많은 생물학적 표본과 같은 칸디다 알비칸스 생물막은 모국어에서 불투명하게 반투명합니다. 이러한 프로토콜에서, 우리는 설명 방법을 사용하여 고정 된 그대로 생물막의 내부 구조가 광학 단면 현미경 검사법을 통해 이미지화 될 수 있음을 보여줍니다. 간단하고 저렴하며 비교적 빠른 처리 단계로 고정된 그대로 생물막은 공초점 스캐닝 형광 현미경 검사법을 통해 3D 이미징에 대해 투명하게 만들 수 있습니다.
오늘이 절차를 시연케이티 Lagree, 여기에 박사 후 연구원, 그리고 나 자신. 12웰 플레이트에서 생물막 성장을 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플레이트를 준비합니다. 60 RPM 궤도 믹서에 플레이트를 가습된 섭씨 37도 공기 인큐베이터에 90분간 배치하여 세포 접착 시간을 허용합니다.
90 분 후, 매체및 부착되지 않은 세포를 제거하고 멸균 매체 또는 PBS로 세척하십시오. 접종된 아스트라타를 미리 데운 필라멘팅 배지를 포함하는 또 다른 멀티웰 플레이트로 옮킨다. 플레이트를 섭씨 37도의 가습된 앰비언트 공기 인큐베이터로 되돌리고 60RPM 궤도 혼합으로 최대 48시간까지 생물막을 재배합니다.
인큐베이터에서 48시간 플레이트를 회수하고 각 시편에서 배양 배지를 제거합니다. 매체를 PBS로 교체하고 몇 분 동안 배양하여 혈청 단백질을 희석시보도록 하십시오. PBS를 제거한 후, 고정된 우물을 다시 채웁니다.
접시의 내부를 포함하여 모든 생물 막 성장을 몰입하기 위해 충분한 고정 볼륨을 각 접시에 첨가해야합니다. 덮인 접시를 느린 궤도 믹서에 20분 간 설정합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 고정을 제거한 후 PBS를 빼내고 PBS및 필수 얼룩을 포함하는 솔루션으로 우물을 신속하게 리필하여 염색을 준비합니다.
생물막이 몇 초 이상 배수하거나 건조하지 않도록 하십시오. 접시에 얼룩을 추가합니다. 얼룩의 필요한 양은 생물 막 질량에 따라 달라집니다.
그런 다음 덮여 있는 접시를 밤새 느린 궤도 믹서에 넣고 호일이나 검은 종이조각으로 빛으로부터 보호합니다. 핀셋을 사용하여, 바이오 필름이 위로 향하고 있는 20 밀리리터 유리 바이알에 50/50 PBS-메탄올의 5밀리리터로 고정 된 스테인드 바이오필름을 전송합니다. 5분 동안 1분 간격으로 궤도 모션과 수동으로 섞는다.
파이펫과 바이오필름 또는 생물막 과 바이알 사이의 접촉을 피하기 위해 조심스러운 폐병에 용매를 제거합니다. 깔끔한 메탄올 3밀리리터로 부드럽게 리필합니다. 3분 동안 1분 간격으로 궤도 모션과 수동으로 섞는다.
이제 용매를 폐병에 제거하고 즉시 메탄올 5 밀리리터로 리필하십시오. 5~10분 동안 1분 간격으로 궤도 모션과 수동으로 혼합한 후 용매를 폐병에 제거합니다. 즉시 메탄올의 세 밀리리터로 리필.
생물막은 종종 초기 외관보다이 시점에서 더 불투명해 보입니다. 용매를 폐병에 제거하고 50/50 메탄올 메틸 살리실레이트의 5밀리리터로 바이알을 즉시 리필합니다. 5~10분 동안 1분 간격으로 궤도 모션과 수동으로 섞는다.
바이오필름은 이 혼합 용매에서 반투명해야 한다. 용매를 폐병에 제거한 후, 깨끗한 메틸 살리실레이트의 3밀리리터로 바이알을 부드럽게 리필합니다. 3분 동안 1분 간격으로 궤도 모션과 수동으로 섞는다.
