Name: clarifying and imaging candida albicans biofilms
Uploaded: 2020-03-06T13:00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms at JoVE.com

Bu araştırma kısmen NIH'nin A.P. Mitchell'a R01 AI067703, R21 AI100270 ve R21 AI135178'i bağışlayarak desteklenmiştir. Yazarlar Greenfield 'Kip' Sluder için uzun çalışma mesafesi petrol daldırma amacı bu çalışmada kullanılan sağlamak için minnettar, ve Daniel Shiwarski doğrudan metil salisilat daldırma ile konfokal mikroskopi için.

1. Biyofilm Kültürlerinin Gelişimi
DİkKAT: Candida albicans bir insan patojenidir. Bazı kurumlarda, bu organizmanın kültürü BSL-2 çevreleme gerektirir.
<ol><li>Bir maya ekstresi-peptone-dekstroz (YPD) agar plaka üzerinde seçilen gerginlik dışarı çizgi ve 30 °C'de 48 h büyür.</li>
	<li>30 °C'de bir gecede aerobik büyüme (dönen rotator, 52-55 rpm) için 15 mL kültür tüpünde 5 mL YPD ortamı aşılamak için plakadan tek koloniler seçin.</li>
	<li>Hücre yoğunluğunu gecelik kültürün 40 ila 50 kat seyreltilmesini kullanarak belirleyin. Hücre yoğunluğunu silikon substrat için 3 x 106 hücre/mL'ye veya konkanavalin-A (ConA) veya buğday mikrobu agglutinin (WGA) ile işlenmiş kapak cam yüzeyleri için 0,6-1,2 x 106 hücre/mL'ye getirmek için gereken seyreltme faktörünü hesaplayın (Bkz. Tartışma).</li>
	<li>12 kuyu plakasında(Şekil 1)biyofilm büyümesi için, her kuyuya 2,0 mL steril ipliksilasyon ortamı dağıtın ve tabağı nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37 °C'ye ısıtın. Çeşitli ortamlar, daha yüksek bir sıcaklıkta (37 °C) ve ilave serumla daha güçlü bir şekilde filamentasyona neden olur. Fetal sığır serumu (FBS) önerilir. Önerilen ortamlar YPD, Spider-Mannitol veya RPMI-1640'tir.</li>
	<li>Steril cımbız ile, ısıtılmış plaka her kuyu içine hazırlanmış bir substrat yerleştirin ve kabarcıklar yerinden. Her kuyuda adım 1.3'te önerilen hücre yoğunluğuna ulaşmak için gece kültüründen inoculum ekleyin. Inoculum olmadan bir kuyu kontaminasyona karşı görsel bir boşluk ve kontrol görevi görehizmet vermektedir.</li>
	<li>Hücre yapışması için zaman tanımak için 90 dakika boyunca nemlendirilmiş 37 °C hava kuvözde 60 rpm orbital mikser üzerine plaka yerleştirin. 90 dakika sonra, orta ve bekar hücreleri çıkarın, steril orta veya fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve kültür yemekleri veya önceden ısıtılmış filamentasyon orta içeren başka bir çok kuyu plaka içine aşılanmış substrat yerleştirin. Çok kuyulu plakalar ile, yıkama adımı için ikinci bir plaka ve yıkanmış aşılanmış substrat almak için kuyu başına önceden ısıtılmış orta 2.0 mL ile üçüncü bir plaka kullanmak çok uygundur. Her transferden önce cımbızları sterilize edin.</li>
	<li>Plakayı 37 °C nemlendirilmiş ortam-hava kuluçka makinesine geri döndürün ve biyofilmleri havalandırma için 60 rpm orbital karıştırma ile 48 saate kadar büyütün. Gelişmekte olan biyofilm maya formu hücreleri döken sürece her kültürde çok az planktonik büyüme olmalıdır. Bu şekilde yetiştirilen bir biyofilm Şekil 1'degösterilmiştir.</li>
</ol>2. Görüntüleme için Numune İşleme
DİkKAT: Aldehit fiksatifler uçucu ve tehlikelidir. Bir gaz kaputunda fiksatif seyreltme hazırlayın, biyogüvenlik kabininde değil. Canlı hücreler için kullanılan kuvözlere fiksatif koymayın. Bir duman başlık veya iyi havalandırılmış tezgah alanında kapalı yemekler de seyreltilmiş fiksatifler ile çalışın. Fiksatifleri ve düzeltme sonrası yıkama çözümlerini tehlikeli atık olarak atın.
<ol><li>PBS'de isteğe bağlı olarak %2'ye kadar glutaraldehit ile taze fiksatif, %4 formaldehit veya paraformaldehit hazırlayın. Formalin% 4 seyreltilmiş rutin çalışma için kullanılabilir. NOT: Özellikle glutaraldehit geniş bant otofloresansını artıracak ve dTomato gibi ifade edilebilir etiketlerin floresansını azaltabilir.</li>
	<li>Kültür ortamını numuneden çıkarın ve serum proteinlerini seyreltmek için PBS ile değiştirin veya substratumdaki biyofilmi birkaç dakikalığına PBS'ye aktarın.</li>
	<li>Numuneyi fiksatif olarak aktarın ve kapalı tabağı 20 dakika boyunca yavaş bir orbital mikser üzerine ayarlayın. Daha kalın numuneleri işlerken süreyi uzatın (Bkz. Tartışma). Yemeğin iç tarafları da dahil olmak üzere tüm biyofilm büyümesini batırmak için her çanağa yeterli fiksatif hacim eklenmelidir.</li>
	<li>Fiksatif çıkarın ve artık fiksatif yıkamak için PBS ile çanak yeniden doldurun. Fiksatifi tehlikeli atık olarak atın. Birkaç kısa süreli yıkar, sonra daha uzun biyofilm veya agar blok dışarı yaymak için artık fiksatif için zaman sağlamak için yıkar. Yıkama süresi fiksasyon için izin verilen süreye bağlıdır (bkz. Tartışma).</li>
	<li>Gerekli leke miktarı biyofilm kütlesine bağlıdır. Boyama dan önce kültür yemeğinin numune olmayan alanlarından tüm biyofilm çıkarın veya boyama öncesinde yeni bir çanak içine sabit örnek aktarın. Biyofilmin kurumasını veya kurumasını izin vermeyin.  PBS'e daldırın.</li>
	<li>Çanak leke ekleyin (Tartışma bakınız) ve bir gecede yavaş bir yörünge karıştırıcı üzerinde kapalı çanak ayarlayın (Tartışma bakınız). Işıktan koruyun.</li>
	<li>Sabahları, boyama çözeltisini çıkarın ve bağlanmamış lekeyi seyreltmek için yemeği PBS ile doldurun. Birkaç saat için destain yavaş orbital karıştırıcı üzerinde bulaşıkları ayarlayın.</li>
</ol>3. Açıklama Protokolü: Impermeant Substrat üzerine Biyofilmler
<ol><li>Açıklığa kavuşturulmuş biyofilmleri görsel olarak ayırt etmek zordur. Bu nedenle, istenirse, aşılama için yan belirlemek için bir çizik ile her substrat bir tarafı işaretleyin.</li>
	<li>Çözücülerin çapraz kontaminasyonunu önlemek için sonraki tüm atık lar ve çözücü transferleri için etiketli uzun Pasteur pipetleri kullanın.</li>
	<li>Cımbız kullanarak, sabit biyofilmi PBS'den 5 mL'ye 5mL 50:50 PBS:metanol 20 mL cam şişede biyofilm yukarı bakacak şekilde aktarın. 5 dk için 1 dk aralıklarla orbital hareket ile manuel olarak karıştırın (Tartışma bakınız).</li>
	<li>Pipet ve biyofilm veya biyofilm ve şişe arasında temas önlemek için dikkatli olmak, bir atık şişesi için çözücü çıkarın. 3 mL temiz metanol ile yavaşça doldurun. 3 dk için 1 dk aralıklarla orbital hareket ile manuel olarak karıştırın.</li>
	<li>Çözücüü bir atık şişesine çıkarın ve hemen 5 mL metanol ile doldurun. 5-10 dk. 5-10 dakika boyunca 1 dk aralıklarla orbital hareketile elle karıştırın. Biyofilmler genellikle ilk görünüm daha bu noktada daha opak görünüyorsun.</li>
	<li>Çözücüü atık şişesine çıkarın ve şişeyi hemen 50:50 metanol:metil salisilat 5 mL ile doldurun. 5-10 dk için 1 dk aralıklarla orbital hareket ile manuel olarak karıştırın. Biyofilm bu karışık çözücüde yarı saydam olmalıdır.</li>
	<li>Çözücüden atık şişeye çıkarın. Şişeyi 3 mL temiz metil salisilat (MS) ile yavaşça doldurun. 3 dk için 1 dk aralıklarla orbital hareket ile manuel olarak karıştırın.</li>
	<li>Çözücüü atık şişesine çıkarın ve 5 mL temiz MS ile hemen doldurun. Bu noktada, biyofilm şeffaf olmalıdır. Çözücüü atık şişesine çıkarın ve şişeyi hemen 3 mL temiz MS ile doldurun. İşlenmiş biyofilm bu çözücüde stabildir.</li>
	<li>Agar biyofilmler için (Tartışma bakınız) agar rağmen su ve solvent difüzyon için izin vermek için tüm değişim süreleri uzatmak. Solventin agar'a ilerlemesini görmek için karanlık alan aydınlatmalı düşük güçlü bir kesme mikroskobu kullanılarak gerekli zaman dilimleri tahmin edilebilir. Protokol iyi bir açıklama ve% 2 agar kullanıldığında hiçbir büyük büzülme etkileri elde, ancak netleştirilmiş agar cımbız ile işleme sırasında sıkılırsa yoğuşacak. Spatula kullanılması önerilir.</li>
</ol>4. Konfokal Mikroskopi için Görüntüleme Kurulumu
<ol><li>Aşağıdaki adımlar ters mikroskop kullanımı içindir. Ters numuneyi mikroskop aşamasında tutmak için kapak cam alt olan solvent geçirmez bir çanak kullanın (Bkz. Tartışma).</li>
