Name: humanized nog mice for intravaginal hiv exposure and treatment of hiv infection
Uploaded: 2020-01-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Humanized NOG Mice for Intravaginal HIV Exposure and Treatment of HIV Infection at JoVE.com

De auteurs willen de medewerkers van de Biomedicine Animal Facility van de Universiteit van Aarhus, in het bijzonder mevrouw Jani Kær, bedanken voor de inspanningen van de kolonieen en voor het bijhouden van muisgewichten. De auteurs willen professor Florian Klein bedanken voor de ontwikkeling van standaard-of-care cART en voor begeleiding. De volgende reagens werd verkregen via de NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (cat# 11744) van Dr. John Kappes en Dr Christina Ochsenbauer.

Alle navelstrengbloedmonsters werden verkregen in strikte overeenstemming met lokaal goedgekeurde protocollen, waaronder geïnformeerde toestemming van anonieme donatie door de ouders. Alle dierproeven werden goedgekeurd en uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Deense nationale regelgeving in het kader van de licentie 2017-15-0201-01312.
LET OP: Omgaan met hiv blootgestelde muizen en bloed met uiterste voorzichtigheid. Ontsmetten alle oppervlakken en vloeistoffen die in contact zijn gew...

<ol>
	<li>Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Hitchhiker's+guide+to+humanized+mice:+new+pathways+to+studying+viral+infections.">A Hitchhiker's guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections.</a> Immunology. 154 (1), 50-61 (2018).</li><li>Denton, P. W., Krisko, J. F., Powell, D. A., Mathias, M., Kwak, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Administration+of+Antiretrovirals+Prior+to+Exposure+Prevents+Rectal+and+Intravenous+HIV-1+Transmission+in+Humanized+BLT+Mice.">Systemic Administration of Antiretrovirals Prior to Exposure Prevents Rectal and Intravenous HIV-1 Transmission in Humanized BLT Mice.</a> PLoS ONE. 5 (1), 8829 (2010).</li><li>Zou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nef+functions+in+BLT+mice+to+enhance+HIV-1+replication+and+deplete+CD4+++CD8+++thymocytes.">Nef functions in BLT mice to enhance HIV-1 replication and deplete CD4 + CD8 + thymocytes.</a> Retrovirology. 9 (1), 44 (2012).</li><li>Berges, B. K., Akkina, S. R., Folkvord, J. M., Connick, E., Akkina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+transmission+of+R5+and+X4+tropic+HIV-1+via+vaginal+and+rectal+routes+in+humanized+Rag2+-/-+&#947;c+-/-+(RAG-hu)+mice.">Mucosal transmission of R5 and X4 tropic HIV-1 via vaginal and rectal routes in humanized Rag2 -/- &#947;c -/- (RAG-hu) mice.</a> Virology. 373 (2), 342-351 (2008).</li><li>Veselinovic, M., Charlins, P., Akkina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+HIV-1+Mucosal+Transmission+and+Prevention+in+Humanized+Mice.">Modeling HIV-1 Mucosal Transmission and Prevention in Humanized Mice.</a> Methods Mol Biol. , 203-220 (2016).</li><li>Neff, C. P., Kurisu, T., Ndolo, T., Fox, K., Akkina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+topical+microbicide+gel+formulation+of+CCR5+antagonist+maraviroc+prevents+HIV-1+vaginal+transmission+in+humanized+RAG-hu+mice.">A topical microbicide gel formulation of CCR5 antagonist maraviroc prevents HIV-1 vaginal transmission in humanized RAG-hu mice.</a> PLoS ONE. 6 (6), 20209 (2011).</li><li>Neff, P. C., Ndolo, T., Tandon, A., Habu, Y., Akkina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+pre-exposure+prophylaxis+by+anti-retrovirals+raltegravir+and+maraviroc+protects+against+HIV-1+vaginal+transmission+in+a+humanized+mouse+model.">Oral pre-exposure prophylaxis by anti-retrovirals raltegravir and maraviroc protects against HIV-1 vaginal transmission in a humanized mouse model.</a> PLoS ONE. 5 (12), 15257 (2010).</li><li>Veselinovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+pre-exposure+prophylaxis:+Mucosal+tissue+drug+distribution+of+RT+inhibitor+Tenofovir+and+entry+inhibitor+Maraviroc+in+a+humanized+mouse+model.">HIV pre-exposure prophylaxis: Mucosal tissue drug distribution of RT inhibitor Tenofovir and entry inhibitor Maraviroc in a humanized mouse model.</a> Virology. 464-465, 253-263 (2014).</li><li>Akkina, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+Rag1-/-&#947;c-/-+mice+support+multilineage+hematopoiesis+and+are+susceptible+to+HIV-1+infection+via+systemic+and+vaginal+routes.">Humanized Rag1-/-&#947;c-/- mice support multilineage hematopoiesis and are susceptible to HIV-1 infection via systemic and vaginal routes.</a> PLoS ONE. 6 (6), 20169 (2011).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+combinatorial+dsiRNAs+via+nanoparticles+efficiently+suppresses+HIV-1+infection+in+humanized+mice.">Systemic administration of combinatorial dsiRNAs via nanoparticles efficiently suppresses HIV-1 infection in humanized mice.</a> Molecular Therapy. 19 (12), 2228-2238 (2011).</li><li>Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+routines+cause+animal+stress.">Laboratory routines cause animal stress.