Name: clarifying and imaging candida albicans biofilms
Uploaded: 2020-03-06T13:00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms at JoVE.com

Это исследование было частично поддержано NIH гранты R01 AI067703, R21 AI100270, и R21 AI135178 А.П. Митчелл. Авторы благодарны Гринфилду 'Kip' Sluder за предоставление дальней рабочей цели погружения нефти, используемой в этой работе, и Даниэлю Шиварски за конфоковую микроскопию с прямым погружением метил-салицилата.

1. Рост культур биопленки
ВНИМАНИЕ: Candida Albicans является человеческим патогеном. В некоторых учреждениях культура этого организма требует сдерживания BSL-2.
<ol><li>Полоса из выбранной деформации на дрожжевой экстракт-пептон-декстроза (YPD) агар пластины и расти 48 ч при 30 градусах Цельсия.</li>
	<li>Выберите одиночные колонии от плиты для того чтобы привить 5 ml среды YPD в пробках культуры 15 mL для ночного аэробного роста (ротатор карусели, 52-55 rpm) на 30 c.</li>
	<li>Определить плотность клеток с помощью 40-50-кратного разбавления ночной культуры. Вычислите коэффициент разбавления, необходимый для доведения плотности клеток до 3 х 106 ячеек/мл для силиконовой субстраты, или 0,6-1,2 х 106-6-ти клеток/мл для поверхностных стеклянных поверхностей, обработанных конкановалином-А (ConA) или агглютином из пшеники (WGA) (см. Обсуждение).</li>
	<li>Для роста биопленки в 12 хорошо пластины(Рисунок 1), обойтись 2,0 мл стерильной нити среды в каждый колодец, и теплой пластины до 37 градусов по Цельсию в увлажненный инкубатор. Разнообразие носителей будет вызывать нити, более сильно при повышенной температуре (37 градусов по Цельсию) и с добавлением сыворотки. Рекомендуется сыворотка крупного рогатого скота (FBS). Рекомендуемые средства массовой информации YPD, Spider-Mannitol, или RPMI-1640.</li>
	<li>С помощью стерильных пинцетов поместите подготовленный субстрат в каждый колодец в разогретую тарелку и выбить пузыри. Добавьте инокулум из ночной культуры, чтобы достичь плотности клеток, рекомендованной в шаге 1.3 в каждом колодце. Один колодец без инокулума служит визуальным пробелом и контролем против загрязнения.</li>
	<li>Поместите пластину на орбитальный смеситель с 60 об/мин в увлажненный воздухоплаватель 37 градусов по Цельсию в течение 90 минут, чтобы дать время для сливк клеток. После 90 мин, удалить средние и неприсоединения клеток, мыть стерильной среды или фосфат-буфера солей (PBS), и место прививки субстраты в культуре блюда или другой многовелл пластины, содержащие прегревной нити среды. С мультивеллными пластинами очень удобно использовать вторую пластину для стирки и третью пластину с 2,0 мл предварительно разогретой среды на скважину, чтобы получить промытую привитированную субстрату. Стерилизовать пинцет перед каждой передачей.</li>
	<li>Верните пластину в увлажненный атмосферно-воздушный инкубатор 37 градусов Цельсия и выращивайте биопленки до 48 ч с 60 об/мин орбитальным смешиванием для аэрации. Там должно быть мало планктонского роста в каждой культуре, если развивающаяся биопленка пролить дрожжевой форме клеток. Биопленка, выращенная таким образом, показана на рисунке 1.</li>
</ol>2. Обработка образцов для визуализации
ПРЕДЕКТО: Альдегид фиксаторы являются летучими и опасными. Подготовка фиксации разбавления в дым капот, а не в биобезопасности кабинета. Не кладите фиксаторы в инкубаторы, используемые для живых клеток. Работайте с разбавленными фиксаторами в крытой посуде в дымовом капюшоне или хорошо проветриваемых скамейках. Утилизация фиксаторов и пост-фикс овых растворов в качестве опасных отходов.
<ol><li>Приготовьте свежий фиксатор, 4% формальдегида или параформальдегида в PBS, дополнительно с до 2% глютаральдегида. Формалин, разбавленный до 4%, может быть использован для рутинной работы. ПРИМЕЧАНИЕ: Глютаральдегид, в частности, увеличит широкополосную автофлуоресценцию и может утихать флуоресценцию выразимых тегов, таких как dTomato.</li>
	<li>Удалите культурную среду из образца и замените PBS, чтобы разбавить белки сыворотки, или перенести биопленку на ее субстрат в PBS, в течение нескольких минут.</li>
	<li>Перенесите образец в фиксатор и установите покрытую тарелку на медленный орбитальный миксер на 20 мин. Продлите срок обработки более толстых образцов (см. Обсуждение). К каждому блюду следует добавить достаточный фиксаторный объем, чтобы погрузить весь рост биопленки, в том числе и на внутренней стороне блюда.</li>
	<li>Удалить фиксатор и пополнить блюдо с PBS, чтобы вымыть остаточный фиксатор. Утилизация фиксатора в качестве опасных отходов. Повторите несколько краткосрочных стирки, а затем больше стирки, чтобы время для остаточного фиксатора, чтобы рассеять из биопленки или агар блока. Период стирки зависит от времени, отведенного для фиксации (см. Обсуждение).</li>
	<li>Необходимое количество пятен будет зависеть от массы биопленки. Удалите все биопленки из не-образца областях культуры блюдо до окрашивания, или передать фиксированный образец в новое блюдо перед окрашиванием. Не допускайте слива биопленки или высыхания.  Держите его погруженным в PBS.</li>
	<li>Добавьте пятно в блюдо (см. Обсуждение) и установите крытое блюдо на медленном орбитальном миксере на ночь (см. Обсуждение). Защитите от света.</li>
	<li>Утром, удалить окрашивающий раствор и пополнить блюдо с PBS разбавить несвязанные пятна. Установите блюда на медленном орбитальном миксере, чтобы разложить в течение нескольких часов.</li>
</ol>3. Протокол разъяснения: Биопленки на Impermeant Substrata