	<li>Uzay adaylarını ters numuneyi desteklemeye hazırlayın. Mikroskop slaytlarından (1.000 μm kalınlığında), kapak gözlüklerinden (170 μm) veya 13 mm silikon halkalardan (330 μm, Malzeme Tablosunabakınız) gerektiği gibi istiflenebilir küçük dikdörtgenler kullanın. Şişme nedeniyle odak sürüklenme en aza indirmek için 1 saat için metil salisilat halkaları önceden ıslatın.</li>
	<li>Bir tıbbi sınıf silikon kare üzerinde bir biyofilm için, kare ters (yani, biyofilm aşağı çevirmek) ve çanak metil salisilat bir havuzda bir boşluk üzerine ayarlayın(Şekil 2). Numunenin altında herhangi bir kabarcıklar önlemek için emin olun.</li>
	<li>Tabağı mikroskop un sahnesine sıkıca monte edin ve yağın amaç ile temas kurup kurmasını sağlayabilir (bkz.</li>
	<li>Çanaktaki MS miktarını, menisküsün yüzey gerilimine göre numuneyi uzay makinesinde sıkıca tutması için ayarlayın. Mat yüzeyden gelen ışık saçılımını azaltmak için ters kare substratumun üzerine bir MS damlası yerleştirin ve buharlaşmayı sınırlamak için yemeği cam bir plakayla kaplayın. Görüntülemeden önce numunenin boşluklara yerleşmesi için birkaç dakika bekleyin.</li>
	<li>Görüntü alanını görsel olarak incelemek ve ters biyofilmin apikal ve bazal bölgelerine göre geçerli odak konumunu bulmak için iletilen ışığı kullanın. Kontrastı artırmak için kondansatör aydınlatıcı sayısal diyafram açıklığını (INA) minimuma (kondansatör irisini kapatın) ayarlayın, aksi takdirde açıklığa kavuşturulan biyofilm neredeyse görünmez olacaktır. Bittiğinde, iletilen ışık kaynağını kapatın.</li>
	<li>Konfokal floresan'a geçin ve biyofilmi kapamak için gereken seri odaklama görüntü yığınının alt ve üst sınırlarını ayarlayın. Yukarı odak sürücü adım, hangi tavsiye edilir, ilk kapak cam ve cam üzerinde istirahat olan çok uzun apikal hyphae üzerine yerleşmiş yerinden hücreleri gösterecektir. Dizinin üst ucunda, kurucu hücreler biyofilmin tabanındaki substratuma yapıştı lar. İğne deliği çapını, görüntü düzlemindeki piksel aralığını ve Tartışma'da özetlenen genel ölçütleri kullanarak odak adım artışını ayarlayın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Desai, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+Candida+albicans+invasion+and+infection+functions+by+phosphoglycerol+phosphatase+Rh2.">Coordination of Candida albicans invasion and infection functions by phosphoglycerol phosphatase Rh2.</a> Pathogens. 4, 573-589 (2015).</li><li>Miram&#243;n, P., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feast+for+Candida:+Metabolic+plasticity+confers+an+edge+for+virulence.">A feast for Candida: Metabolic plasticity confers an edge for virulence.</a> PLoS Pathogens. 13 (2), 1006144 (2017).</li><li>Bonhomme, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+glycolytic+flux+and+hypoxia+adaptation+to+efficient+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Contribution of the glycolytic flux and hypoxia adaptation to efficient biofilm formation by Candida albicans.</a> Molecular Microbiology. 80, 995-1013 (2011).</li><li>Ram&#237;rez-Zavala, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Snf1-activating+kinase+Sak1+is+a+key+regulator+of+metabolic+adaptation+and+in+vivo+fitness+of+Candida+albicans.">The Snf1-activating kinase Sak1 is a key regulator of metabolic adaptation and in vivo fitness of Candida albicans.</a> Molecular Microbiology. 104, 989-1007 (2017).</li><li>Westman, J., Moran, G., Mogavero, S., Hube, B., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+hyphal+expansion+causes+phagosomal+membrane+damage+and+luminal+alkalinization.">Candida albicans hyphal expansion causes phagosomal membrane damage and luminal alkalinization.</a> mBio. 9, 01226 (2018).</li><li>Finkel, J. S., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+Candida+albicans+biofilm+development.">Genetic control of Candida albicans biofilm development.</a> Nature Reviews Microbiology. 9, 109-118 (2011).</li><li>Finkel, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+Candida+albicans+adherence+regulators.">Portrait of Candida albicans adherence regulators.</a> PLoS Pathogens. 8, 1002525 (2012).</li><li>de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesins+in+human+fungal+pathogens:+glue+with+plenty+of+stick.">Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick.</a> Eukaryotic Cell. 12, 470-481 (2013).</li><li>Lagree, K., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+Biofilms:+Inside+Out.">Fungal Biofilms: Inside Out.</a> Microbiology Spectrum. 5, (2017).</li><li>Hawser, S. P., Douglas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+of+Candida+albicans+biofilms+to+antifungal+agents+in+vitro.">Resistance of Candida albicans biofilms to antifungal agents in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39, 2128-2131 (1995).</li><li>Chandra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+by+the+fungal+pathogen+Candida+albicans:+development,+architecture,+and+drug+resistance.">Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance.</a> Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).</li><li>LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+produce+antifungal-tolerant+persister+cells.">Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50, 3839-3846 (2006).</li><li>Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+of+fungal+biofilms.">Microscopy of fungal biofilms.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).</li><li>Woolford, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bypass+of+Candida+albicans+filamentation/biofilm+regulators+though+diminished+expression+of+protein+kinase+Cak1.">Bypass of Candida albicans filamentation/biofilm regulators though diminished expression of protein kinase Cak1.</a> PLoS Genetics. 12, 1006487 (2016).</li><li>Huang, M. Y., Woolford, C. A., May, G., McManus, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+diversification+in+a+biofilm+regulatory+network.">Circuit diversification in a biofilm regulatory network.</a> PLoS Pathogens. 15 (5), 1007787 (2019).</li><li>Ganguly, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zap1+control+of+cell-cell+signaling+in+Candida+albicans+biofilms.">Zap1 control of cell-cell signaling in Candida albicans biofilms.</a> Eukaryotic Cell. 10, 1448-1454 (2011).</li><li>Frisken, G. S., Lanni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+test+of+an+analytical+model+of+aberration+in+an+oil-immersion+objective+lens+used+in+three-dimensional+light+microscopy.">Experimental test of an analytical model of aberration in an oil-immersion objective lens used in three-dimensional light microscopy.</a> Journal of the Optical Society of America. 8, 1601-1613 (1991).</li><li>Lanni, F., Keller, H. E., Yuste, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscope+principles+and+optical+systems.">Microscope principles and optical systems.</a> Imaging, A Laboratory Manual. , 1-55 (2011).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347, 543-548 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35, 757-764 (2017).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+column+and+whole+brain+imaging+with+molecular+contrast+and+nanoscale+resolution.">Cortical column and whole brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution.</a> Science. 363, (2019).</li><li>Carl Zeiss. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Systems+for+the+Microscope+publication+41-101-e.">Optical Systems for the Microscope publication 41-101-e.</a> Carl Zeiss. , 48 (1971).</li><li>Oldham, M., Sakhalkar, H., Oliver, T., Johnson, G. A., Dewhirst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+unsectioned+specimens+for+three-dimensional+imaging+via+optical+transmission+and+emission+tomography.">Optical clearing of unsectioned specimens for three-dimensional imaging via optical transmission and emission tomography.</a> Journal of Biomedical Optics. 13 (2), 021113 (2008).</li></ol>

Yazarların ifşa etmek için rekabet eden çıkarları yok.