깔끔한 메틸 살리실레이트 5밀리리터로 프로세스를 다시 반복하여 5-10분 동안 1분 간격으로 수동으로 혼합합니다. 이 시점에서, 생물막은 투명해야한다. 용매를 폐병에 제거하고 깨끗한 메틸 살리실레이트의 3밀리리터로 바이알을 즉시 리필합니다.
가공된 바이오필름은 이 용매에서 안정적입니다. 반전 된 현미경을 사용하는 경우, 커버 글라스 바닥이용솔벤트 방지 접시를 사용하고 반전 된 표본을 지원하기 위해 스페이서를 준비하십시오. 여기서 스페이서는 13mm 실리콘 링으로, 메틸 살리실레이트에 1시간 동안 미리 담그어 붓기로 인한 초점 드리프트를 최소화합니다.
의료 용 실리콘 사각형에 생물막의 경우, 사각형을 반전하고 접시에 메틸 살리실레이트의 수영장에서 스페이서에 설정합니다. 표본 아래에 있는 거품을 피해야 합니다. 현미경의 무대에 단단히 접시를 마운트하고 오일이 목표와 접촉하게.
반월 상 연골이 표면 장력에 의해 스페이서에 단단히 표본을 보유 할 수 있도록 접시에 메틸 살리실레이트의 양을 조정합니다. 메틸 살리실레이트의 액적을 역사각형 아스테텀 위에 놓아 매트 마감에서 빛이 흩어져 있는 것을 줄입니다. 그런 다음 증발을 제한하기 위해 유리 접시로 접시를 덮습니다.
시편이 이미징 전에 스페이서에 정착할 때까지 몇 분 간 기다립니다. 지금, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 표본을 이미지하기 위하여 공초점 현미경 검사를 수행합니다. 이미지를 처리하려면 ImageJ 또는 피지를 엽니다.
프로그램이 처리될 데이터에 대한 충분한 할당된 메모리가 있는지 확인합니다. 2기가바이트 데이터 집합을 처리하려면 원활한 작동을 위해 최소 8기가바이트의 전용 RAM이 필요합니다. 처리할 직렬 평면 이미지 파일을 엽니다.
컴퓨터가 전체 스택을 처리하기에 RAM이 충분하지 않은 경우 하위 스택을 처리한 다음 단일 스택으로 다시 조립할 수 있습니다. 이미지를 32비트 형식으로 변환하여 이미지 메뉴, 유형, 32비트를 사용하여 부동점 산술 작업을 활성화합니다. 이렇게 하면 파일 크기가 두 배가 됩니다.
매끄러운 배경을 빼서 초점 기능의 대비를 높입니다. 메뉴를 처리하고 배경을 빼내도록 탐색하여 전체 스택을 처리합니다. 필요한 경우 롤링 볼 반경을 조정합니다.
볼 반지름은 보존할 인포커스 피처의 가장 큰 치수보다 훨씬 커야 합니다. 모든 음수 픽셀을 0으로 설정하려면 각 이미지를 절대 값에 추가합니다. 먼저 이미지 메뉴, 중복, 중복 스택을 사용하여 스택을 복제합니다.
그런 다음 프로세스 메뉴, 수학, 절대 값을 사용하여 중복 된 데이터의 절대 값을 가져 가라. 프로세스 메뉴, 이미지 계산기, 추가로 이동하여 두 스택을 추가합니다. 이미지 스택을 축으로 다시 슬라이스하려면 이미지 메뉴, 스택, 다시 슬라이스를 사용합니다.
그런 다음 출력 간격 1.0을 선택하고 위에서 시작하여 보간을 피하십시오. 이제 포커스 축이 스택의 세로 축입니다. 다시 슬라이스된 스택의 Y 차원은 포커스 평면 수와 같습니다.
