स्पष्ट और इमेजिंग कैंडिडा एल्बिकान बायोफिल्म्स

कई जैविक नमूनों की तरह कैंडिडा एल्बिकान बायोफिल्म्स अपने मूल राज्य में अपारदर्शी के लिए भारी पारदर्शी हैं। इन प्रोटोकॉल में, हम बताते हैं कि स्पष्टीकरण विधियों का उपयोग करके, फिक्स्ड अक्षुण्ण बायोफिल्म्स की आंतरिक संरचना को ऑप्टिकल सेक्शनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेज किया जा सकता है। सरल, सस्ती और अपेक्षाकृत तेजी से प्रसंस्करण चरणों के साथ, फिक्स्ड अक्षुण्ण बायोफिल्म्स को कॉन्फोकल स्कैनिंग फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा 3 डी इमेजिंग के लिए पारदर्शी बनाया जा सकता है।

इस प्रक्रिया का प्रदर्शन आज केटी Lagree, एक के बाद डॉक्टरेट शोधकर्ता यहां होगा, और अपने आप को । 12-अच्छी प्लेट में बायोफिल्म विकास शुरू करने के लिए, टेक्स्ट प्रोटोकॉल में वर्णित प्लेट तैयार करें। सेल आसंजन के लिए समय की अनुमति देने के लिए 90 मिनट के लिए एक आर्द्रीकृत 37 डिग्री सेल्सियस एयर इनक्यूबेटर में 60 आरपीएम कक्षीय मिक्सर पर प्लेट रखें।

90 मिनट के बाद मीडियम और अटैच्ड सेल्स को हटा दें और बाँझ मीडियम या पीबीएस से धो लें। टीका उप-संस्था को एक और बहु-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें जिसमें पूर्व-गर्म फिलामेंटेशन माध्यम होता है। थाली को ३७ डिग्री सेल्सियस आर्द्र परिवेश एयर इनक्यूबेटर में लौटाएं और वातारण के लिए ६० आरपीएम कक्षीय मिश्रण के साथ ४८ घंटे तक बायोफिल्म्स बढ़ाएं ।

इनक्यूबेटर से 48 घंटे की प्लेट को पुनः प्राप्त करें और प्रत्येक नमूने से संस्कृति माध्यम को हटा दें। सीरम प्रोटीन को पतला करने के लिए माध्यम को पीबीएस और कई मिनट के लिए इनक्यूबेट के साथ बदलें। पीबीएस को हटाने के बाद, कुआं को फिक्सेटिव से फिर से भरें।

डिश के भीतरी किनारों सहित सभी बायोफिल्म विकास को विसर्जित करने के लिए प्रत्येक डिश में पर्याप्त फिक्सेटिव वॉल्यूम जोड़ा जाना चाहिए। कवर किए गए पकवान को 20 मिनट के लिए धीमी कक्षीय मिक्सर पर सेट करें। पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित फिक्सेटिव को हटाने के बाद, पीबीएस को दूर करके धुंधला करने के लिए तैयार करें और पीबीएस और अपेक्षित दाग वाले समाधान के साथ कुओं को जल्दी से फिर से भरें।

बायोफिल्म को कुछ सेकंड से अधिक समय तक नाली या सूखने की अनुमति न दें। डिश में दाग डालें। दाग की आवश्यक मात्रा बायोफिल्म द्रव्यमान पर निर्भर करती है।

फिर कवर किए गए पकवान को रात भर धीमी कक्षीय मिक्सर पर सेट करें और पन्नी या काले कागज के टुकड़े के साथ प्रकाश से बचाएं। चिमटी का उपयोग करके, निर्धारित दाग वाली बायोफिल्म को पीबीएस से 50/50 पीबीएस-मेथनॉल के पांच मिलीलीटर में बायोफिल्म का सामना करने वाली बायोफिल्म के साथ 20 मिलीलीटर ग्लास शीशी में स्थानांतरित करें। मैन्युअल रूप से पांच मिनट के लिए एक मिनट के अंतराल पर कक्षीय गति के साथ मिलाएं।