Optik kesit, çözünürlük, hız, kaçınma veya sapma, çok kanallı edinim ve bilgi işlem gücünde floresan mikroskopideki gelişmeler, sağlam örneklerin görüntülenmesinde yeniden canlanmaya neden olmaktadır. Sabit numuneler için, hem klasik hem de yeni açıklama ve genişletme yöntemleri büyük bir etkisi olmuştur19,20,21,22,23,24. Bu durumda, opak olarak aşırı yarı saydam olan mantar biyofilmlerinin yapısını incelemek için hızlı ve basit bir solvent bazlı indeks eşleştirme yaklaşımı uyguladık.
Önceki protokoller çeşitli örneklerle test edilmiştir. Laboratuvarımızda Candida albicans biyofilmler en sık tıbbi sınıf silikon kauçuk bir levha kesilmiş 14 mm kareler üzerinde yetiştirilen (Malzeme Tablosubakınız). Bu substratum, sıvı kültür ortamına batık PDMS (poli-dimethylsiloxane) büyüme tıbbi implantlar ile ilişkili enfeksiyonlar için önemli bir in vitro model olarak kurulmuştur, çünkü kullanılır, özellikle indwelling kateterler. Filamentasyonu başlatan stresli hücreler PDMS gibi polar olmayan yüzeylere hızlı bir şekilde yapışır. Uygulamada, otoklavda (kuru çevrim) temizlenmiş ve yeniden sterilize edilmiş kullanılan kareler, herhangi bir tür için en tutarlı biyofilmleri verir. Biyofilmler de yaygın kapak gözlük, kapak cam alt kültür yemekleri, standart bakteriyolojik sınıf polistiren yemekler ve agar yetiştirilir. C. albicans hücreleri cam iyi yapışmaz çünkü, kapak gözlük hücre duvarı polisakkaritler bağlayacak bir lektin ile tedavi edilmelidir. Steril suya 40 mg/mL 1 mgL ConA veya WGA uygularız. Kuruduktan sonra, kapak gözlükleri proteini çözünmez bir filme bağlamak için 3 dk boyunca %1 glutaraldehit 40 μL ile tedavi edilir. Daha sonra fiksatif ve herhangi bir çözünür lektin kaldırmak ve hava kurutulmuş steril distile su ile yıkanır. Gerekirse, tedavi kapak bardakları veya bulaşıkları 10 dakika boyunca mikrop öldürücü UV lambası altında yeniden sterilize edilir.
Numune kalınlığı protokollerde gerekli kuluçka sürelerini etkileyecektir. 300 μm biyofilm içine fiksatif difüzyon dengelemek için birkaç dakika gerektirir. Bu süre numune kalınlığının karesi olarak artar ve 2-3 mm kalınlığında olabilecek çok kalın biyofilmler veya agar blok numuneleri için bir saat veya daha fazla uzatılmalıdır. Boyama için denge süresi de sabitleme ve yıkama için açıklandığı gibi numune kalınlığına bağlıdır. Ancak, lektinler düşük MW fiksatifler daha yavaş yayılır çünkü, özellikle bir agar jel içinde, boyama bir gecede uzatılmalıdır. Aynı aşırı leke yıkama için yapılmalıdır.
Protokollere çeşitli tipte lekeler dahil edilebilir. Biz yapısal görüntüleme için bir hücre duvarı lekesi kullanın, en yaygın Calcofluor Beyaz M2R (Flor. Aydınlatıcı #28) veya ConA-Alexafluor 594 veya WGA-Alexafluor 594 gibi boya etiketli lektin. Proteinin değerine dikkat edilmelidir. ConA tetramer bir biyofilm apikal bölgede son derece esnek hyphae crosslinking neden olabilir. Bu WGA dimer ile daha az belirgindir. Bu belirteçlerin kanonik özellikleri kitin için Calcofluor, mannose artıkları için ConA ve N-asetil-D-glukozamin ve siyalik asit kalıntıları için WGA'dır.
Çözücü değişim protokolü PBS veya su metil salisilat içine metanol rağmen dereceli olduğundan, numune kapları solvent dayanıklı olmalıdır. Metil salisilat (MS) hızlı polistiren plastik ve yavaş yavaş diğer plastik yumuşatmak yumuşatır. Protokol, düzgün metanol kullanımına kadar plastik olarak yapılabilir, ancak protokoldeki bu noktada genellikle solvente dayanıklı vida kapakları ile standart 20 mL cam ışıltılı şişelere geçeriz. Kareler alınıp ince cımbızkullanılarak aktarılabildiği için şişeler silikon kare substrat üzerindeki biyofilmler için uygundur. Ayrıca, bir şişe drene edilebilir ve biyofilm cam temas etmez, böylece iç kavisli yüzey üzerinde istirahat düz kare ile doldurulur. Substratum dik şişeye daldırıldığında biyofilm-up olmalıdır. Şişeler uzun süreli numune depolamaiçin mükemmeldir.
Açıklama protokolünde, daha fazla dereceli solvent değişim adımları solvent karıştırma etkileri nedeniyle numune deformasyonu riskini en aza indirir. Temel protokolde hız ve rahatlık için dört adım vardır: 1) adım 3.3, PBS için 50:50 PBS:metanol; 2) adımlar 3.4 ve 3.5, PBS:metanol düzgün metanol, 3) adım 3.6, 50:50 metanol için düzgün metanol:MS; ve 4) adımlar 3.7 ve 3.8, metanol:MS düzgün MS. Metanol geçiş miscibility sağlar. Ancak, su ve MS neredeyse immiscible olduğundan, tüm su herhangi bir MS giriş önce metanol tarafından yerinden olması esastır. artık metanolbuharlaşması numune içinde kırılma indisi varyasyonları neden olacaktır. Dört adım sırası içinde, düzgün çözücü başka bir değişiklik, hatta üçüncü bir değişiklik ekleyerek ikinci ve dördüncü adımları tekrarlama, tavsiye edilir. Özellikle kırılgan numuneler için çözücü değişimleri daha küçük yüzde basamaklarda formüle edilebilir.
Agar blok örnekleri ile, adımlar 3.4 ve 3.5 (düzgün metanol) metanol artık PBS tuzları çözünmezlik nedeniyle agar içinde tuz kristallerinin görünümünü neden olabilir. Bu su sırasında tuzları seyreltmek için PBS yerine ilk karışık çözücü adımda distile su (DW) kullanılarak önlenebilir: metanol değişimi. Sabit biyofilmler için alternatif solvent değişim sırası sonra şu adımlardan oluşur: 1) adım 3.3, 50:50 DW:metanol içine PBS örnek transferi (agar yoluyla difüzyon için ekstra zaman sağlar); 2) adım 3.4, 50:50 DW:metanol düzgün metanol içine örnek transferi (adım 3.5 gibi metanol ile 2x tekrarlayın); 3) adım 3.6, 50:50 metanol için metanol örnek transferi:metil salisilat; ve 4) adım 3.7, 50:50 metanol:MS temiz MS (adım 3.8 gibi MS ile 2x tekrar) için örnek aktarın.
Metil salisilat hızlı bir şekilde polistiren plastik yumuşatır çünkü, ters bir mikroskop aşamasında açıklık biyofilm tutmak için bir kapak cam alt ile anodize alüminyum çanak kullanın. Kapak camı UV küroptik çimento kullanılarak yerinde tutulur (Norland Optik Yapıştırıcı #61, Malzeme Tablosu'nabakınız). MS izopropanol ile sabunlu su ve durulama ardından bulaşık yıkayarak günün sonunda kaldırılır sağlanan, çimentolu kapak cam aylarca hizmet verecek.
