Avklare og imaging Candida albicans Biofilms

Candida albicans biofilmer som mange biologiske prøver er tungt gjennomskinnelig til ugjennomsiktig i sin hjemstat. I disse protokollene viser vi at ved hjelp av avklaringsmetoder kan den interne strukturen til faste intakte biofilmer avbildes av optisk snittingsmikroskopi. Med enkle, rimelige og relativt raske behandlingstrinn kan faste intakte biofilmer gjøres gjennomsiktige for 3D-avbildning ved konfokal skanning av fluorescensmikroskopi.

Demonstrert denne prosedyren i dag vil være Katie Lagree, en post-doktorgradsforsker her, og meg selv. For å begynne biofilmvekst i en 12-brønns plate, klargjør platen som beskrevet i tekstprotokollen. Plasser platen på en 60 RPM orbital mikser i en fuktet 37 grader Celsius luftinkubator i 90 minutter for å gi tid til celle vedheft.

Etter 90 minutter, fjern medium og unattached celler og vask med sterilt medium eller PBS. Overfør det inokulerte substrataet til en annen multibrønnplate som inneholder forvarmet filamentasjonsmedium. Returner platen til 37 grader Celsius fuktet omgivelsesluftinkubator og øk biofilmene opptil 48 timer med 60 RPM orbital blanding for lufting.

Hent den 48-timers platen fra inkubatoren og fjern kulturmediet fra hvert eksemplar. Bytt medium med PBS og inkuber i flere minutter for å fortynne serumproteiner. Etter at pbsen er fjernet, fyller du på brønnene med fikseringsmiddel.

Tilstrekkelig fikseringsvolum bør legges til hver tallerken for å senke all biofilmvekst, inkludert noen på de indre sidene av parabolen. Sett den overbygde parabolen på en langsom orbital mikser i 20 minutter. Etter å ha fjernet fikseringsmiddelet som beskrevet i tekstprotokollen, klargjør du for farging ved å tømme PBS og raskt fylle brønnene med en løsning som inneholder PBS og den nødvendige flekken.

Ikke la biofilmen renne eller tørke i mer enn noen få sekunder. Tilsett flekken til parabolen. Den nødvendige mengden flekk avhenger av biofilmmassen.

Sett deretter den overbygde parabolen på en langsom orbital mikser over natten og beskytt mot lys med folie eller et stykke svart papir. Bruk pinsett, overfør den faste glassmalerier biofilm fra PBS til fem milliliter av 50/50 PBS-metanol i en 20 milliliter glass hetteglass med biofilm vendt opp. Bland manuelt med orbital bevegelse med ett minutts intervaller i fem minutter.

Fjern oppløsningsvæsken til en avfallsflaske som er forsiktig for å unngå kontakt mellom pipetten og biofilmen eller biofilmen og hetteglasset. Fyll forsiktig på med tre milliliter pent metanol. Bland manuelt med orbital bevegelse med ett minutts intervaller i tre minutter.

Fjern nå oppløsningsvæsken til en avfallsflaske og fyll umiddelbart med fem milliliter metanol. Etter å ha blandet med orbital bevegelse manuelt med ett minutts intervaller i fem til 10 minutter, fjern oppløsningsvæsken til avfallsflasken. Fyll umiddelbart med tre milliliter metanol.

Biofilmer ser ofte mer ugjennomsiktige ut på dette punktet enn deres første utseende. Fjern oppløsningsvæsken til avfallsflasken og fyll umiddelbart hetteglasset med fem milliliter 50/50 metanolmetylaltaltilat. Bland manuelt med orbital bevegelse med ett minutts intervaller i fem til 10 minutter.

Biofilmen skal være halvgjennomsiktig i dette blandede løsningsmidlet. Etter å ha fjernet oppløsningsvæsken til en avfallsflaske, fyll forsiktig hetteglasset med tre milliliter pent metylsaltilat. Bland manuelt med orbital bevegelse med ett minutts intervaller i tre minutter.

Gjenta prosessen igjen med fem milliliter pent metylsallisat, manuelt blande med ett minutt intervaller i fem til 10 minutter. På dette punktet skal biofilmen være gjennomsiktig. Fjern oppløsningsvæsken til avfallsflasken og fyll umiddelbart hetteglasset med tre milliliter pent metylsaltilat.

Den bearbeidede biofilmen er stabil i dette løsningsmidlet. Hvis du bruker et invertert mikroskop, bruk en løsemiddelsikker tallerken som har en dekkglassbunn og klargjør avstandss foran for støtte for den inverterte prøven. Her er avstandssyrene 13 millimeter silikonringer som er forutsåt i metylsallisat i en time for å minimere fokusdrift på grunn av hevelse.

For en biofilm på en medisinsk silikon firkant, inverter torget og sett den på en avstandsskjedel i et basseng av metylsalylat i parabolen. Pass på å unngå bobler under prøven. Monter fatet godt på mikroskopets stadium og gjør olje nedsenket kontakt med målet.

Juster mengden metylsalylat i fatet slik at menisken holder prøven godt nede på avstandsspennen etter overflatespenning. Plasser en dråpe metylsaltilat på toppen av det inverterte firkantede substratet for å redusere lysspryt fra den matte finishen. Dekk deretter parabolen med en glassplate for å begrense fordampning.

