Förtydligande och Imaging Candida albicans Biofilms

Candida albicans biofilmer som många biologiska exemplar är kraftigt genomskinliga till ogenomskinliga i sitt hemland. I dessa protokoll visar vi att med hjälp av förtydligande metoder, kan den interna strukturen av fasta intakta biofilmer avbildas genom optisk snittning mikroskopi. Med enkla, billiga och relativt snabba bearbetningssteg kan fasta intakta biofilmer göras transparenta för 3D-avbildning genom konfokal skanningsfluorescensmikroskopi.

Visar detta förfarande i dag kommer att Katie Lagree, en post-doktor här, och jag själv. För att börja biofilmtillväxt i en 12-brunnsplatta, förbered plattan enligt beskrivningen i textprotokollet. Placera plattan på en 60 RPM orbital mixer i en befuktad 37 grader Celsius luft inkubator i 90 minuter för att ge tid för celladhesion.

Efter 90 minuter, ta bort medium och obundna celler och tvätta med sterilt medium eller PBS. Överför det inokulerade substratan till en annan fler brunnsplatta som innehåller förvättat glödtrådsmedium. Återgå plattan till 37 grader Celsius befuktade omgivande luft inkubator och växa biofilmer upp till 48 timmar med 60 RPM orbital blandning för luftning.

Hämta 48-timmarsplattan från inkubatorn och ta bort odlingsmediet från varje preparat. Ersätt mediet med PBS och inkubera i flera minuter för att späda bort serumproteiner. Efter att du har tagit bort PBS fyller du på brunnarna med fixativt.

Tillräcklig fixerande volym bör läggas till varje maträtt för att sänka ner all biofilmtillväxt inklusive eventuella på de inre sidorna av skålen. Ställ in den täckta skålen på en långsam orbital mixer i 20 minuter. När du har tagit bort fixativet enligt beskrivningen i textprotokollet, förbered dig för färgning genom att dränera bort PBS och snabbt fylla på brunnarna med en lösning som innehåller PBS och den nödvändiga fläcken.

Låt inte biofilmen rinna av eller torka mer än några sekunder. Lägg fläcken till skålen. Den beskad mängd fläck beror på biofilm massa.

Ställ sedan in den täckta skålen på en långsam orbital mixer över natten och skydda mot ljus med folie eller en bit svart papper. Med hjälp av pincett överför du den fasta färgade biofilmen från PBS till fem milliliter 50/50 PBS-metanol i en 20 milliliter glasflaska med biofilmen uppåtriktad. Blanda manuellt med orbitalrörelse med en minuts intervall i fem minuter.

Ta bort lösningsmedlet till en avfallsflaska som är försiktig för att undvika kontakt mellan pipetten och biofilmen eller biofilmen och injektionsflaskan. Fyll försiktigt på med tre milliliter nätt metanol. Blanda manuellt med orbitalrörelse med en minuts intervall i tre minuter.

Nu tar bort lösningsmedlet till en avfallsflaska och omedelbart fylla på med fem milliliter metanol. Efter manuell blandning med orbitalrörelse med en minuts intervall i fem till 10 minuter, avlägsna lösningsmedlet till avfallsflaskan. Omedelbart påfyllning med tre milliliter metanol.

Biofilmer ser ofta mer ogenomskinliga på denna punkt än deras ursprungliga utseende. Ta bort lösningsmedlet till avfallsflaskan och fyll genast på injektionsflaskan med fem milliliter på 50/50 metanol-metylsaliylat. Blanda manuellt med orbitalrörelse med en minuts intervall i fem till 10 minuter.

Biofilmen ska vara halvgenomskinlig i detta blandade lösningsmedel. Efter att lösningsmedlet har avlägsnats till en avfallsflaska, fyll försiktigt på injektionsflaskan med tre milliliter nätt metylsaliylat. Blanda manuellt med orbitalrörelse med en minuts intervall i tre minuter.

Upprepa processen igen med fem milliliter snyggt metylsalicylat, manuellt blandning med en minuts mellanrum i fem till 10 minuter. Vid denna punkt bör biofilmen vara transparent. Ta bort lösningsmedlet till avfallsflaskan och fyll genast på flaskan med tre milliliter nätt metylsaliylat.

Den bearbetade biofilmen är stabil i detta lösningsmedel. Om du använder ett inverterat mikroskop, använd en lösningsmedelssäker rätt som har en täckglasbotten och bereda distanser för stöd av det inverterade preparatet. Här är distanser 13 millimeter silikonringar som är pre-indränkt i metylsalicylat i en timme för att minimera fokusdrift på grund av svullnad.

För en biofilm på en medicinsk kvalitet silikon kvadrat, invertera torget och ställ den på en distans i en pool av metylsalicylat i skålen. Se till att undvika eventuella bubblor under preparatet. Montera skålen ordentligt på scenen i mikroskopet och gör olja nedsänkt kontakt med målet.

Justera mängden metylsalicylat i skålen så att menisken håller preparatet stadigt ner på distansen genom ytspänning. Placera en droppe metylsalicylat ovanpå det inverterade fyrkantiga substratumet för att minska ljusspridning från den matta finishen. Täck sedan skålen med en glasskiva för att begränsa avdunstning.