पिपेट और बायोफिल्म या बायोफिल्म और शीशी के बीच संपर्क से बचने के लिए सतर्क होने के लिए सतर्क की जा रही बेकार बोतल में सॉल्वेंट निकालें। धीरे-धीरे साफ मेथनॉल के तीन मिलीलीटर के साथ फिर से भरना। मैन्युअल रूप से तीन मिनट के लिए एक मिनट के अंतराल पर कक्षीय गति के साथ मिलाएं।

अब सॉल्वेंट को बेकार बोतल में निकाल कर तुरंत पांच मिलीलीटर मेथनॉल से रिफिल करें। पांच से 10 मिनट के अंतराल पर कक्षीय गति के साथ मैन्युअल रूप से मिश्रण करने के बाद, बेकार बोतल में सॉल्वेंट निकालें। तुरंत मेथनॉल के तीन मिलीलीटर के साथ फिर से भरना।

बायोफिल्म्स अक्सर अपनी प्रारंभिक उपस्थिति की तुलना में इस बिंदु पर अधिक अपारदर्शी दिखते हैं। सॉल्वेंट को बेकार बोतल में निकालें और तुरंत 50/50 मेथनॉल-मिथाइल सैलिसिलेट के पांच मिलीलीटर के साथ शीशी को फिर से भरें। मैन्युअल रूप से पांच से 10 मिनट के लिए एक मिनट के अंतराल पर कक्षीय गति के साथ मिलाएं।

इस मिक्स्ड सॉल्वेंट में बायोफिल्म सेमी ट्रांसपेरेंट होनी चाहिए। सॉल्वेंट को बेकार बोतल में निकालने के बाद धीरे-धीरे शीशी को तीन मिलीलीटर साफ मिथाइल सैलिसिलेट से रिफिल करें। मैन्युअल रूप से तीन मिनट के लिए एक मिनट के अंतराल पर कक्षीय गति के साथ मिलाएं।

इस प्रक्रिया को पांच मिलीलीटर साफ मिथाइल सैलिसिलेट के साथ फिर से दोहराएं, मैन्युअल रूप से पांच से 10 मिनट के अंतराल पर मिश्रण करें। इस बिंदु पर, बायोफिल्म पारदर्शी होना चाहिए। बेकार की बोतल में सॉल्वेंट निकालें और तुरंत साफ मिथाइल सैलिसिलेट के तीन मिलीलीटर के साथ शीशी को फिर से भरें।

इस सॉल्वेंट में प्रोसेस्ड बायोफिल्म स्थिर है। यदि उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग कर रहे हैं, तो एक सॉल्वेंट प्रूफ डिश का उपयोग करें जिसमें एक कवरग्लास बॉटम है और उल्टे नमूने के समर्थन के लिए स्पेसर तैयार करें। यहां, स्पेसर्स 13 मिलीमीटर सिलिकॉन रिंग हैं जो सूजन के कारण फोकस बहाव को कम करने के लिए एक घंटे के लिए मिथाइल सैलिसिलेट में पूर्व-लथपथ होते हैं।

एक चिकित्सा ग्रेड सिलिकॉन वर्ग पर एक बायोफिल्म के लिए, वर्ग उलटा और पकवान में मिथाइल सैलिसिलेट के एक पूल में एक स्पेसर पर सेट करें। नमूने के नीचे किसी भी बुलबुले से बचने के लिए सुनिश्चित करें। पकवान को माइक्रोस्कोप के मंच पर मजबूती से माउंट करें और उद्देश्य के साथ तेल डूबे हुए संपर्क बनाएं।

डिश में मिथाइल सैलिसिलेट की मात्रा को समायोजित करें ताकि मेनिस्कस सतह तनाव से स्पेसर पर नमूना मजबूती से नीचे रखती है। मैट फिनिश से प्रकाश बिखरने को कम करने के लिए उल्टे वर्ग उप-चिकित्सा के शीर्ष पर मिथाइल सैलिसिलेट की एक बूंद रखें। फिर वाष्पीकरण को सीमित करने के लिए पकवान को कांच की प्लेट से ढक दें।