Küresel sapmayı en aza indirmenin önemi ve yeterli çalışma mesafesi ihtiyacı nedeniyle, açıklığa kavuşturulmuş örneklerin büyük ölçekli görüntülemesinde objektif lens seçimi kritik öneme sahiptir. Bu çalışmalarda üç hedefle tecrübemiz var. Ters mikroskop kurulumunda, kapak camı üzerindeki çanakta metil salisilata batırılmış biyofilm ile kapak camı nın altına batırılmış uzun bir çalışma mesafesi, orta sayısal diyafram (NA) nesnel yağ kullanıyoruz. Çalışmalarımızın çoğu zeiss Universal serisi akromatik hedefi, tip 461708, 40x 0.85NA Oel 160/1.5, nominal sonsuz eşlenik (IC) uyumluluğu için negatif 160 mm odak uzaklığı adaptörü ile yapılmıştır. Bu amaç başlangıçta 0,35 mm çalışma mesafesi25ile 1,5 mm mikroskop slaytlar ile yağ daldırma görüntüleme için tasarlanmıştır. Standart bir kapak camı (0,17 mm) ile kullanıldığında çalışma mesafesi çok daha fazladır: 1,5 + 0,35-0,17 = 1,68 mm = 1,680 m. Ayrıca yeni bir Zeiss çoklu daldırma hedefi, tip 420852, 25x 0.8NA LD LCI Plan-apochromat 540 μm aşan bir çalışma mesafesi ile, daldırma düzeltme 'yağ' yüksek tarafına ayarlanmış kullanın. Bu amaç son derece düzeltilmiş ve mükemmel bir görüntü üretir. Dik bir mikroskop standında, yeni bir Nikon çoklu daldırma hedefi, MRD71120 tipi, 5.000 μm (5 mm) çalışma mesafesi ile 10x 0.5NA CFI Plan-apochromat, ayrıca 'yağ' (n = 1.518) yüksek tarafına daldırma düzeltme ile kullandık. Bu hedef diğerlerinden daha düşük bir NA'ya sahip olsa da, metil salisilata doğrudan daldırılmak avantajına sahiptir.
Hız ve çözünürlük açısından veri alımını optimize etmek için, konfokal mikroskop ayarları ideal hem enine hem de eksenel Nyquist örnekleme yoğunlukları18karşılanmalıdır. Konvansiyonel kriterleri kullanarak, confocal iğne deliği çapını nominal olarak 1 Havadar üniteye ayarlayın. Büyütülmüş koordinatlarda,
dP (μm) = 1,22 x büyütme x (μm'de emisyon dalga boyu) / NA
Enine örnekleme (piksel aralığı) x Abbe'nin çözünürlük sınırını (1/2) aşmamalıdır. Nesne-uzay koordinatlarında,
(nm'de emisyon dalga boyu) / (4 NA)
Eksenel örnekleme (odak artış) ters eksenel bant genişliğini aşmamalı,
≥z = (daldırma indeksi) x (nm'de emisyon dalga boyu) / (NA2)
Konfokal optik sistem mikroskobun bant genişliğini genişletir ve hem enine hem de eksenel çözünürlüğü en az 1/√2 ile keskinleştirir.
En sık yararlandığımız 40x 0.85 NA hedefi için, 600 nm emisyon dalga boyu için bu formüllerin sonuçları için Tablo 1'e bakınız (Alexa Fluor 594).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Formül</td>
			<td>x 1/√2</td>
			<td>set (tipik)</td>
		</tr>
<tr>
<td>dP (μm)</td>
			<td>34,5 μm</td>
			<td>-</td>
			<td>25 veya 50 m</td>
		</tr>
<tr>
<td>(x), (y)</td>
			<td>176 nm</td>
			<td>125 nm</td>
			<td>161 nm</td>
		</tr>
<tr>
<td>≥z</td>
			<td>1200 nm</td>
			<td>848 nm</td>
			<td>900 nm</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: 600 nm emisyon dalga boyu için konfokal iğne deliği çapı, enine örnekleme ve eksenel örnekleme değerleri.
Bu ayarlara sahip bir dönen disk konfokal tarayıcı sı ve 1.392 x 1.040 piksel lik bir tbmkografi alanı kullanılarak, biyofilm örneklerinden elde edilen veriler makul hız ve çözünürlükte elde edilebilir. Tipik tek renkli 3B görüntü yığınları 0,35-1,55 GB çalıştırın.
Geniş kullanımda açıklama ortamı önemli bir kırılma indeks aralığına yayılır. Darkfield aydınlatma ve görsel inceleme ile, sabit C. albicans biyofilm n = 1.5 üzerinde en şeffaf olduğunu bulundu. Bu durum faz kontrast mikroskobu ile n = 1.530-1.535'e kadar rafine edilmiştir. Bir dizi pratik nedenden dolayı, son indeks eşleştirme çözücü olarak metil salisilat (n = 1.537) kullanıyoruz. Solvent değişimi numune deformasyonu veya diğer objeler riskini getirse de, sabit, netleştirilmiş numunelerde bulunan hücreler canlı numuneler gibi benzer hücre gövdesi boyutlarına, hypha çapına ve interseptal uzunluk boyutlarına sahiptir.
Solvent değişim sürecinde birçok varyasyon mümkündür (örneğin, farklı bir geçiş çözücü kullanarak, ya da farklı bir son çözücü). Metanol yüksek polarite ve hızlı difüzyon için seçildi, ancak etanol daha iyi kırmızı floresan protein korumak için gösterilmiştir (RFP) kuantumverimi 26 bir geçiş çözücü olarak. Metil salisilat indeks, orta polarite, düşük buhar basıncı ve birçok leke, boya ve floresan proteinile uyumluluk için seçilmiştir. Ancak, biraz daha düşük indeksli son bir çözücü, ya da metil salisilat karışımı ve daha düşük indeks çözücü, butanol gibi, daha iyi hizmet verebilir.
Beklenmedik bir şekilde, bir biyofilm aracılığıyla görmek yeteneği sadece tabakalaşmış iç özellikleri ortaya koymaktadır, ama aynı zamanda bazı substrat üzerinde uzun, unentangled apikal hyphae ve invaziv bazal hyphae gibi genişletilmiş yapıların kökeni görüntüleme yardımcı olur. C. albicans fırsatçı virülans genetik çok yönlülük bağlıdır (yani, hiphal büyüme geçiş, hücre substratum ve hücre-hücre bağlılığı upregulation, hücre tomurcuklanma ve uzama için osmolit üretimi, ve alternatif besin lerin kullanımı). Hipür uzantısı fagositik bağışıklık hücrelerinden bireysel C. albicans hücrelerinin koparma sağlar ama aynı zamanda invazyon için gereklidir. Biyofilm yapışma ve hiphal dolaşıklık, hyphae'nin bir substratumu verimli bir şekilde istila etmesi için gerekli yüzey demirlemesini sağlar. Bu substratum konak doku olduğunda, artan virülans neden olabilir.
Sağlam biyofilmlerin görüntülenmesi, gen ekspresyonu, model doku substratı ve doğal biyofilmlerde bulunan bakteriler gibi diğer organizmaların dahil edilmesi için muhabir suşlarını kullanan çok sayıda bilgilendirici deney yapılmasını sağlar. Hücre duvarı lekesi ile tamamen yapısal görüntüleme basit durumda bile, yerinde fenotipler daha sonra sayısal ve genetik olarak analiz edilebilir ortaya çıkar.