<ol><li>Уточненные биопленки трудно различить визуально. Поэтому, при желании, отметьте одну сторону каждого субстрата царапиной, чтобы обозначить сторону для прививки.</li>
	<li>Используйте помеченные длинные пипетки Pasteur для всех последующих отходов и платежеспособных переносов, чтобы избежать перекрестного загрязнения растворителей.</li>
	<li>Используя пинцет, перенесите фиксированную биопленку с PBS на 5 мл 50:50 PBS: метанол в стеклянном флаконе 20 мл с биопленкой вверх. Вручную смешивайте с орбитальным движением с интервалом 1 мин в течение 5 минут (см. Обсуждение).</li>
	<li>Удалите растворитель в бутылку отходов, будьте осторожны, чтобы избежать контакта между пипеткой и биопленкой, или биопленкой и флаконом. Аккуратно пополнить 3 мл аккуратного метанола. Вручную смешайте с орбитальным движением с интервалом 1 мин в течение 3 мин.</li>
	<li>Удалите растворитель в бутылку с отходами и немедленно пополнить с 5 мл метанола. Вручную смешайте с орбитальным движением с интервалом 1 мин в течение 5-10 мин. Удалите растворитель в бутылку с отходами и немедленно пополнить 3 мл метанола. Биопленки часто выглядят более непрозрачными на данный момент, чем их первоначальный вид.</li>
	<li>Удалите растворитель в бутылку отходов, и сразу же пополнить флакон с 5 мл 50:50 метанола: метил салицилат. Вручную смешайте с орбитальным движением с интервалом 1 мин в течение 5-10 мин. Биопленка должна быть полупрозрачной в этом смешанном растворителе.</li>
	<li>Удалите растворитель в бутылку с отходами. Аккуратно пополнить флакон с 3 мл аккуратного метилсалицилата (MS). Вручную смешайте с орбитальным движением с интервалом 1 мин в течение 3 мин.</li>
	<li>Удалите растворитель в бутылку отходов, и сразу же пополнить с 5 мл аккуратные MS. Ручно перемешать с орбитальным движением на 1 мин интервалы в течение 5-10 минут. На данный момент биопленка должна быть прозрачной. Удалите растворитель в бутылку отходов, и сразу же пополнить флакон с 3 мл аккуратные MS. Обработанная биопленка стабильна в этом растворителе.</li>
	<li>Для биопленки на агар (см. Обсуждение) продлить все периоды обмена времени, чтобы для воды и растворителя диффузии, хотя агар. Необходимые периоды времени можно оценить с помощью маломощных рассекающих микроскопов с темным освещением поля для просмотра заранее растворителя в агар. Протокол достигает хорошего уточнения и никаких серьезных эффектов усадки, когда 2% агар используется, но уточнил агар будет конденсироваться, если сжать при обработке с пинцетом. Рекомендуется использовать шпатель.</li>
</ol>4. Настройка изображений для конфокальной микроскопии
<ol><li>Следующие шаги для использования перевернутого микроскопа. Используйте растворитель-доказательство блюдо, которое имеет крышку стеклянного дна для проведения перевернутый образец на стадии микроскопа (см. Обсуждение).</li>
	<li>Подготовьте прокладки для поддержки перевернутого образца. Используйте небольшие прямоугольники, вырезанные из слайдов микроскопа (толщиной 1000 мкм), крышки (170 мкм), или 13 мм силиконовых колец (330 мкм, см. Таблица материалов), которые могут быть уложены по мере необходимости. Предварительно замочить кольца в метил-салицилат в течение 1 ч, чтобы свести к минимуму фокус дрейфа из-за отеков.</li>
	<li>Для биопленки на кремниевом квадрате медицинского сорта инвертировать квадрат (т.е. поверните его на биопленку) и установите его на прокладку в бассейне метил-салицилата в блюде (Рисунок 2). Убедитесь в том, чтобы избежать каких-либо пузырьков ниже образца.</li>
	<li>Смонтировать блюдо твердо на сцене микроскопа и сделать масло погруженный контакт с целью (см. Обсуждение).</li>
	<li>Отрегулируйте количество MS в тарелке так, что мениск держит образец твердо вниз на прокладке поверхностным натяжением. Поместите каплю MS на верхней части перевернутой квадратной субстратума, чтобы уменьшить рассеяние света от матовой отделки, и накройте блюдо стеклянной пластиной, чтобы ограничить испарение. Подождите несколько минут, пока образец осядет на прокладки до получения изображения.</li>
	<li>Используйте передаваемый свет для визуального осмотра поля зрения и определения текущего положения фокусировки относительно апикаических и базальных областей перевернутой биопленки. Установите конденсатор освещающей численную диафрагму (INA) до минимума (закрыть конденсаторную радужную оболочку), чтобы увеличить контрастность, в противном случае уточненная биопленка будет почти невидимой. После этого выключите передаваемый источник света.</li>
	<li>Переключитесь на конфокальный флуоресценции и установить нижние и верхние пределы серийного фокуса изображения стек, необходимый для охвата биопленки. Вверх фокус диск ажиотажа, который рекомендуется, сначала покажет выбили клетки, которые поселились на крышку стекла и очень длинные apical гифы, которые опираются на стекло. На верхнем конце последовательности следует увидеть клетки-основатели, прилипаемые к субстратуму у основания биопленки. Установите диаметр пинхола, расстояние пикселей в плоскости изображения и приращение шага фокусировки с использованием общих критериев, изложенных в обсуждении.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Desai, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+Candida+albicans+invasion+and+infection+functions+by+phosphoglycerol+phosphatase+Rh2.">Coordination of Candida albicans invasion and infection functions by phosphoglycerol phosphatase Rh2.</a> Pathogens. 4, 573-589 (2015).