नमूना इमेजिंग से पहले स्पेसर्स पर बसने के लिए कई मिनट प्रतीक्षा करें। अब, पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित नमूने को छवि बनाने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी करें। छवियों को संसाधित करने के लिए, इमेजजे या फिजी खोलें।

यह सुनिश्चित करने के लिए जांच करें कि प्रोग्राम में डेटा को संसाधित करने के लिए पर्याप्त असाइन की गई मेमोरी है। दो गीगाबाइट डेटासेट को संसाधित करने के लिए एक चिकनी ऑपरेशन के लिए कम से कम आठ गीगाबाइट समर्पित रैम की आवश्यकता होती है। कार्रवाई की जाने वाली सीरियल प्लेन इमेज फाइल खोलें।

यदि कंप्यूटर में पूरे स्टैक को संसाधित करने के लिए अपर्याप्त रैम है, तो सबस्टैक को संसाधित किया जा सकता है और फिर एक ही स्टैक में फिर से इकट्ठा किया जा सकता है। इमेज मेनू, टाइप, 32-बिट का उपयोग करके फ्लोटिंग पॉइंट अंकगणितीय संचालन को सक्षम करने के लिए डेटा को 32-बिट प्रारूप में परिवर्तित करें। इससे फाइल का साइज दोगुना हो जाएगा।

इन-फोकस सुविधाओं के विपरीत बढ़ाने के लिए चिकनी पृष्ठभूमि को घटाएं। मेनू को संसाधित करने, पृष्ठभूमि को घटाने के लिए नेविगेट करके पूरे स्टैक को संसाधित करें। यदि आवश्यक हो तो रोलिंग बॉल त्रिज्या को समायोजित करें।

गेंद त्रिज्या को संरक्षित किए जाने वाले इन-फोकस सुविधाओं के सबसे बड़े आयाम से काफी बड़ा होना चाहिए। सभी नकारात्मक पिक्सेल को शून्य पर सेट करने के लिए, प्रत्येक छवि को इसके पूर्ण मूल्य में जोड़ें। सबसे पहले, इमेज मेनू, डुप्लिकेट, डुप्लीकेट स्टैक का उपयोग करके स्टैक को डुप्लिकेट करें।

फिर प्रक्रिया मेनू, गणित, पूर्ण मूल्य का उपयोग करके डुप्लिकेट डेटा का पूर्ण मूल्य लें। मेनू, छवि कैलकुलेटर, जोड़ें प्रक्रिया करने के लिए नेविगेट करके दो ढेर जोड़ें। छवि स्टैक को स्वयंसली रूप से रीसालिक करने के लिए, छवि मेनू, स्टैक, रिस्लिक का उपयोग करें।

फिर आउटपुट अंतर 1.0 का चयन करें, शीर्ष पर शुरू करें और इंटरपोलेशन से बचें। फोकस एक्सिस अब स्टैक में वर्टिकल एक्सिस है । रिसा हुआ स्टैक का वाई-आयाम फोकस विमानों की संख्या के बराबर है।

कुछ या सभी स्टैक का साइड व्यू प्रोजेक्शन करने के लिए, इमेज मेनू, स्टैक, जेड प्रोजेक्ट पर नेविगेट करें। कुछ या साइड व्यू विमानों को शामिल करने के लिए स्लाइस शुरू करें और बंद करें। सर्वोत्तम परिणामों के लिए अधिकतम तीव्रता का चयन करें।

इमेज मेनू, स्केल पर नेविगेट करके साइड व्यू प्रोजेक्शन की अक्षीय स्केलिंग को सही करें। अक्षीय पैमाने के कारक का उपयोग करके असमान छवि विमान पिक्सेलेशन और फोकस वेतन वृद्धि के लिए प्रक्षेपण को ठीक किया जाना चाहिए। एक्स-स्केल को एक सेट करें और वाई-स्केल को अक्षीय पैमाने के कारक में सेट करें।

बाइक्यूबिक इंटरपोलेशन का चयन करें। नई विंडो का चयन करें। चमक और इसके विपरीत समायोजित करें।