Vent i flere minutter til prøven legger seg på avstandsslene før bildebehandling. Utfør nå konfokal mikroskopi for å bilde av prøven som beskrevet i tekstprotokollen. Hvis du vil behandle bildene, åpner du ImageJ eller Fiji.

Kontroller at programmet har tilstrekkelig tilordnet minne for at dataene skal behandles. Behandling av et datasett på to gigabyte krever minst åtte gigabyte dedikert RAM for en jevn drift. Åpne den serielle planbildefilen som skal behandles.

Hvis datamaskinen ikke har nok RAM til å behandle hele stakken, kan sekundære versjoner behandles og deretter settes sammen igjen i en enkelt stabel. Konverter dataene til 32-biters format for å aktivere aritmetiske operasjoner for flyttall ved hjelp av bildemenyen, skriv inn, 32-biters. Dette vil doble filstørrelsen.

Trekk fra den glatte bakgrunnen for å øke kontrasten til fokusfunksjoner. Behandle hele bunken ved å navigere til prosessmenyen, trekk fra bakgrunnen. Juster rulleballradiusen om nødvendig.

Kuleradiusen skal være betydelig større enn den største dimensjonen av de in-focus funksjonene som skal bevares. Hvis du vil angi alle negative piksler til null, legger du til hvert bilde i den absolutte verdien. Først duplisere stakken ved hjelp av bildemenyen, duplisere, duplisere stakken.

Ta deretter den absolutte verdien av de dupliserte dataene ved hjelp av prosessmenyen, matematikk, absolutt verdi. Legg til de to stablene ved å navigere til prosessmenyen, bildekalkulatoren, legg til. Hvis du vil aksialt viderelisensiere bildestakken, bruker du bildemenyen, stabler, videreslice.

Velg deretter utgangsavstand 1.0, start øverst og unngå interpolering. Fokusaksen er nå den vertikale aksen i stakken. Y-dimensjonen av den resliced stabelen tilsvarer antall fokusfly.

Hvis du vil lage en sidevisningsprojeksjon av noen av eller alle stakken, går du til bildemenyen, stablene, Z-prosjektet. Sett startskive og stopp skive for å inkludere noen av eller alle sidevisningsplanene. Velg maks intensitet for best resultat.

Korriger aksialskalering av sidevisningsprojeksjonen ved å gå til bildemenyen, skaler. Projeksjonen må korrigeres for ulik bildeplanpikselisering og fokusøkning ved hjelp av aksialskalafaktoren. Sett X-skalaen til én, og sett Y-skalaen til aksialskalafaktoren.

Velg bikub interpolering. Velg opprett nytt vindu. Juster lysstyrke og kontrast.

Konverter deretter til åtte-biters format for visning. Du kan også bruke en fargeoppslagstabell og lagre som RGB- eller åtte-biters farge. Ved hjelp av serielt feilbare løsemidler for å øke brytningsindeksen, kan maksimalt i klarhet raskt anslås.

Dette er raffinert av konvensjonell fase kontrast mikroskopi for å finne poenget med minimum kontrast. En biofilm ble serielt utvekslet mellom xylen og et smalt sett med referansevæsker i dette området. Etter hver utveksling ble det samme feltet flyttet og sett gjennom et dekkglass.

Med økende indeks, kontrast reversering er først sett når n tilsvarer 1.530 for celleveggen, etterfulgt av cytoplasma når n er lik 1.535. Dyp avbildning av mutant og vill type C.albicans biofilms er vist her. Den ville typen biofilm vokste til en tykkelse på 502 mikrometer sett i sidevisningprojeksjonen av 538-flyets confocal bildestakk.

Aksiale projeksjoner fra toppunkt til base viser variasjonen i celletyper og ulike lag av biofilmen. Dette eksemplet viser karakteristisk vill type struktur. Den muterte biofilmen vokste til en tykkelse på 500 mikron sett i sidevisningsprojeksjonen av 556-planbildestakken.

Denne mutanten kjent for å gjennomgå filamentøs vekst i fravær av induserende stressfaktorer produsert en dramatisk annerledes arkitektur. Som sett i både sidevisning og aksiale projeksjoner, gir mange forgreningsceller opphav til radiale utvekster. Dette er en høy brytningsindeks dyp bildeprotokoll.

Ideelt sett bør den brytningsindeksen til prøven og den brytningsindeksen til nedsenkingsoljen matche. Det er derfor i dette tilfellet bruker vi et oljenedsenkingsmål. De fleste av våre studier har vært strukturell avbildning av biofilmer ved hjelp av celleveggmarkører, men enhver fluorescensmetode som brukes med faste prøver, bør fungere, inkludert immunfluorescens, fluorescens in situ hybridisering og reportergenuttrykk.

Denne spesielle organismen, Candida albicans, er commensal hos friske mennesker, men er også et opportunistisk patogen som kan forårsake slimhinne- eller systemiske gjærinfeksjoner. Ved noen institusjoner er bsl ii inneslutningsmetoder og protokoller nødvendig. I tillegg er formaldehyd og glutaraldehyd fikseringsmidler flyktige og farlige.

De er kjente kreftfremkallende stoffer. Utgjør fortynninger av fikseringsmidler i en røykhette. Hold retter som inneholder fortynnede fikseringsmidler dekket og ikke legg beholdere som inneholder disse fikseringene i et biosikkerhetsskap eller i en cellekulturinkubator.