</li><li>Miram&#243;n, P., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feast+for+Candida:+Metabolic+plasticity+confers+an+edge+for+virulence.">A feast for Candida: Metabolic plasticity confers an edge for virulence.</a> PLoS Pathogens. 13 (2), 1006144 (2017).</li><li>Bonhomme, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+glycolytic+flux+and+hypoxia+adaptation+to+efficient+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Contribution of the glycolytic flux and hypoxia adaptation to efficient biofilm formation by Candida albicans.</a> Molecular Microbiology. 80, 995-1013 (2011).</li><li>Ram&#237;rez-Zavala, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Snf1-activating+kinase+Sak1+is+a+key+regulator+of+metabolic+adaptation+and+in+vivo+fitness+of+Candida+albicans.">The Snf1-activating kinase Sak1 is a key regulator of metabolic adaptation and in vivo fitness of Candida albicans.</a> Molecular Microbiology. 104, 989-1007 (2017).</li><li>Westman, J., Moran, G., Mogavero, S., Hube, B., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+hyphal+expansion+causes+phagosomal+membrane+damage+and+luminal+alkalinization.">Candida albicans hyphal expansion causes phagosomal membrane damage and luminal alkalinization.</a> mBio. 9, 01226 (2018).</li><li>Finkel, J. S., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+Candida+albicans+biofilm+development.">Genetic control of Candida albicans biofilm development.</a> Nature Reviews Microbiology. 9, 109-118 (2011).</li><li>Finkel, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+Candida+albicans+adherence+regulators.">Portrait of Candida albicans adherence regulators.</a> PLoS Pathogens. 8, 1002525 (2012).</li><li>de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesins+in+human+fungal+pathogens:+glue+with+plenty+of+stick.">Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick.</a> Eukaryotic Cell. 12, 470-481 (2013).</li><li>Lagree, K., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+Biofilms:+Inside+Out.">Fungal Biofilms: Inside Out.</a> Microbiology Spectrum. 5, (2017).</li><li>Hawser, S. P., Douglas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+of+Candida+albicans+biofilms+to+antifungal+agents+in+vitro.">Resistance of Candida albicans biofilms to antifungal agents in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39, 2128-2131 (1995).</li><li>Chandra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+by+the+fungal+pathogen+Candida+albicans:+development,+architecture,+and+drug+resistance.">Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance.</a> Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).</li><li>LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+produce+antifungal-tolerant+persister+cells.">Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50, 3839-3846 (2006).</li><li>Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+of+fungal+biofilms.">Microscopy of fungal biofilms.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).</li><li>Woolford, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bypass+of+Candida+albicans+filamentation/biofilm+regulators+though+diminished+expression+of+protein+kinase+Cak1.">Bypass of Candida albicans filamentation/biofilm regulators though diminished expression of protein kinase Cak1.</a> PLoS Genetics. 12, 1006487 (2016).</li><li>Huang, M. Y., Woolford, C. A., May, G., McManus, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+diversification+in+a+biofilm+regulatory+network.">Circuit diversification in a biofilm regulatory network.</a> PLoS Pathogens. 15 (5), 1007787 (2019).</li><li>Ganguly, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zap1+control+of+cell-cell+signaling+in+Candida+albicans+biofilms.">Zap1 control of cell-cell signaling in Candida albicans biofilms.</a> Eukaryotic Cell. 10, 1448-1454 (2011).</li><li>Frisken, G. S., Lanni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+test+of+an+analytical+model+of+aberration+in+an+oil-immersion+objective+lens+used+in+three-dimensional+light+microscopy.">Experimental test of an analytical model of aberration in an oil-immersion objective lens used in three-dimensional light microscopy.</a> Journal of the Optical Society of America. 8, 1601-1613 (1991).</li><li>Lanni, F., Keller, H. E., Yuste, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscope+principles+and+optical+systems.">Microscope principles and optical systems.</a> Imaging, A Laboratory Manual. , 1-55 (2011).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347, 543-548 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35, 757-764 (2017).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+column+and+whole+brain+imaging+with+molecular+contrast+and+nanoscale+resolution.">Cortical column and whole brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution.</a> Science. 363, (2019).</li><li>Carl Zeiss. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Systems+for+the+Microscope+publication+41-101-e.">Optical Systems for the Microscope publication 41-101-e.</a> Carl Zeiss. , 48 (1971).</li><li>Oldham, M., Sakhalkar, H., Oliver, T., Johnson, G. A., Dewhirst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+unsectioned+specimens+for+three-dimensional+imaging+via+optical+transmission+and+emission+tomography.">Optical clearing of unsectioned specimens for three-dimensional imaging via optical transmission and emission tomography.</a> Journal of Biomedical Optics. 13 (2), 021113 (2008).</li></ol>