फिर प्रदर्शन के लिए आठ-बिट प्रारूप में परिवर्तित करें। वैकल्पिक रूप से, एक रंग लुकअप टेबल लागू करें और आरजीबी या आठ-बिट रंग के रूप में सहेजें। अपवर्तक सूचकांक में वृद्धि के क्रमिक रूप से गलत सॉल्वैंट्स का उपयोग करके, स्पष्टता में अधिकतम का अनुमान लगाया जा सकता है।

यह न्यूनतम विपरीत बिंदु खोजने के लिए पारंपरिक चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा परिष्कृत किया जाता है। एक बायोफिल्म को क्रमिक रूप से जाइलीन और उस सीमा में संदर्भ तरल पदार्थों के एक संकीर्ण सेट के बीच आदान-प्रदान किया गया था। प्रत्येक एक्सचेंज के बाद, एक ही क्षेत्र को एक कवरग्लास के माध्यम से बसाया गया और देखा गया।

बढ़ते सूचकांक के साथ, इसके विपरीत उलट पहली बार देखा जाता है जब एन सेल दीवार के लिए 1.530 के बराबर होता है, इसके बाद साइटोप्लाज्म जब एन 1.535 के बराबर होता है। उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार C.albicans बायोफिल्म्स की गहरी इमेजिंग यहां दिखाया गया है । जंगली प्रकार बायोफिल्म 538 विमान कॉन्फोकल छवि स्टैक के साइड व्यू प्रोजेक्शन में देखे गए 502 माइक्रोन की मोटाई तक बढ़ी।

शीर्ष से आधार तक अक्षीय अनुमान सेल प्रकारों में भिन्नता और बायोफिल्म के विभिन्न स्तर को दर्शाते हैं। यह उदाहरण विशेषता जंगली प्रकार की संरचना दिखाता है। उत्परिवर्ती बायोफिल्म 500 माइक्रोन की मोटाई तक बढ़ी जैसा कि 556 विमान छवि स्टैक के साइड व्यू प्रोजेक्शन में देखा गया था।

तनाव पैदा करने के अभाव में फिलामेंटस विकास से गुजरने के लिए जाना जाने वाला यह उत्परिवर्ती नाटकीय रूप से अलग वास्तुकला का उत्पादन करता है। जैसा कि साइड व्यू और अक्षीय अनुमानों दोनों में देखा गया है, कई ब्रांचिंग कोशिकाएं रेडियल वृद्धि को जन्म देती हैं। यह एक हाई अपवर्तक इंडेक्स डीप इमेजिंग प्रोटोकॉल है।

आदर्श रूप से, नमूना का अपवर्तक सूचकांक और विसर्जन तेल का अपवर्तक सूचकांक मैच होना चाहिए। यही कारण है कि इस मामले में, हम एक तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करें । हमारे अधिकांश अध्ययन सेल वॉल मार्कर का उपयोग करके बायोफिल्म्स की संरचनात्मक इमेजिंग कर रहे हैं, लेकिन किसी भी फ्लोरेसेंस विधि जिसका उपयोग निश्चित नमूनों के साथ किया जाता है, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, सीटू संकरण में फ्लोरेसेंस, और रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति सहित काम करना चाहिए।

यह विशेष जीव, कैंडिडा एल्बिकान, स्वस्थ मनुष्यों में अनुकूल है, लेकिन यह एक अवसरवादी रोगजनक भी है जो म्यूकोसल या प्रणालीगत खमीर संक्रमण का कारण बन सकता है। कुछ संस्थानों में बीएसएल द्वितीय रोकथाम के तरीकों और प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है । इसके अतिरिक्त, फॉर्मलडिहाइड और ग्लूटाराल्डिहाइड फिक्सेटिव अस्थिर और खतरनाक हैं।

वे कैंसरजनों के लिए जाने जाते हैं। एक धूम हुड में फिक्सेटिव्स के कमजोर पड़ने बनाओ। पतला फिक्सेटिव वाले व्यंजनों को कवर रखें और इन फिक्सेटिव्स वाले कंटेनरों को जैव सुरक्षा कैबिनेट में या सेल कल्चर इनक्यूबेटर में न रखें।