbemateriale til støtte for den omvendte prøve. Her, afstandsstillere er 13 millimeter silikone ringe, der er pre-gennemblødt i methyl salicylate i en time for at minimere fokus drift på grund af hævelse.

For en biofilm på en medicinsk kvalitet silikone firkant, invertere pladsen og sæt den på en spacer i en pulje af methyl salicylate i fadet. Sørg for at undgå bobler under prøven. Monter skålen fast på mikroskopets scene og gør olien nedsænket i kontakt med målet.

Juster mængden af methylsalicylat i skålen, så menisken holder prøven fast nede på afstandsanfaldet ved overfladespænding. Placer en dråbe methylsalicylate oven på det omvendte firkantede substrat for at reducere lyssp scatter fra den matte finish. Derefter dække fadet med en glasplade for at begrænse fordampning.

Vent flere minutter, før prøven sætter sig fast på afstandserne, før der aflægges. Nu udføre konfokale mikroskopi til billede prøven som beskrevet i tekstprotokollen. Hvis du vil behandle billederne, skal du åbne ImageJ eller Fiji.

Kontroller, at programmet har tilstrækkelig tildelt hukommelse til, at dataene kan behandles. Behandling af et to gigabyte-datasæt kræver mindst otte GIGABYTE dedikeret RAM for at fungere problemfrit. Åbn den serieplans billedfil, der skal behandles.

Hvis computeren ikke har tilstrækkelig RAM til at behandle hele stakken, kan substacks behandles og derefter samles igen i en enkelt stak. Konverter dataene til 32-bit format for at aktivere aritmetiske handlinger med flydende tal ved hjælp af billedmenu, type, 32-bit. Dette vil fordoble filstørrelsen.

Træk den glatte baggrund for at øge kontrasten af in-focus-funktioner. Betyr hele stakken ved at navigere til procesmenuen og trække baggrunden fra. Juster om nødvendigt den rullende kugleradius.

Kugleradiussen skal være betydeligt større end den største dimension af de fokusfunktioner, der skal bevares. Hvis du vil indstille alle negative pixel til nul, skal du føje hvert billede til dets absolutte værdi. Først skal dublere stakken ved hjælp af billedmenu, dublere, dublere stak.

Tag derefter den absolutte værdi af de duplikerede data ved hjælp af procesmenu, matematik, absolut værdi. Tilføj de to stakke ved at navigere til processen menu, billede regnemaskine, tilføje. For aksialt resilicere billedet stak, skal du bruge billedmenuen, stakke, reslice.

Vælg derefter outputafstand 1.0, start øverst og undgå interpolation. Fokusaksen er nu den lodrette akse i stakken. Y-dimensionen for den reslicerede stak er lig med antallet af fokusplaner.

Hvis du vil lave en sidevisningsprojektion af en eller alle af stakken, skal du navigere til billedmenuen, stakke, Z-projektet. Indstil startudsnittet, og stop udsnitt til at omfatte nogle af eller alle sidevisningsplaner. Vælg max intensitet for at opnå de bedste resultater.

Ret den aksiale skalering af sidevisningsprojektionen ved at navigere til billedmenuen, skaler. Projektionen skal korrigeres for den ulige billedplan pixelering og fokus forøgelse ved hjælp af aksial skalafaktor. Indstil X-skalaen til én, og indstil Y-skalaen til den aksiale skalafaktor.

Vælg bi-kubisk interpolation. Vælg opret nyt vindue. Juster lysstyrke og kontrast.

Konverter derefter til otte-bit format til visning. Du kan også anvende en farveopslagstabel og gemme som RGB- eller otte-bit farve. Ved hjælp af serielt miscible opløsningsmidler af stigende brydningsindeks, kan det maksimale i klarhed hurtigt estimeres.

Dette er raffineret ved konventionel fase kontrast mikroskopi for at finde det punkt, minimum kontrast. En biofilm blev serielt udvekslet mellem xylen og et smalt sæt referencevæsker i dette område. Efter hver udveksling, blev det samme felt flyttet og set gennem et dækglas.

Med stigende indeks ses kontrastvending først, når n er lig med 1,530 for cellevæggen, efterfulgt af cytoplasma, når n er lig med 1,535. Dyb billeddannelse af mutant og vilde type C.albicans biofilm er vist her. Den vilde type biofilm voksede til en tykkelse på 502 mikron som det ses i sidevisning projektion af 538 plan konfokale billede stak.

Aksiale fremskrivninger fra spids til base viser variationen i celletyper og forskellige lag af biofilmen. Dette eksempel viser karakteristiske vilde type struktur. Den mutante biofilm voksede til en tykkelse på 500 mikron, som det ses i sidevisningsprojektionen af 556 planbilledets stak.

Denne mutant kendt for at gennemgå filamentous vækst i mangel af inducerende stressfaktorer produceret en dramatisk anderledes arkitektur. Som det ses i både sidevisning og aksiale fremskrivninger, mange forgrening celler giver anledning til radiale udvækster. Dette er en høj brydningsindeks dyb billeddannelse protokol.

Ideelt set bør brydningsindekset for prøven og brydningsindekset for nedsænkningsolien matche. Derfor bruger vi i dette tilfælde et mål for nedsænkning af olie. De fleste af vores undersøgelser har været strukturel billeddannelse af biofilm ved hjælp af cellevæg markører, men enhver fluorescens metode, der anvendes med faste prøver bør arbejde, herunder immunfluorescens, fluorescens in situ hybridisering, og reporter genekspression.

Denne særlige organisme, Candida albicans, er commensal hos raske mennesker, men er også en opportunistisk patogen, der kan forårsage slimhinde eller systemiske gær infektioner. På nogle institutioner er der behov for BSL II-indeslutningsmetoder og -protokoller. Derudover er formaldehyd og glutaraldehydfidefiksativer flygtige og farlige.

De er kendte kræftfremkaldende stoffer. Der foretages fortyndinger af fikse midler i en røghætte. Opvaskemiddel, der indeholder fortyndede fiksativer, er dækket, og læg ikke beholdere, der indeholder disse fiksativer, i et biosikkerhedsskab eller i en cellekulturkubvøse.