Авторы не имеют конкурирующих интересов раскрывать.

Candida Albicans является микробный грибок, который, как правило, сопутствующие у людей. Он представляет фундаментальный интерес для биологов, потому что организм имеет множество морфологий. Например, в ответ на определенные экологические сигналы или стрессоры, дрожжевой форме подающий надежды клетки перейдут на нитевидный рост, как перепсечение цепи высокоудлинных клеток, известных как гифы. Переход важен как пример фенотипического выражения перехода между одноклеточной и многоклеточной программой экспрессии генов. Аналогичным образом, C. albicans представляет биомедицинский интерес, поскольку организм является известным оппортунистическим патогеном. Он отвечает за мукозные дрожжевые инфекции, такие как молочница (устный кандидоз), мочеполовой инфекции, и причиной опасных инвазивных или системных инфекций у ослабленных иммунитетом пациентов.
Потенциал вирулентности этого организма тесно связан с его многочисленными морфотипами и другими аспектами его генетической универсальности1,2,3,4. Расширение трубки зародыша, первый видимый этап перехода к росту гифального, происходит с достаточной быстротой, чтобы позволить поглощенные клетки C. albicans вырваться из фагоцитов и тем самым избежать ранней фазы клеточного иммунного ответа хозяина5. Кроме того, нити предшествует и сопровождается большим увеличением клеток к клетке и клеток к поверхности присоединения, что связано с регулируемым выражением нескольких классов белков клеточной стенки, известных как клеи6,7,8,9. В самых разнообразных условиях сочетание присоединения и нити приводит к резкому переходу от планктонного одноклеточного роста к связанного с поверхностью колониального роста, который образует биопленку. Биопленки C. Albicans могут развиваться на обычных имплантированных медицинских устройствах, таких как венозные катетеры. Распространение инфекций может привести, когда такие биопленки начинают бутон от дрожжевой формы клеток и пролить их в циркулирующей крови. Многочисленные исследования показали, что биопленки клетки более устойчивы к противогрибковым препаратам, чем планктонные клетки10,11, которые могут быть отчасти из-за снижения метаболизма12. Кроме того, высокая общая приверженность биопленки может обеспечить якорь, необходимый для эффективного инвазивного роста гифы в ткань хозяина1.
Оптическое прояснение биопленок C. Albicans путем соответствия рефракционного индекса оказало большое влияние на нашу способность визуализировать структуру этого микробного сообщества и обнаружить взаимосвязь между экспрессией генов и фенотипом. Биопленки, выращенные в лаборатории на испытательных поверхностях под жидкой культурой среды для 48 ч появляются как беловатое покрытие, которое достаточно плотное и достаточно толстым, чтобы быть непрозрачным (Рисунок 1). Поэтому многие интересные фенотипические особенности биопленки скрыты от глаз. 24 ч диких биопленок типа, выращенных в YPD, RPMI-1640, или Спайдер среды на 37 градусов по Цельсию диапазоне до 300 мкм толщиной, с 48 ч биопленок часто достигает 500 мкм. Непрозрачность обусловлена рассеянием света, которое возникает из-за рефракционной неоднородности: грибковая клеточная стенка более рефракционна, чем окружающая среда, а цитоплазма немного более рефракционная, чем клеточная стенка. В результате высокой оптической плотности родной биопленки скрывает все структуры более чем на 30 мкм глубиной при просмотре с обычным микроскопом или даже конфокальный сканер (Рисунок 2). Тем не менее, большая степень прояснения может быть достигнуто путем проникновения фиксированных биопленок с высоким рефракционным индексом жидкости, что примерно соответствует рефракции основных клеточных компонентов. После уточнения, визуализация в субмикроном разрешении может быть выполнена путем конфокальной микроскопии через всю толщину практически любого биопленки C. albicans 13. В диких образцах типа, легко увидеть, что биопленки состоят из длинных запутанных гиф, кластеры подающий надежды дрожжевой формы клеток или псевдогифальных клеток, пустоты пространства, и некоторое количество внеклеточной матрицы. Кроме того, биопленки обычно стратифицированы, показывая пространственно вариант морфологических различий в типе клеток, плотности клеток, и наличие подающих надежды или ветвящиеся клетки. Многие вариации в одной или нескольких из этих функций наблюдались в биопленках, разработанных штаммами мутантов14,15. Дополнительно, штаммы репортера показывают на месте пространственные различия в экспрессиигенов 16,9,13. Удивительная степень разъяснения, получаемого с помощью этого относительно простого и недорогого подхода, также позволяет увидеть, что многие биопленки включают апикатические гифы и базальные инвазивные гифы, простирающиеся на миллиметровые расстояния.
В этом протоколе визуализации мы демонстрируем фиксацию, маркировку, разъяснение и визуализацию биопленки C. Albicans с помощью простого маркера клеточной стены в качестве пятна. Происхождение нынешней версии протокола является улучшение ясности мы наблюдали, когда формальдегид фиксированной биопленки были проникли с 97% гликол метакрилат (GMA), который затем полимеризован для встраиваемого биопленки в жесткий пластик, имеющих умеренно высокий рефракционный индекс (n 1.49). Затем мы использовали обычную фазовую контрастную микроскопию и серию рефракционных индексных справочных жидкостей для более точного определения точки разворота контраста (максимальная прозрачность) биопленки(рисунок 3). Для биопленок C. Albicans это произошло близко к n 1.530, что было удивительно высоко, учитывая, что плотная структура белка, такая как кератин волос, лишь немного более рефракционна (1.54-1.55). Хотя это на верхнем конце оптимального диапазона на рисунке 3, мы приняли метил салицилат (масло зимнего зеленого цвета, n 1.537) в текущем протоколе, потому что он уже давно используется в качестве прояснительного агента для микроскопии в эмбриологии и гистологии, он имеет низкую токсичность и низкое давление пара, и он дал отличные результаты в наших испытаниях с использованием умеренно-NA погружения нефти оптики.
Четыре момента должны быть сделаны здесь:
(1) За редким исключением, идеальная ситуация в микроскопии является то, что рефракционный индекс образца должен быть равен рефракционный индекс объективного погружения объектива жидкости17,18,13. Для трехмерных (3D) исследований изображений, где необходима глубокая фокусировка, это всегда важно.
(2) Наш экспериментальный результат для оптимальной очистки (n No 1.525-1.535) немного выше, чем стандартные масла погружения (n 1.515, 1.518) и, следовательно, нарушает точку (1), и таким образом вводит источник сферической аберрации при использовании стандартной масляной оптики погружения. Одним из решений этой проблемы является использование цели, предназначенной для индекса погружения в более высоком диапазоне. Из-за возрождения интереса к образу очищенных образцов, специальные цели с необходимой коррекцией становятся доступными. Другим решением является корректировка индекса прояснения среды до 1,515 или 1,518 путем добавления небольшого количества бутанола (n no 1.399) для оптимальной производительности погружения масла, и принять слегка ухудшившееся ясность.
(3) Микроскопия нетронутых биопленок (и других образцов такого масштаба) требует значительного рабочего расстояния для размещения толщины образца. Это важное практическое соображение. Большое рабочее расстояние ограничивает оптику умеренной численной диафрагмой (NA 0.6-1.25), которая ограничивает разрешение, но также ограничивает тяжесть сферической аберрации.
(4) Оптимальный рефракционный индекс для уточнения может отличаться для других типов фиксированных образцов. Specimens должны быть проверены соответствующим образом с использованием фазового контраста и серии рефракционных индексных справочных жидкостей, как показано на рисунке 3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1043px;" width="1042">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Biohazardous waste receptacle</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Biosafety cabinet with germicidal UV lamp</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol)</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Concanavalin A - Alexafluor-594 or other conjugate</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Distilled water</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>DW</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Distilled water, sterile</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Ethanol, absolute</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Fetal bovine serum (FBS), sterile</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Fixative waste bottle in secondary containment</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:467px;">Formaldehyde 20% in water, ampules</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:467px;">Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37%</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Fume hood</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:467px;">Glutaraldehyde 25% in water, ampules</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Incubator - 30 deg C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Incubator - 37 deg C, with orbital mixer for culture plates</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Isopropanol 70%</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>iPrOH 70%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Longwave (365 nm) UV lamp, 5Watt</td>
			<td style="width:177px;">Cole-Parmer Scientific</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>for curing NOA-61 cement</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:467px;">Medical grade silicone sheet, 0.060&#34; (1.52 mm) thick</td>
			<td style="width:177px;">Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Non-reinforced medical grade silicone sheeting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Methanol 99.9%</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>MeOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Methyl salicylate 99%</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>MS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Millipore Swinnex 13mm white silicone ring gaskets</td>
			<td style="width:177px;">Millipore Corp.</td>
			<td style="width:111px;">SX0001301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:467px;">Norland UV-curing optical adhesive - type NOA-61</td>
			<td style="width:177px;">Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com</td>
			<td style="width:111px;">NOA-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Orbital mixer, benchtop</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Phosphate-buffered saline (PBS), sterile</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:467px;">Refractive index standard liquids, n=1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment)</td>
			<td style="width:177px;">Cargille Laboratories, https://cargille.com</td>
			<td style="width:111px;">Series E</td>
			<td>Cedar Grove, NJ 07009, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Scintillation vials, 20 mL - Wheaton, Urea cap PE cone cap liner</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific Co.</td>
			<td style="width:111px;">03-341-25H</td>
			<td>for specimen processing and storage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Solvent waste bottle in secondary containment</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:467px;">Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol)</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Wheat germ agglutinin - Alexafluor-594 or other conjugate</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:467px;">Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar)</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:467px;">YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose)</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