Candida albicans genellikle insanlarda kommenson bir mikrobiyal mantardır. Biyologlar için temel bir ilgi alanıdır çünkü organizmanın birden fazla morfolojisi vardır. Örneğin, bazı çevresel ipuçları veya stres yanıt olarak, maya-form tomurcuklanma hücreleri hyphae olarak bilinen yüksek uzun hücrelerin septating zincirleri olarak ipliksi büyümeye geçecektir. Geçiş tek hücreli ve çok hücreli gen ekspresyonu programı arasında bir geçiş in selotipik ifade bir örnek olarak önemlidir. Aynı şekilde, C. albicans biyomedikal ilgi çünkü organizma iyi bilinen fırsatçı patojen. Pamukçuk (oral kandidiaz), genitoüriner enfeksiyonlar ve immünolojik olarak zayıflamış hastalarda tehlikeli invaziv veya sistemik enfeksiyonların bir nedeni gibi mukozal mantar enfeksiyonları sorumludur.
Bu organizmanın virülans potansiyeli yakından çoklu morfotipleri ve genetik çok yönlülükdiğeryönleri ilebağlantılıdır 1 ,2,3,4. Mikrop tüpü uzantısı, hyphal büyümesine geçişin ilk görünür aşaması, yeterli hızla oluşur yuttu C. albicans hücreleri fagositler kırmak ve böylelikle konak hücresel bağışıklık yanıtının erken bir faz kaçmak sağlamakiçin 5. Ayrıca, filamentasyon öncesinde ve hücre-hücre ve hücreden yüzeye bağlılık büyük bir artış ile birlikte olan hücre duvarı proteinleri çeşitli sınıfların düzenlenmiş ifade nedeniyle adhesins olarak bilinen6,7,8,9. Çok çeşitli koşullar altında, bağlılık ve filamentasyon kombinasyonu planktonik dramatik bir kayma ile sonuçlanır, tek hücreli büyüme bir biyofilm oluşturan yüzey ilişkili sömürge büyüme. C. albicans biyofilmler venöz kateterler gibi yaygın implante tıbbi cihazlarda gelişebilir. Bu tür biyofilmler maya-form hücreleri kapalı tomurcuk ve dolaşan kan içine döken başladığında disemine enfeksiyonlar neden olabilir. Birden fazla çalışma biyofilm hücrelerinin planktonik hücrelerden daha antifungal ilaçlara karşı daha dirençli olduğunu göstermiştir10,11, kısmen düşük metabolizma nedeniyle olabilir12. Ayrıca, bir biyofilmin yüksek genel yapışma ev sahibi doku içine hyphae verimli invaziv büyüme için gerekli çapa sağlayabilir1.
C. albicans biyofilmlerinin kırılma indisi eşleştirmesi ile optik olarak açıklanması, bu mikrobiyal topluluğun yapısını görselleştirme ve gen ekspresyonu ile fenotip arasındaki ilişkileri keşfetme yeteneğimiz üzerinde büyük bir etkiye sahiptir. Laboratuvarda 48 saat sıvı kültür ortamı altında test yüzeylerinde yetiştirilen biyofilmler, opak olacak kadar yoğun ve kalın beyazımsı bir kaplama olarak görünürler (Şekil 1). Bu nedenle, biyofilmin birçok ilginç henotik özellikleri görünümden gizlidir. YPD, RPMI-1640 veya Örümcek ortamda 37 °C'de 300°C kalınlığında yetiştirilen 24 saatlik yabani tip biyofilmler, 48 h biyofilm genellikle 500 μm'ye ulaşır. Opaklık, kırılma heterojenitesinden kaynaklanan ışık saçılımından kaynaklanmaktadır: mantar hücre duvarı çevredeki ortama göre daha kırılmaz ve sitoplazma hücre duvarından biraz daha kırılır. Yerli bir biyofilmin ortaya çıkan yüksek optik yoğunluğu, geleneksel bir mikroskop ve hatta konfokal tarayıcı ile bakıldığında 30 μm'den daha derin olan tüm yapıları gizler (Şekil 2). Ancak, yaklaşık büyük hücresel bileşenlerin kırılması eşleşen yüksek kırılma indeksli sıvı ile sabit biyofilmler sızma ile açıklama büyük ölçüde elde edilebilir. Açıklama dan sonra, submikron çözünürlüğünde görüntüleme hemen hemen her C. albicans biofilm13tüm kalınlığı ile konfokal mikroskopi ile yapılabilir. Yabani tip örneklerde, biyofilmlerin uzun dolaşmış hyphae, tomurcuklanmış maya-form hücreleri veya psödohyphal hücreleri kümeleri, boşluk boşluklar ve hücre dışı matris bir miktar oluşur görmek kolaydır. Ayrıca, biyofilmler genellikle tabakalaşmış, hücre tipi, hücre yoğunluğu ve tomurcuklanma veya dallanma hücrelerinin varlığı mekansal varyant morfolojik farklılıklar gösteren. Bu özelliklerin bir veya daha fazla birçok varyasyonmutant suşları tarafından geliştirilen biyofilmlerde gözlenmiştir14,15. Ayrıca, muhabir suşları gen ekspresyonunda mekansal farklılıklar gösterir16,9,13. Bu nispeten basit ve ucuz yaklaşım ile elde edilen açıklama şaşırtıcı derecesi de birçok biyofilm milimetre mesafelere uzanan apikal hyphae ve bazal invaziv hyphae içerdiğini görmek mümkün kılar.
Bu görselleştirme protokolünde, basit bir hücre duvarı işaretleyicisini leke olarak kullanarak C. albicans biyofilminin düzeltilmesini, etiketlendiğini, açıklamasını ve görüntülendiğini gösteriyoruz. Protokolün mevcut versiyonunun kökeni, formaldehit-sabit biyofilmlerin %97 glikol metakrilat (GMA) ile sızdığı zaman gözlemlediğimiz ve biyofilmi orta derecede yüksek kırılma indisi olan sert bir plastikle yerleştirmek için polimerize edilen geliştirilmiş netliktir (n = 1.49). Daha sonra biyofilmin kontrast tersine çevirme noktasını (maksimum saydamlık) daha doğru bir şekilde belirlemek için konvansiyonel faz kontrast mikroskobu ve bir dizi kırılma indisi referans sıvısı kullandık (Şekil 3). C. albicans biyofilmleri için bu durum n = 1.530'a yakın meydana geldi ve saç keratini gibi yoğun bir protein yapısının sadece biraz daha kırılması (1.54-1.55) olduğu düşünülürse şaşırtıcı derecede yüksekti. Şekil 3'tekioptimal aralığın üst ucunda olmasına rağmen, uzun zamandır embriyoloji ve histolojide mikroskopi için açıklayıcı bir ajan olarak kullanıldığı için mevcut protokolde metil salisilat (wintergreen yağı, n = 1.537) benimsedik, düşük toksisite ve düşük buhar basıncına sahip ve orta-NA yağı daldırma optikleri kullanarak denemelerimizde mükemmel sonuçlar verdi.
Dört puan burada yapılmalıdır:
(1) Birkaç istisna dışında, mikroskopide ideal durum, numunenin kırılma indeksi objektif lens daldırma sıvısı17,18,13kırılma indisi eşit olmalıdır . Derin odaklamanın gerekli olduğu üç boyutlu (3D) görüntüleme çalışmaları için bu her zaman önemlidir.
(2) Optimal temizleme için deneysel sonuç (n = 1.525-1.535) standart daldırma yağları (n = 1.515, 1.518) biraz daha yüksek ve bu nedenle noktası ihlal (1) ve böylece standart yağ daldırma optik kullanırken küresel sapma kaynağı tanıttı. Bu sorunun bir çözümü, daha yüksek aralıktaki bir daldırma dizini için tasarlanmış bir hedefin kullanılmasıdır. Temizlenmiş numunelerin görüntülenmesine olan ilginin yeniden canlanması nedeniyle, gerekli düzeltmeile özel hedefler kullanıma sunulmuştur. Diğer çözüm, optimum yağ daldırma performansı için az miktarda butanol (n = 1,399) ekleyerek 1,515 veya 1,518'e kadar olan açıklığa kavuşturulan ortamın indeksini ayarlamak ve biraz bozulmuş netliği kabul etmektir.
(3) Bozulmamış biyofilmlerin (ve bu ölçekteki diğer örneklerin) mikroskopisi, numune kalınlığını karşılamak için önemli bir çalışma mesafesi gerektirir. Bu önemli bir pratik husustur. Uzun çalışma mesafesi optikleri, çözünürlüğü sınırlayan ancak küresel sapmanın şiddetini de sınırlayan ılımlı bir sayısal diyafram açıklığıyla (NA = 0.6-1.25) sınırlar.
(4) Açıklama için optimal kırılma indisi diğer sabit numune türleri için farklı olabilir. Örnekler, Şekil 3'tegösterildiği gibi faz kontrastı ve bir dizi kırılma indisi referans sıvısı kullanılarak buna göre test edilmelidir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1043px;" width="1042">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Biohazardous waste receptacle</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Biosafety cabinet with germicidal UV lamp</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol)</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Concanavalin A - Alexafluor-594 or other conjugate</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Distilled water</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>DW</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Distilled water, sterile</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Ethanol, absolute</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Fetal bovine serum (FBS), sterile</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Fixative waste bottle in secondary containment</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:467px;">Formaldehyde 20% in water, ampules</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:467px;">Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37%</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Fume hood</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:467px;">Glutaraldehyde 25% in water, ampules</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Incubator - 30 deg C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Incubator - 37 deg C, with orbital mixer for culture plates</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Isopropanol 70%</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>iPrOH 70%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Longwave (365 nm) UV lamp, 5Watt</td>
			<td style="width:177px;">Cole-Parmer Scientific</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>for curing NOA-61 cement</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:467px;">Medical grade silicone sheet, 0.060&#34; (1.52 mm) thick</td>
			<td style="width:177px;">Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Non-reinforced medical grade silicone sheeting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Methanol 99.9%</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>MeOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Methyl salicylate 99%</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>MS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Millipore Swinnex 13mm white silicone ring gaskets</td>
			<td style="width:177px;">Millipore Corp.</td>
			<td style="width:111px;">SX0001301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:467px;">Norland UV-curing optical adhesive - type NOA-61</td>
			<td style="width:177px;">Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com</td>
			<td style="width:111px;">NOA-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Orbital mixer, benchtop</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Phosphate-buffered saline (PBS), sterile</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:467px;">Refractive index standard liquids, n=1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment)</td>
			<td style="width:177px;">Cargille Laboratories, https://cargille.com</td>
			<td style="width:111px;">Series E</td>
			<td>Cedar Grove, NJ 07009, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Scintillation vials, 20 mL - Wheaton, Urea cap PE cone cap liner</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific Co.</td>
			<td style="width:111px;">03-341-25H</td>
			<td>for specimen processing and storage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Solvent waste bottle in secondary containment</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:467px;">Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol)</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Wheat germ agglutinin - Alexafluor-594 or other conjugate</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:467px;">Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar)</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:467px;">YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose)</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