스택의 일부 또는 전부의 측면 뷰 프로젝션을 만들려면 이미지 메뉴, 스택, Z 프로젝트로 이동합니다. 시작 슬라이스를 설정하고 슬라이스를 중지하여 측면 뷰 평면의 일부 또는 전부를 포함합니다. 최상의 결과를 위해 최대 강도를 선택합니다.
이미지 메뉴, 배율로 이동하여 측면 뷰 투영의 축 배율을 수정합니다. 축 축 배율 계수를 사용하여 비등한 이미지 평면 픽셀화 및 초점 증분에 대해 프로젝션을 수정해야 합니다. X 스케일을 하나로 설정하고 Y 스케일을 축 축 배율 계수로 설정합니다.
이중 입방 보간을 선택합니다. 새 창 만들기를 선택합니다. 밝기와 대비를 조정합니다.
그런 다음 디스플레이를 위해 8비트 형식으로 변환합니다. 또는 색상 조회 테이블을 적용하고 RGB 또는 8비트 색상으로 저장합니다. 굴절률 증가의 직렬 로 잘못 된 용매를 사용 하 여, 선명도의 최대를 신속 하 게 추정할 수 있습니다.
이것은 최소 대비의 점을 찾기 위해 기존의 위상 대조 현미경 검사법에 의해 정제된다. 한 생물막은 자일렌과 그 범위의 좁은 참조 액체 세트 사이에서 연속적으로 교환되었습니다. 교환 할 때마다 동일한 필드가 재배치되어 덮개 유리를 통해 볼 수 있었습니다.
지수가 증가함에 따라 n이 세포벽에 대해 1.530과 같을 때, n이 1.535와 같을 때 세포질이 뒤따를 때 대비 반전이 처음 보입니다. 돌연변이 및 야생 형 C.albicans 생물막의 깊은 이미징이 여기에 표시됩니다. 야생형 생물막은 538평면 공초점 이미지 스택의 측면 뷰 투영에서 볼 수 있듯이 502미크론의 두께로 성장하였다.
정점에서 기초로의 축 투영은 생물막의 세포 유형 및 상이한 지층의 변이를 보여준다. 이 예제에서는 특성 야생 유형 구조를 보여 주습니다. 돌연변이 생물막은 556 평면 이미지 스택의 측면 뷰 투영에서 볼 수 있듯이 500 미크론의 두께로 성장했다.
스트레스를 유도하지 않고 필라멘트 성장을 겪는 것으로 알려진 이 돌연변이는 극적으로 다른 아키텍처를 생산했다. 측면 보기와 축 투영 모두에서 볼 수 있듯이, 많은 분기 세포는 방사형 성장을 초래한다. 이것은 높은 굴절지수 심층 화상 진찰 프로토콜입니다.
이상적으로, 시편의 굴절률과 침수 오일의 굴절지수가 일치해야 한다. 그렇기 때문에 오일 침지 목표를 사용합니다. 우리의 연구 결과의 대부분은 세포 벽 마커를 사용하여 생물막의 구조적인 화상 진찰이었습니다, 그러나 고정된 견본과 함께 이용되는 어떤 형광 방법은 정시 혼성화에 있는 면역형광, 형광, 및 기자 유전자 발현을 포함하여 작동해야 합니다.
이 특정 유기체, 칸디다 알비칸스는 건강한 인간에서 발생하지만 점막 또는 전신 효모 감염을 일으킬 수있는 기회 성 병원체이기도합니다. 일부 기관에서는 BSL II 봉쇄 방법 및 프로토콜이 필요합니다. 또한 포름알데히드와 글루타랄데히드 고정제는 휘발성이 높고 위험합니다.
그들은 발암 물질로 알려져 있습니다. 연기 후드에 고정의 희석을 메이크업. 희석 된 고정제를 포함하는 접시를 보관하고 생물 안전 캐비닛 이나 세포 배양 배양기에서 이러한 고정제를 포함하는 용기를 넣지 마십시오.