clarifying and imaging candida albicans biofilms

Микробный грибОк Candida albicans может претерпеть переход от комменсальной колонизации к вирулентности, которая сильно коррелирует с его способностью переключаться с роста дрожжевой формы к росту гифального. Клетки, инициирующих этот процесс, становятся приверженцами поверхностей, а также друг к другу, что приводит к развитию биопленки колонии. Это обычно происходит не только на поверхности слизистой ткани в дрожжевых инфекций, но и на медицинских имплантатов, таких как катетеры. Хорошо известно, что биопленки клетки устойчивы к противогрибковым препаратам, и что клетки, которые проливают из биопленки может привести к опасным системных инфекций. Биопленки варьируются от сильно полупрозрачных до непрозрачных из-за рефракционной неоднородности. Поэтому грибковые биопленки трудно изучать с помощью оптической микроскопии. Чтобы визуализировать внутренние структурные, клеточные и субклеточные особенности, мы разъясняем фиксированные нетронутые биопленки по шаговой части обмена растворителями до точки оптимального соответствия рефракционного индекса. Для биопленк C. albicans, достаточное уточнение достигается с метилсалицилат (n No 1.537), чтобы конфокальная микроскопия от вершины до основания в 600 мкм биопленки с небольшим затуханием. В этом протоколе визуализации мы описываем фазовую контрастную рефрактометрию, рост лабораторных биопленок, фиксацию, окрашивание, обмен растворителя, установку для конфоковой флуоресценции микроскопии и репрезентативные результаты.