clarifying and imaging candida albicans biofilms

Mikrobiyal mantar Candida albicans güçlü bir şekilde hiphal büyüme için maya formu büyüme geçiş yeteneği ile ilişkili virülans commenal kolonizasyon bir değişiklik uğrayabilir. Bu süreci başlatan hücreler, bir biyofilm kolonisinin gelişmesiyle birlikte yüzeylere ve birbirlerine yapışırlar. Bu genellikle mantar enfeksiyonlarında mukozal doku yüzeylerinde değil, kateterler gibi tıbbi implantlarda da görülür. Biyofilm hücrelerinin antifungal ilaçlara dirençli olduğu ve biyofilmden dökülen hücrelerin tehlikeli sistemik enfeksiyonlara yol açabileceği bilinmektedir. Biyofilmler kırılma heterojenliğine bağlı olarak ağır yarı saydamdan opaklığa kadar değişmektedir. Bu nedenle, mantar biyofilmleri optik mikroskopi ile çalışmak zordur. İç yapısal, hücresel ve hücre altı özellikleri görselleştirmek için, sabit bozulmamış biyofilmleri adım adım çözücü değişimi ile optimum kırılma indisi eşleştirme noktasına netleştiririz. C. albicans biyofilmleri için, az zayıflama ile 600 μm biyofilmde apeksten baza konfokal mikroskopiyi sağlamak için metil salisilat (n = 1.537) ile yeterli açıklama elde edilir. Bu görselleştirme protokolünde faz kontrastrefraktometrisi, laboratuvar biyofilmlerinin büyümesi, fiksasyon, boyama, solvent değişimi, konfokal floresan mikroskopi nin kurulumu ve temsili sonuçlar sıralanmaktadır.

Şekil 1'deki gibi biyofilmler ağır şekilde opak yarı saydamdır, ancak yukarıdaki protokol tarafından rutin olarak açıklığa kavuşturulur ve görüntülenir. Şekil 2, pbs sabit bir biyofilmde odak derinliği ile floresan güçlü zayıflama gösterir, indeks eşleştirme sonra aynı biyofilm ile karşılaştırıldığında. Şekil 3'tegösterildiği gibi, kırılma indeksi artan seri olarak yanlış çözücüler kullanılarak netlik olarak maksimum hızla tahmin edilebilir. Bu minimum kontrast noktası (maksimum şeffaflık) bulmak için konvansiyonel faz kontrast mikroskobu ile rafine edilir. Bu optimum homojen indeks eşleştirme ile elde olmadığı açıktır. Bunun nedeni, hücre altı yapıların kırılma indeksi olarak biraz farklılık gösterir olmasıdır. Bu durumda, kontrast ters hücre duvarında sitoplazmadan biraz daha düşük bir çözücü indeksi oluştu. Candida albicans biyofilmleri için optimum n = 1.530'a yakın gerçekleşir. Şekil 4A'daki 48 h yabani tip ve cak1 DX mutant biyofilm kalınlığı 500 μm olmasına rağmen, tabandaki maya hücreleri apikal hücreler kadar keskin bir şekilde görüntülendi. Aynı şekilde, Şekil 4C'degösterildiği gibi, floresan zayıflaması odak derinliği ile güçlü bir şekilde ilişkili değildi. Şekil 5 agar içinde invaziv hyphae gösterir, bir yüzey biyofilm altında mikrometre yüzlerce. Olgun invaziv hyphae sürekli hyphal zincirinde septa lateral tomurcuklanan maya proksimal üretmek, invaziv bir hypha boyunca düzenli aralıklarla maya benzeri hücrelerin subcolonies yol açan.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60718/60718fig1.jpg"> Şekil 1: Açıklama öncesi biyofilm kültürleri. RPMI-1640 sıvı ortamda 12 kuyu plakac12 kuyu plakac1 c. albicans tamamlayıcı efg1 bir izolasyon bir izole yetiştirilen bir 24 h biyofilm% 10 FBS ile desteklenmektedir. Steril boş iyi C4 olduğunu.  Inset, aynı ortamda 3,75 mm'lik agar tabanında 6 kuyulu bir plaka içinde yetiştirilen 96-hr vahşi tip biyofilmin invaziv hyphae'yi gösteren kesitini gösterir. Her iki panel de aynı ölçekte. Ölçek çubuğu = 2,0 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60718/60718fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60718/60718fig2.jpg"> Şekil 2: Derin görüntülemenin indeks eşleştirme ile iyileştirilmesi. Şekil sabit ve ConA-Alexafluor 594 ile boyanmış bir 48 h vahşi tip biyofilm konfokal görüntü yığınları yan görüş projeksiyonları gösterir. (A) Örnek PBS'de 63x 1.0 NA doğrudan su daldırma hedefi kullanılarak görüntülendi. Zayıflama 30 μm odak derinliğinde şiddetliydi. (B) Protokol adım 3.3-3.8 ile açıklığa kavuşturulduktan sonra, aynı biyofilm 40x 0.85 NA yağ daldırma hedefi kullanılarak minimal zayıflama ile metil salisilat olarak görüntülendi. 3B görüntü yığınlarının arka plan çıkarma ve yan görünüm projeksiyonundan sonra, 40x verileri karşılaştırma için 63x verileriyle eşleşecek şekilde uzamsal olarak yeniden ölçeklendirildi. (C) Çimentolanmış cam alt kısmı olan siyah anodize alüminyum bir çanak içinde MS'e aktarılarak temizlenmiş numunenin (MS'den) ters monte edildiğini gösteren şematik diyagram (Bkz. Tartışma). Ölçek çubuğu = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60718/60718fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60718/60718fig3.jpg"> Şekil 3: Faz kontrastrefraktometrioptimum indeks eşleştirme aralığında hücresel özellikleri kontrast ters gösterir. Kapak gözlüklü sabit biyofilmler PBS'den metanole, sonra ksilene (n = 1.496) değiştirildi. Bu biyofilmler daha sonra ksilenden birer adet kırılma indisi referans sıvısına (Seri E, Cargille Laboratuvarları, bkz. Malzeme Tablosu)dönüştürüldü ve en yüksek saydamlık sağlayan indeks aralığını belirlemek için yan yana incelendi. (üst panel) Faz kontrast görüntüleri: Bir biyofilm seri olarak ksilen ve bu aralıktaki dar bir referans sıvı kümesi arasında değiş tokuş edildi. Her değişimden sonra, aynı alan 40x 0.85 NA Ph2 yağ daldırma fazı kontrast hedefi ve Ph2 kondansatör kullanılarak bir kapak camı olsa değiştirildi ve izlendi. Tüm görüntüler, değişiklikleri doğru bir şekilde görüntülemek için aynı lamba ayarı ve kamera pozlama ile kaydedildi. Artan indeksle, kontrast tersi ilk olarak hücre duvarı için n = 1.530'da görülür, bunu n = 1.535'te sitoplazma takip eder. Ölçek çubuğu = 10 μm. (alt panel) Maksimum saydamlık noktasında ortalama biyofilm parlaklığında minimum değeri gösteren grafik. Biyofilm içinde ışığın güçlü saçılması, ortalama parlaklığın boş alanı aşmasını neden olur. Yalıtılmış hücreler boş alandan daha koyu görünür, 1.530-1.535 aralığında kontrast ters kadar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60718/60718fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60718/60718fig4.jpg"> Şekil 4: Mutant ve yabani tip C. albicans biyofilmlerinin derin görüntülemesi. Yabani tip bir suşu (DAY185) ve hücre döngüsüne bağlı protein kiazazekspresyon(cak1 DX)14 sıvı YPD ortasında silikon substrat üzerinde 48 saat için 37 °C'de yetiştirildi. Biyofilmler, ConA-Alexafluor 594 ile boyanmış ve metil salisilat içine solvent değişim protokolü kullanılarak açıklığa kavuşturuldu. 3D konfokal mikroskopi her iki biyofilmin ~500 μm kalınlığında olduğunu gösterdi. Görüntü verileri ImageJ veya Fiji'de (https://imagej.nih.gov/ij/ veya http://fiji.sc) 32 bit formatına dönüştürüldü, ardından 50 piksellik yuvarlanan top yarıçapı ile Arka Plan'ı Çıkarma işlevi kullanılarak işlendi, negatif pikselleri sıfıra ayarlamak için eşik, reslicing ve yan görünümler üretmek için maksimum yoğunluklu projeksiyon kullanılarak işlendi. (A) Eksenel ve yan görüş projeksiyonları: Yabani tip biyofilm, 558 düzlemli konfokal görüntü yığınının yan görünüm projeksiyonunda görüldüğü gibi 502 μm kalınlığa kadar büyüdü. Ölçek çubuğu = 100 μm. (sol el panelleri) apeksten (üstten tabana) 40 düzlemli eksenel projeksiyonlar biyofilmin farklı katmanlarındaki hücre tiplerinin değişimini gösterir. Bu örnek, karakteristik yabani tip yapısını gösterdi: tabandaki yapışık hücreler, psödohyphal ve maya benzeri hücrelerin yoğun bir orta bölgesine yükselen hyphae'ye yol açar. Orta bölgenin üzerinde, hyphae yeniden ortaya çıktı ve tomurcuklanan maya kümeleri yol açtı. Apikal bölgede görülen uzun hyphae muhtemelen yaşayan biyofilm kültür ortamına genişletilmiş, ancak numune işleme sırasında biyofilm yüzeyine katlanmış. Cak1 DX biyofilm, 556 düzlemli görüntü yığınının yan görüş projeksiyonunda görüldüğü gibi 500 μm kalınlığa kadar büyüdü. Bu mutant, hangi indükleyen stresler yokluğunda ipliksi büyüme geçmesi bilinmektedir14, dramatik bir şekilde farklı bir mimari üretti. Hem yan görünümde hem de eksenel projeksiyonlarda (sağ el panellerinde) görüldüğü gibi, birçok dallanma hücresi radyal çıkıntılara yol açmıştır. (B) Cak1 DX biyofilm içinde dallanma hyphae örnekleri. Ölçek çubuğu = 10 μm. (C) Açıklık vahşi tip biyofilmde derinlik ile floresan zayıflaması arka plan pikselleri maskeleyerek ölçüldü, sonra her görüntü düzlemindeki tüm arka plan dışı pikseller için ortalama dijital sinyal hesaplandı. Parlak lektin tarafından etiketlenmiş apikal hyphae dışında, odak derinliği ile güçlü zayıflama eğilimi yoktu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60718/60718fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60718/60718fig5.jpg"> Şekil 5: Agar. C. albicans hyphae bir yüzey biyofilmde invaziv hyphae milimetre mesafelerine bir agar substratu nüfuz edecek (Şekil 1bakınız). Açıklamadan sonra, invaziv yapılar biyofilm olsa aşağı doğru veya agarAlt tarafında yukarı görülebilir. İkincisi daha fazla çalışma mesafesi gerektirir. Alternatif olarak, fiksasyon dan sonra ancak boyama ve çözücü değişiminden önce, agar neşter veya jiletle dikey olarak kesilebilir ve bu levhalar 1-2 mm'lik levhalara dönüştürülebilir ve boyama ve açıklamadan sonra doğrudan yan görünümde görüntülenebilir. Bu yordam önerilir. 213 μm karelik bir görüş alanının bu projeksiyonunda, eksenel konumu 75 m aralığında kodlamak için gökkuşağı renk skalası kullanılmıştır: mavi özellikler yakındır ve kırmızı özellikler sayfanın düzleminin daha derinlerindedir. Bu görünüm, uzun hyphae tomurcuk subcolonies yol açan yarı düzenli aralıklarla lateral maya-form hücreleri kapalı gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60718/60718fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms at JoVE.com