Vänta i flera minuter så att preparatet lägger sig på distanserna före avbildningen. Nu, utför konfokalmikroskopi för att avbilda exemplaret som beskrivs i textprotokollet. Om du vill bearbeta bilderna öppnar du ImageJ eller Fiji.

Kontrollera att programmet har tillräckligt tilldelat minne för att data ska kunna bearbetas. Bearbetning av en två gigabyte datauppsättning kräver minst åtta gigabyte av dedicerat RAM-minne för en smidig drift. Öppna den serieplansbildfil som ska bearbetas.

Om datorn har otillräcklig RAM för att bearbeta hela stacken, kan delsackar bearbetas och sedan återmonteras till en enda stack. Konvertera data till 32-bitars format för att aktivera flyttal aritmetiska operationer med hjälp av bildmenyn, typ, 32-bitars. Detta kommer att fördubbla filstorleken.

Subtrahera den jämna bakgrunden för att öka kontrasten av in-focus funktioner. Bearbeta hela stacken genom att navigera till processmenyn, subtrahera bakgrund. Justera rullande kulradie om det behövs.

Kulradien bör vara betydligt större än den största dimensionen av de i-fokus-funktioner som ska bevaras. Om du vill ange alla negativa pixlar till noll lägger du till varje bild till dess absolutvärde. Först duplicera stacken med hjälp av bildmeny, duplicera, duplicera stacken.

Ta sedan det absoluta värdet av de duplicerade uppgifterna med hjälp av processmeny, matematik, absolut värde. Lägg till de två staplarna genom att navigera till processmenyn, bildkalkylatorn, lägg till. För att axiellt reslice bilden stacken, använd bildmeny, stackar, reslice.

Välj sedan utmatningsavstånd 1.0, börja överst och undvik interpolation. Fokusaxeln är nu den lodräta axeln i stapeln. Den reslicerade stackens Y-dimension är lika med antalet fokusplan.

För att göra en sidovy projektion av vissa eller alla av stacken, navigera till bildmenyn, stackar, Z-projekt. Ange start slice och stoppa segmentet så att du inkluderar några eller alla sidovyplan. Välj max intensitet för bästa resultat.

Korrigera axiell skalning av sidovyprojektionen genom att navigera till bildmenyn, skala. Projektionen måste korrigeras för den ojämlika bildplanets pixelering och fokusinkring med hjälp av den axiella skalfaktorn. Ställ in X-skalan på en och ställ in Y-skalan på axiell skalfaktor.

Välj bikubisk interpolation. Välj skapa nytt fönster. Justera ljusstyrka och kontrast.

Konvertera sedan till åtta-bitars format för visning. Alternativt kan du använda en färguppslagstabell och spara som RGB eller åttabitars färg. Med hjälp av serievist förspbara lösningsmedel av ökande brytningsindex kan det maximala i tydlighetet snabbt uppskattas.

Detta förfinas genom konventionell faskontrastmikroskopi för att hitta punkten för minsta kontrast. En biofilm utbyttes seriellt mellan xylen och en smal uppsättning referensvätskor i det intervallet. Efter varje utbyte flyttades samma fält och sågs genom ett coverglass.

Med ökande index ses kontrastomkastning först när n är lika med 1,530 för cellväggen, följt av cytoplasman när n är lika med 1,535. Djup avbildning av mutant och vild typ C.albicans biofilmer visas här. Den vilda typen biofilm växte till en tjocklek av 502 mikrometer som ses i sidovy projektion av 538 plan confocal bildstack.

Axiella projektioner från apex till bas visar variationen i celltyper och olika skikt av biofilmen. Det här exemplet visar karakteristisk vild typstruktur. Den muterade biofilm växte till en tjocklek av 500 mikrometer som ses i sidovy projektion av 556 plan bild stacken.

Denna mutant kända för att genomgå fintrådig tillväxt i avsaknad av inducerande stressfaktorer produceras en dramatiskt annorlunda arkitektur. Som man ser i både sidovy och axiella projektioner ger många förgrenande celler upphov till radiella utväxt. Detta är en hög brytningsindex deep imaging protokoll.

Helst bör brytningsindex för exemplaret och brytningsindex för nedsänkningsolja matcha. Därför använder vi i detta fall ett mål för oljebad. De flesta av våra studier har strukturella avbildning av biofilmer med cellvägg markörer, men alla fluorescens metod som används med fasta exemplar bör fungera inklusive immunofluorescens, fluorescens i situ hybridisering och reporter genuttryck.

Denna särskilda organism, Candida albicans, är commensal hos friska människor, men är också en opportunistisk patogen som kan orsaka mucosal eller systemiska jäst infektioner. Vid vissa institutioner krävs BSL II inneslutningsmetoder och protokoll. Dessutom är formaldehyd och glutaraldehyd fixativ flyktiga och farliga.

De är kända cancerframkallande ämnen. Gör upp utspädningar av fixeringsmedel i en draghuva. Förvara disk som innehåller utspädda fixeringsmedel täckta och inte sätta behållare som innehåller dessa fixativ i en biosäkerhet skåp eller i en cellodling inkubator.