Биопленки, такие как на рисунке 1, сильно полупрозрачны до непрозрачных, но обычно проясняются и изображения, используя протокол выше. На рисунке 2 показано сильное затухание флуоресценции с глубиной фокуса в фиксированной биопленки в PBS, по сравнению с той же биопленкой после соответствия индекса. Как показано на рисунке 3, используя последовательно неверные растворители увеличения рефракционного индекса, максимум в ясности можно быстро оценить. Это уточняется с помощью обычной фазовой контрастной микроскопии, чтобы найти точку минимального контраста (максимальная прозрачность). Очевидно, что этот оптимальный показатель не достигается за счет однородного сопоставления индекса. Это связано с тем, что субклеточные структуры немного отличаются рефракционным индексом. В этом случае контрастный разворот произошел в клеточной стенке при несколько более низком индексе растворителя, чем в цитоплазме. Для биопленок Candida Albicans оптимальный торопянин приближается к n и 1.530. 48 ч дикий тип и cak1 DX мутант биопленки на рисунке 4A были 500 мкм в толщину, но дрожжевые клетки в базе были изображены почти так же резко, как апикальные клетки. Аналогичным образом, как показано на рисунке 4C,затухание флуоресценции не сильно коррелирует с глубиной фокусировки. На рисунке 5 показаны инвазивные гифы в агаре, сотни микрометров под поверхностной биопленкой. Зрелые инвазивные гифы последовательно производят боковые подающий надежды дрожжей проксималь к септе в гифальной цепи, что приводит к субколониям дрожжеподобных клеток на регулярной основе вдоль инвазивной гифы.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60718/60718fig1.jpg"> Рисунок 1: Культуры биопленки до уточнения. Биопленка 24 ч, выращенная из изолята дополненного штамма efg1 (' s. s. c. albicans в 12 скважинной пластине на силиконовой площади в жидкой среде RPMI-1640, дополненной 10% FBS. Стерильный пробел находится в колодце C4.  Врез показывает вырезать поперечное сечение 96-часовой биопленки дикого типа, выращенного в 6-колойной пластине на 3,75 мм агар базы в той же среде, показывая инвазивных гиф. Обе панели имеют одинаковый масштаб. Шкала бар 2,0 мм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60718/60718fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60718/60718fig2.jpg"> Рисунок 2: Улучшение глубокой визуализации путем сопоставления индекса. На рисунке показаны боковые проекции конфокальных стеков изображений из биопленки 48-го природного типа, которая была зафиксирована и окрашена ConA-Alexafluor 594. (A) Образец был изображен в PBS с помощью 63x 1.0 NA прямой цель погружения воды. Затухабыло сильное на глубине фокуса 30 мкм. (B) После уточнения протоколом шаги 3.3-3.8, тот же биопленка была изображена в метилсалицилат с минимальным затуханием с использованием 40x 0,85 NA цель погружения масла. После фонового вычитания и боковой проекции 3D-изображений данные 40x были пространственно перемазаированы в соответствии с данными 63x для сравнения. (C) Схема диаграмма, показывающая перевернутое монтаж очищенного образца (от MS) путем передачи ms в черно-анодированной алюминиевой тарелке с зацементированным стеклянным дном крышки (см. Обсуждение). Шкала бар 50 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60718/60718fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60718/60718fig3.jpg"> Рисунок 3: Фазовая контрастная рефрактометрия показывает контрастный разворот клеточных объектов в диапазоне оптимального соответствия индекса. Фиксированные биопленки на крышках были обменены из PBS в метанол, затем в ксилен (n no 1.496). Эти биопленки были затем обменены по одному из ксилена в набор рефракционных индексных справочных жидкостей (Серия E, Лаборатории Cargille, см. Таблица материалов)и визуально изучены бок о бок, чтобы определить диапазон индексов, дающий наивысшую прозрачность. (верхняя панель) Фазовые контрастные изображения: Одна биопленка была последовательно обменяна между ксиленом и узким набором эталонных жидкостей в этом диапазоне. После каждого обмена, то же поле было перемещено и рассматривать, хотя крышка стекла с использованием 40x 0,85 NA Ph2 нефти погружения фазы контрастной цели и Ph2 конденсатор. Все изображения были записаны с той же настройкой лампы и экспозиции камеры для точного отображения изменений. С увеличением индекса разворот контраста впервые наблюдается на n - 1.530 для клеточной стенки, а затем цитоплазме на n й 1.535. Шкала бар 10 мкм. (нижняя панель) График, показывающий минимальную в средней яркости биопленки в точке максимальной прозрачности. Сильное рассеяние света внутри биопленки приводит к тому, что средняя яркость превышает пустое поле. Изолированные ячейки кажутся темнее пустого поля, вплоть до разворота контраста в диапазоне 1.530-1.535. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60718/60718fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60718/60718fig4.jpg"> Рисунок 4: Глубокая визуализация мутантов и диких биопленок типа C. Albicans. Дикий тип штамма (DAY185) и клеточного цикла, связанного с протеиновой киназой уменьшилось напряжение выражения(cak1 DX)14 были выращены при 37 кс для 48 ч на силиконовой субстрате в жидкой среде YPD. Биопленки были зафиксированы, окрашены ConA-Alexafluor 594, и уточнены с помощью протокола обмена растворителя в метилсалицилат. 3D конфокальная микроскопия показала, что оба биопленки были толщиной 500 мкм. Данные изображения были преобразованы в 32-битный формат в ImageJ или Фиджи (https://imagej.nih.gov/ij/ или http://fiji.sc), затем обработаны с помощью функции Subtract Background с 50-пиксельным радиусом подвижного шара, порогом для установки отрицательных пикселей до нуля, перерезыванием и использованием максимальной интенсивности проекции для получения боковых представлений. (A) Осевые и боковые прогнозы: биопленка дикого типа выросла до толщины 502 мкм, как видно из проекции бокового обзора стека 558-plane confocal изображения. Шкала бар 100 мкм. (левые панели рук) 40-plane осевые проекции от вершины (вверх) к базе (внизу) показывают изменение типов клеток в различных слоях биопленки. Этот пример показал характерную структуру дикого типа: клетки адептов в основании приводят к гифы, которые поднимаются в плотную среднюю зону псевдогифальных и дрожжеподобных клеток. Над средней зоной, гифы вновь появились и привели к кластеров подающих надежды дрожжей. Длинные гифы, замеченные в апиальной зоне, вероятно, распространились на культурную среду в живой биопленке, но сложиться на поверхность биопленки во время обработки образцов. Биопленка cak1 DX выросла до толщины 500 мкм, как видно из проекции бокового обзора стека 556-plane изображения. Этот мутант, который, как известно, претерпевает нитевидный рост в отсутствие индуцирующих стрессов14,произвел совершенно иную архитектуру. Как видно как в боковом, так и в осевом прогнозах (панели правой руки), многие ветвящиеся клетки привели к радиальным наростам. (B) Примеры разветвления гифы в cak1 DX биопленки. Шкала бар 10 мкм. (C) Флуоресценция затухания с глубиной в уточнил дикий тип биопленки была количественно путем маскировки из фоновых пикселей, а затем вычисления среднего цифрового сигнала для всех нефоновых пикселей в каждой плоскости изображения. За исключением акических гифок, которые ярко помечены лектином, не было сильной тенденции затухания с глубиной фокуса. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60718/60718fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60718/60718fig5.jpg"> Рисунок 5: Инвазивные гифы в агаре. C. albicans hyphae в поверхностной биопленке будет проникать в агар субстрат на миллиметр расстояния (см. Рисунок 1). После уточнения, инвазивные структуры могут рассматриваться вниз, хотя биопленка, или вверх от нижней части агара. Последнее требует большей рабочей дистанции. Кроме того, после фиксации, но до окрашивания и обмена растворителя, агар может быть сокращен вертикально с кальпелью или лезвием бритвы в 1-2 мм плиты, которые затем могут быть включены на стороне и изображены непосредственно в боковой вид после окрашивания и уточнения. Эта процедура рекомендуется. В этой проекции квадратного поля обзора площадью 213 мкм для кодирования осевого положения на диапазоне 75 мкм: синие объекты находятся рядом, а красные объекты глубже в плоскость страницы. Эта точка зрения показывает, что длинные гифы бутон от боковой дрожжевой формы клеток на полурегулярных интервалах, которые приводят к субколониям. Шкала бар 50 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60718/60718fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms at JoVE.com

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Для просмотра и количественной оценки внутренних особенностей биофильмов Candida Albicans мы готовим нетронутые образцы, которые уточняются с помощью сопоставления рефракционного индекса. Затем оптическая секционная микроскопия может быть использована для получения трехмерных данных изображения, хотя и полной толщины биопленки.