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Candida albicans biyofilmlerinin iç özelliklerini görüntülemek ve ölçmek için, kırılma indisi eşleştirmesi ile açıklığa kavuşturulan sabit bozulmamış numuneler hazırlıyoruz. Daha sonra, optik kesit mikroskopisi biyofilmin tam kalınlığı na rağmen üç boyutlu görüntü verilerini elde etmek için kullanılabilir.

Aydınlatma ve Görüntüleme Candida albicans Biyofilmler

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

Candida albicans biyofilmler birçok biyolojik örnekler gibi ağır kendi yerli devlet opak yarı saydamdır. Bu protokollerde, açıklama yöntemleri kullanılarak, sabit bozulmamış biyofilmlerin iç yapısının optik kesitli mikroskopi ile görüntülenebildiği gösterilebilir. Basit, ucuz ve nispeten hızlı işleme adımları ile, sabit bozulmamış biyofilmler konfokal tarama floresan mikroskopisi ile 3D görüntüleme için şeffaf yapılabilir.Bugün bu prosedürü gösteren Katie Lagree, burada bir doktora sonrası araştırmacı olacak, ve ben. 12 kuyulu bir plakada biyofilm büyümesine başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi plakayı hazırlayın. Hücre yapışması için zaman tanımak için 90 dakika boyunca nemlendirilmiş 37 santigrat derece hava kuvözde 60 RPM orbital karıştırıcı üzerine plaka yerleştirin.90 dakika sonra, orta ve bekar hücreleri çıkarın ve steril orta veya PBS ile yıkayın. Aşılanmış substratı önceden ısıtılmış filamentasyon ortamı içeren çok kuyulu başka bir plakaya aktarın. Plakayı 37 santigrat derece nemlendirilmiş ortam hava kuvözlerine geri döndürün ve biyofilmleri havalandırma için 60 RPM orbital karıştırma ile 48 saate kadar büyütün.48 saatlik plakayı kuvözden alın ve kültür ortamını her numuneden çıkarın. Serum proteinlerini seyreltmek için ortamı PBS ile değiştirin ve birkaç dakika kuluçkaya yatırın. PBS çıkardıktan sonra, fiksatif ile kuyuları doldurun.Yemeğin iç tarafları da dahil olmak üzere tüm biyofilm büyümesini batırmak için her çanağa yeterli fiksatif hacim eklenmelidir. 20 dakika boyunca yavaş bir yörünge karıştırıcı üzerinde kapalı çanak ayarlayın. Metin protokolünde açıklandığı gibi fiksatifi çıkardıktan sonra, PBS'yi boşaltarak ve kuyuları pbs ve gerekli lekeyi içeren bir solüsyonla hızlı bir şekilde doldurarak boyama ya hazırlanın.Biyofilmin birkaç saniyeden fazla kurumasını veya kurumasını izin vermeyin. Çanak leke ekleyin. Gerekli leke miktarı biyofilm kütlesine bağlıdır.Sonra bir gecede yavaş bir yörünge karıştırıcı üzerinde kapalı çanak ayarlayın ve folyo veya siyah kağıt parçası ile ışıktan korumak. Cımbız kullanarak, sabit vitraybiyofilm PBS beş mililitre 50/50 PBS-metanol 20 mililitrecam şişe içinde biyofilm yukarı bakacak şekilde aktarın. Beş dakika boyunca bir dakikalık aralıklarla yörünge hareketi ile elle karıştırın.Pipet ve biyofilm veya biyofilm ve şişe arasında temas önlemek için dikkatli bir atık şişesi ne çözücü çıkarın. Yavaşça düzgün metanol üç mililitre ile doldurun. Üç dakika boyunca bir dakikalık aralıklarla yörünge hareketi ile elle karıştırın.Şimdi bir atık şişesine çözücü çıkarın ve hemen metanol beş mililitre ile doldurun. Beş ila 10 dakika boyunca bir dakika aralıklarla orbital hareket ile elle karıştırdıktan sonra, atık şişe ye çözücü kaldırın. Hemen metanol üç mililitre ile doldurun.Biyofilmler genellikle ilk görünüm daha bu noktada daha opak görünüyorsun. Çözücüü atık şişesine çıkarın ve şişeyi hemen 50/50 metanol-metil salisilat beş mililitre ile doldurun. Beş ila 10 dakika boyunca bir dakika aralıklarla yörünge hareketi ile elle karıştırın.Biyofilm bu karışık çözücüde yarı saydam olmalıdır. Çözücübir atık şişesine çıkardıktan sonra, şişeyi üç mililitre düzgün metil salisilatla hafifçe doldurun. Üç dakika boyunca bir dakikalık aralıklarla yörünge hareketi ile elle karıştırın.Beş mililitre düzgün metil salisilat ile işlemi tekrarlayın, beş ila 10 dakika boyunca bir dakika aralıklarla elle karıştırın. Bu noktada, biyofilm şeffaf olmalıdır. Çözücüü atık şişesine çıkarın ve şişeyi hemen üç mililitre düzgün metil salisilatla doldurun.İşlenmiş biyofilm bu çözücüde stabildir. Ters bir mikroskop kullanıyorsanız, kapak lı cam alt kısmı olan solvent geçirmez bir çanak kullanın ve ters numunenin desteği için boşluk lar hazırlayın. Burada, spacers 13 milimetre silikon halkalar önceden metil salisilat bir saat için şişme nedeniyle odak sürüklenme en aza indirmek için ıslatılmış vardır.Tıbbi sınıf silikon kare üzerinde bir biyofilm için, kare ters ve çanak metil salisilat bir havuzda bir spacer üzerine ayarlayın. Numunenin altında herhangi bir kabarcıklar önlemek için emin olun. Çanak sıkıca mikroskop sahnesine monte ve amaç ile yağ batırılmış temas yapmak.Çanaktaki metil salisilat miktarını ayarlayın, böylece menisküs yüzey gerilimi nedeniyle numuneyi uzay makinesinde sıkıca tutun. Mat yüzeyışık saçılımı azaltmak için ters kare substrat üzerine metil salisilat bir damlacık yerleştirin. Sonra buharlaşmayı sınırlamak için bir cam plaka ile çanak kapağı.Görüntülemeden önce numunenin boşluklara yerleşmesi için birkaç dakika bekleyin. Şimdi, metin protokolünde açıklandığı gibi örnek görüntü için konfokal mikroskopi gerçekleştirin. Görüntüleri işlemek için ImageJ veya Fiji'yi açın.Programın, verilerin işlenmesi için yeterli atanmış belleğe sahip olduğundan emin olun. İki gigabaytlık bir veri kümesinin işlenmesi, sorunsuz bir işlem için en az sekiz gigabayt lık özel RAM gerektirir. İşlenecek seri düzlem görüntü dosyasını açın.Bilgisayar yığının tamamını işlemek için yeterli RAM'e sahip değilse, alt yığınlar işlenebilir ve tek bir yığın halinde yeniden biraraya getirilebilir. Görüntü menüsü, yazı, 32-bit kullanarak kayan nokta aritmetik işlemlerini etkinleştirmek için verileri 32 bit biçimine