Уточнение и изображение Candida Альбиканс Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

Candida Albicans биопленки, как и многие биологические образцы сильно полупрозрачный непрозрачным в их родном государстве. В этих протоколах мы показываем, что с помощью методов уточнения внутренняя структура фиксированных нетронутых биопленок может быть изображена оптической секциональной микроскопией. С простыми, недорогими и относительно быстрыми шагами обработки, фиксированные нетронутые биопленки могут быть прозрачны для 3D-изображения путем конфокального сканирования микроскопии флуоресценции.Демонстрация этой процедуры сегодня будет Кэти Лагри, пост-докторской исследователь здесь, и я. Чтобы начать рост биопленки в пластине из 12 колодец, подготовь тарелку, как описано в текстовом протоколе. Поместите пластину на орбитальный смеситель 60 об/мин в увлажненные 37 градусов по Цельсию воздушный инкубатор в течение 90 минут, чтобы дать время для клеточной адгезии.Через 90 минут удалите средние и незакрепленные клетки и промойте стерильной средой или PBS. Перенесите привитую субстрату в другую многоясокую пластину, содержащую предварительно разогретую нить среды. Вернуть пластину до 37 градусов по Цельсию увлажненной окружающей воздушной инкубатор и расти биопленки до 48 часов с 60 об / мин орбитального смешивания для аэрации.Извлеки 48-часовую пластину из инкубатора и удалите культурную среду из каждого образца. Замените среду PBS и инкубировать в течение нескольких минут, чтобы разбавить от белков сыворотки. После удаления PBS, пополнить скважины с фиксацией.Достаточный фиксативный объем должен быть добавлен к каждому блюду, чтобы погрузить все биопленки роста, включая любой на внутренней стороне блюда. Установите покрытую тарелку на медленный орбитальный миксер в течение 20 минут. После удаления фиксатора, как описано в текстовом протоколе, подготовиться к окрашивания путем слива PBS и быстро заправки скважин с раствором, содержащим PBS и необходимое пятно.Не позволяйте биопленки стечь или высохнуть в течение более нескольких секунд. Добавить пятно в блюдо. Необходимое количество пятен зависит от массы биопленки.Затем установите покрытую тарелку на медленный орбитальный миксер на ночь и защитите от света фольгой или куском черной бумаги. Используя пинцет, перенесите фиксированную окрашенную биопленку с PBS на пять миллилитров 50/50 PBS-метанола в 20 миллилитровом стеклянном флаконе с биопленкой лицом вверх. Вручную смешивайте с орбитальным движением с интервалом в одну минуту в течение пяти минут.Удалите растворитель в бутылку отходов, будучи осторожным, чтобы избежать контакта между пипеткой и биопленкой или биопленкой и флаконом. Аккуратно заполните тремя миллилитров аккуратного метанола. Вручную смешать с орбитальным движением с интервалом в одну минуту в течение трех минут.Теперь удалите растворитель в бутылку отходов и сразу же пополнить с пятью миллилитров метанола. После ручного смешивания с орбитальным движением с интервалом в одну минуту в течение пяти-десяти минут, удалите растворитель в бутылку отходов. Немедленно пополнить с тремя миллилитров метанола.Биопленки часто выглядят более непрозрачными на данный момент, чем их первоначальный внешний вид. Удалите растворитель в бутылку отходов и немедленно пополнить флакон с пятью миллилитров 50/50 метанол-метил салицилат. Вручную смешивайте с орбитальным движением с интервалом в одну минуту в течение пяти-десяти минут.Биопленка должна быть полупрозрачной в этом смешанном растворители. После удаления растворителя в бутылку отходов, аккуратно пополнить флакон с тремя миллилитров аккуратный метил салицилат. Вручную смешать с орбитальным движением с интервалом в одну минуту в течение трех минут.Повторите процесс снова с пятью миллилитров аккуратный метилсалицилат, вручную смешивания с интервалом в одну минуту в течение пяти до 10 минут. На данный момент биопленка должна быть прозрачной. Удалите растворитель в бутылку отходов и сразу же пополнить флакон с тремя миллилитров аккуратный метилалицилат.Обработанная биопленка стабильна в этом растворители. При использовании перевернутого микроскопа используйте растворительное блюдо, которое имеет дно из стекловолокна, и подготовьте проемы для поддержки перевернутого образца. Здесь, спейсеры 13 миллиметров силиконовые кольца, которые предварительно пропитанной метил салицилатом в течение одного часа, чтобы свести к минимуму фокус дрейфа из-за отеков.Для биопленки на силиконовой площади медицинского класса, инвертировать квадрат и установить его на проем в бассейне метилсалицилат в блюдо. Убедитесь в том, чтобы избежать каких-либо пузырьков ниже образца. Намонтировать блюдо твердо на сцене микроскопа и сделать масло погруженный контакт с целью.Отрегулируйте количество метилсалицилата в блюде так, чтобы мениск крепко удерживает образец на космическом напряжении. Поместите капельку метилсалицилата поверх перевернутого квадратного субстрата, чтобы уменьшить рассеяние света от матовой отделки. Затем накройте блюдо стеклянной тарелкой, чтобы ограничить испарение.Подождите несколько минут, пока образец осядут на spacers до изображения. Теперь выполните конфоканую микроскопию, чтобы издать образец, описанный в текстовом протоколе. Для обработки изображений откройте ImageJ или Фиджи.Проверьте, достаточно ли у программы заданной памяти для обработки данных. Обработка двух гигабайт набора данных требует не менее восьми гигабайт выделенной оперативной памяти для бесперебойной работы. Откройте серийный файл изображения плоскости для обработки.Если компьютер не имеет достаточной оперативной памяти для обработки всего стека, подстаки могут быть обработаны, а затем собраны в один стек. Преобразование данных в 32-битный формат для обеспечения плавающих точечных арифметических операций с использованием меню изображения, типа, 32-битного. Это удвоит размер файла.Вычесть гладкий фон, чтобы увеличить контрастность функций фокусировки. Обработать весь стек, переориентируемся на процесс меню, вычесть фон. При необходимости отрегулируйте радиус подвижного шара.Радиус шара должен быть значительно больше, чем самое большое измерение функций фокусировки, которые должны быть сохранены. Чтобы установить все отрицательные пиксели до нуля, добавьте каждое изображение к его абсолютному значению. Во-первых, дублировать стек с помощью меню изображений, дублировать, дублировать стек.Затем возьмите абсолютное значение дублированных данных, используя меню процесса, математику, абсолютное значение. Добавьте два стека, переехав для обработки меню, калькулятор изображений, добавьте. Чтобы аксиально повторно использовать стек изображений, используйте меню изображений, стеки, reslice.Затем выберите интервал выходных данных 1.0, начните с верхней части и избегайте интерполяции. Ось фокусировки теперь является вертикальной оси в стеке. Y-размер повторного стека равен количеству плоскостей фокусировки.Чтобы сделать проекцию бокового просмотра части или всего стека, перейдите в меню изображений, стеки, проект q. Установите стартовый срез и стоп-кусок, чтобы включить некоторые или все плоскости бокового вида. Выберите максимальную интенсивность для получения наилучших результатов.Исправь осяное масштабирование проекции бокового вида, переориентируясь на меню изображений, масштаб. Проекция должна быть исправлена для неравного пикселизации плоскости изображения и фокусировки с использованием фактора масштаба ося. Установите X-шкалу до одной и установите шкалу Y для фактора аксиальной шкалы.Выберите бикубическую интерполяцию. Выберите создать новое окно. Отрегулируйте яркость и контрастность.Затем перейти на восьми-битный формат для отображения. Кроме того, нанесите таблицу цветового осмотра и сохраните RGB или восьмибитный цвет. Используя последовательно ошибочные растворители увеличения рефракционного индекса, можно быстро оценить максимум ясности.Это уточняется обычной фазовой контрастной микроскопией, чтобы найти точку минимального контраста. Одна биопленка была последовательно обменена между ксиленом и узким набором эталонных жидкостей в этом диапазоне. После каждого обмена одно и то же поле было перемещено и просмотрено через стекло.С увеличением индекса, разворот контраста впервые наблюдается, когда n равен 1.530 для клеточной стенки, а затем цитоплазма, когда n равен 1.535. Глубокое изображение мутантов и диких биопленок C.albicans показано здесь. Биопленка дикого типа выросла до толщины 502 микрон, как видно из проекции бокового вида стека конфокальных изображений плоскости 538.Осяные проекции от вершины к основанию показывают изменение типов клеток и различных слоев биопленки. В этом примере показана характерная структура дикого типа. Биопленка мутанта выросла до толщины 500 микрон, как видно на проекции бокового вида стека изображения плоскости 556.Этот мутант, как известно, претерпевает нитеозный рост в отсутствие вызывающих стрессоров производится резко иной архитектуры. Как видно как в боковом обзоре, так и в осяных проекциях, многие ветвяющиеся клетки дают возможность радиальных нароев. Это протокол глубокого изображения высокого рефракционного индекса.В идеале рефракционный индекс образца и рефракционный индекс масла погружения должны соответствовать. Поэтому в данном случае мы используем цель погружения в нефть. Большинство наших исследований были структурные изображения биопленок с использованием маркеров клеточной стенки, но любой метод флуоресценции, который используется с фиксированными образцами должны работать в том числе иммунофлуоресценции, флуоресценции на месте гибридизации, и экспрессии гена репортера.Этот конкретный организм, Candida albicans, является commensal у здоровых людей, но также оппортунистический патоген, который может вызвать слизистые или системные инфекции дрожжей. В некоторых учреждениях требуются методы и протоколы сдерживания BSL II. Кроме того, фиксаторы формальдегида и глутаральдегида являются летучими и опасными.Они известны канцерогенами. Составляют разбавления фиксаторов в дымовой капот. Храните посуду, содержащую разбавленные фиксаторы, и не поместьте контейнеры, содержащие эти фиксаторы, в шкаф для биобезопасности или в инкубатор культуры клеток.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

96 Ну планшет метода, основанного на формировании мониторинга и тестирования Противогрибковые Восприимчивость Candida Albicans Биопленки

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Изучение микробных сообществ<em&gt; В Vivo</em&gt;: Модель узла опосредованного взаимодействия между<em&gt; Candida Albicans</em&gt; И<em&gt; Синегнойной палочки</em&gt; В Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Логометрический визуализации внеклеточного рН в зубных биопленок

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Визуализация биопленки в Candida albicans с помощью автоматизированных Microfluidic устройства

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Глубокий дермальный инъекции как модель кожи инфекции Candida albicans для гистологического анализа

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Ежедневные фототерапии с красный свет для регулирования Candida albicans биопленки роста

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Визуализация Candida Albicans в Желудочно-кишечном тракте Мурина с использованием флуоресцентных в ситу гибридизации

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Ex vivo Assay для изучения Candida Albicans Hyphal Morphogenesis в желудочно-кишечном тракте

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Роза Бенгал-Опосредованная Фотодинамическая Терапия для ингибирования Candida albicans

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

Растворимый редукционный анализ на основе тетразолия для оценки влияния антител на биопленки Candida tropicalis

Candida species are the fourth-most common cause of systemic nosocomial infections. Systemic or invasive candidiasis frequently involves biofilm formation ...