dönüştürün. Bu, dosya boyutunu ikikatına çıkar.Odak lama özelliklerinin karşıtlığını artırmak için düzgün arka planı çıkarın. İşlem menüsüne doğru gezinerek tüm yığını işleyin, arka planı çıkarın. Gerekirse yuvarlanan top yarıçapını ayarlayın.Top yarıçapı, korunacak odak içi özelliklerin en büyük boyutundan önemli ölçüde daha büyük olmalıdır. Tüm negatif pikselleri sıfıra ayarlamak için her görüntüyü mutlak değerine ekleyin. İlk olarak, resim menüsü, yinelenen, yinelenen yığın kullanarak yığını çoğaltmak.Sonra işlem menüsü, matematik, mutlak değer kullanarak çoğaltılmış verilerin mutlak değerini almak. İşlem menüsüne, görüntü hesap makinesine, eklemeye yön vererek iki deste ekleyin. Görüntü yığınını eksenel olarak yeniden dilimlemek için görüntü menüsünü, yığınları, yeniden dilimlemeyi kullanın.Ardından çıkış aralığı 1.0'ı seçin, en üstten başlayın ve enterpolasyondan kaçının. Odak ekseni artık yığındaki dikey eksendir. Yeniden dilimlenmiş yığının Y boyutu odak düzlemlerinin sayısına eşittir.Yığının bir kısmının veya tamamının yan görünüm projeksiyonu yapmak için görüntü menüsüne, yığınlara, Z projesine gidin. Yan görünüm düzlemlerinin bazılarını veya tümlerini içerecek şekilde başlangıç dilimini ve durdurma dilimini ayarlayın. En iyi sonuçlar için maksimum yoğunluğu seçin.Görüntü menüsünde gezinerek yan görünüm projeksiyonunun eksenel ölçeklemesini düzeltin, ölçeklendirin. Eksenel ölçek faktörü kullanılarak eşit olmayan görüntü düzlemi pikselasyonu ve odak artış için projeksiyon düzeltilmelidir. X ölçeğini bire ayarlayın ve Y ölçeğini eksenel ölçek faktörüne ayarlayın.İki kübik enterpolasyon seçin. Yeni pencere oluştur'u seçin. Parlaklığı ve kontrastı ayarlayın.Ardından görüntülemek için sekiz bitlik biçime dönüştürün. Alternatif olarak, bir renk arama tablosu uygulayın ve RGB veya sekiz bit renk olarak kaydedin. Artan kırılma indisinin seri olarak yanlış değiştirilebilen çözücüler kullanılarak, netlikte maksimum hızla tahmin edilebilir.Bu minimum kontrast noktası bulmak için konvansiyonel faz kontrast mikroskobu ile rafine edilir. Bir biyofilm seri ksilen ve bu aralıkta referans sıvılar dar bir dizi arasında değiş tokuş edildi. Her değişimden sonra, aynı alan yeniden değiştirildi ve bir coverglass ile izlendi.Artan indeksle, kontrast tersi ilk olarak hücre duvarı için 1.530'a eşit olduğunda görülür, bunu n 1.535'e eşit olduğunda sitoplazma takip eder. Mutant ve yabani tip C.albicans biyofilmlerinin derin görüntülemesi burada gösterilmiştir. Yabani tip biyofilm, 538 düzlem konfokal görüntü yığınının yan görünüm projeksiyonunda görüldüğü gibi 502 mikron kalınlığa kadar büyüdü.Apeksten baza eksenel projeksiyonlar hücre tiplerinde ve biyofilmin farklı katmanlarındaki değişimi gösterir. Bu örnek, karakteristik vahşi tip yapısını gösterir. Mutant biyofilm 556 düzlem görüntü yığınının yan görünüm projeksiyonunda görüldüğü gibi 500 mikron kalınlığa büyüdü.Bu mutant indükleyen stres yokluğunda ipliksi büyüme geçmesi bilinen önemli ölçüde farklı bir mimari üretti. Hem yan görünümde hem de eksenel projeksiyonlarda görüldüğü gibi, birçok dallanma hücresi radyal çıkıntılara yol açar. Bu yüksek kırılma indisi derin görüntüleme protokolüdür.İdeal olarak, numunenin kırılma indisi ve daldırma yağının kırılma indisi eşleşmelidir. Bu nedenle bu durumda, bir petrol daldırma amacı kullanın. Çalışmalarımızın çoğu hücre duvarı belirteçleri kullanılarak biyofilmlerin yapısal görüntüleme, ancak sabit numuneler ile kullanılan herhangi bir floresan yöntemi immünütrioresans, floresan in situ hibridizasyon ve muhabir gen ekspresyonu dahil çalışması gerekir.Bu özel organizma, Candida albicans, sağlıklı insanlarda kommensal, ama aynı zamanda mukozal veya sistemik mantar enfeksiyonlarına neden olabilir fırsatçı bir patojendir. Bazı kurumlarda BSL II çevreleme yöntemleri ve protokolleri gereklidir. Ayrıca, formaldehit ve glutaraldehit fiksatifler uçucu ve tehlikelidir.Onlar bilinen karsinojenler. Bir duman başlık fiksatifler seyreltme makyaj. Seyreltilmiş fiksatifler içeren bulaşıkları kapalı tutun ve bu fiksatifleri içeren kapları biyogüvenlik dolabına veya hücre kültürü kuvöze koymayın.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

İzleme Oluşumu ve Antifungal Duyarlılık Testi için 96 Şey microtiter Levha tabanlı Yöntemi Candida albicans Biyofilmler

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt;: Arası Ana aracılı Etkileşim Modeli<em&gt; Candida albicans</em&gt; Ve<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Diş Biyofilmler ekstraselüler pH rasyometrik Görüntüleme

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumu

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Derin Dermal enjeksiyon olarak bir Model Candida albicans deri enfeksiyonu histolojik analizler için

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Kırmızı ışık düzenlemek Candida albicans biyofilm büyüme ile günlük fototerapi

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Situ Hibridizasyonfloresan Kullanarak Murine Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Görselleştirilmesi

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Bir Ex vivo Assay Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Hyphal Morphogenesis Çalışma

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Candida albicans'ı İnhibe Etmek için Gül Bengal Aracılı Fotodinamik Terapi

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

Antikorların Candida tropicalis Biyofilmleri Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek için Çözünür Tetrazolyum Bazlı İndirgeme Testi

Candida species are the fourth-most common cause of systemic nosocomial infections. Systemic or invasive candidiasis frequently involves biofilm formation ...