</a> Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).</li><li>Trecarichi, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+protective+effect+of+CCR5-Delta+32+heterozygosity+in+a+cohort+of+heterosexual+Italian+HIV-1+exposed+uninfected+individuals.">Partial protective effect of CCR5-Delta 32 heterozygosity in a cohort of heterosexual Italian HIV-1 exposed uninfected individuals.</a> AIDS Research and Therapy. 3 (1), (2006).</li><li>Novembre, J., Galvani, A. P., Slatkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+geographic+spread+of+the+CCR5+&#916;32+HIV-resistance+allele.">The geographic spread of the CCR5 &#916;32 HIV-resistance allele.</a> PLoS Biology. 3 (11), 1954-1962 (2005).</li><li>Solloch, U. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequencies+of+gene+variant+CCR5-&#916;32+in+87+countries+based+on+next-generation+sequencing+of+1.3+million+individuals+sampled+from+3+national+DKMS+donor+centers.">Frequencies of gene variant CCR5-&#916;32 in 87 countries based on next-generation sequencing of 1.3 million individuals sampled from 3 national DKMS donor centers.</a> Human Immunology. 78 (11-12), 710-717 (2017).</li><li>Ochsenbauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transmitted/Founder+HIV-1+Infectious+Molecular+Clones+and+Characterization+of+Their+Replication+Capacity+in+CD4+T+Lymphocytes+and+Monocyte-Derived+Macrophages.">Generation of Transmitted/Founder HIV-1 Infectious Molecular Clones and Characterization of Their Replication Capacity in CD4 T Lymphocytes and Monocyte-Derived Macrophages.</a> Journal of Virology. 86 (5), 2715-2728 (2012).</li><li>Andersen, A. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Acting,+Potent+Delivery+of+Combination+Antiretroviral+Therapy.">Long-Acting, Potent Delivery of Combination Antiretroviral Therapy.</a> ACS Macro Letters. 7 (5), 587-591 (2018).</li><li>Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+thermoregulatory+devices+used+during+anesthesia+of+C57BL/6+mice+and+correlations+between+body+temperature+and+physiologic+parameters.">Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 52 (5), 577-583 (2013).</li><li>Gatlin, J., Padgett, A., Melkus, M. W., Kelly, P. F., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+engraftment+of+nonobese+diabetic/severe+combined+immunodeficient+mice+with+human+CD34++cells+transduced+by+a+self-inactivating+human+immunodeficiency+virus+type+1+vector.">Long-term engraftment of nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice with human CD34+ cells transduced by a self-inactivating human immunodeficiency virus type 1 vector.</a> Human Gene Therapy. 12 (9), 1079-1089 (2001).</li><li>Leth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+transcriptional+activity+during+frequent+longitudinal+sampling+in+aviremic+patients+on+antiretroviral+therapy.">HIV-1 transcriptional activity during frequent longitudinal sampling in aviremic patients on antiretroviral therapy.</a> AIDS. 30 (5), 713-721 (2016).</li><li>Halper-Stromberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadly+neutralizing+antibodies+and+viral+inducers+decrease+rebound+from+HIV-1+latent+reservoirs+in+humanized+mice.">Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice.</a> Cell. 158 (5), 989-999 (2014).</li><li>Rothenberger, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+number+of+rebounding/founder+HIV+variants+emerge+from+multifocal+infection+in+lymphatic+tissues+after+treatment+interruption.">Large number of rebounding/founder HIV variants emerge from multifocal infection in lymphatic tissues after treatment interruption.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (10), 1126-1134 (2015).</li><li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Hemato-Lymphoid+System+Mice:+Current+Use+and+Future+Potential+for+Medicine.">Human Hemato-Lymphoid System Mice: Current Use and Future Potential for Medicine.</a> Annual Review of Immunology. 31 (1), 635-674 (2013).</li><li>Walsh, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+Mouse+Models+of+Clinical+Disease.">Humanized Mouse Models of Clinical Disease.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 12 (1), 187-215 (2017).</li><li>Denton, P. W., Garc&#237;a, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mouse+models+of+HIV+infection.">Humanized mouse models of HIV infection.</a> AIDS Reviews. 13 (3), 135-148 (2011).</li><li>Denton, P. W., S&#248;gaard, O. S., Tolstrup, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+animal+models+to+overcome+temporal,+spatial+and+combinatorial+challenges+in+HIV+persistence+research.">Using animal models to overcome temporal, spatial and combinatorial challenges in HIV persistence research.</a> Journal of Translational Medicine. 14 (1), (2016).</li><li>Andersen, A. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAIMP+administration+in+humanized+mice+induces+a+chimerization-level-dependent+STING+response.">cAIMP administration in humanized mice induces a chimerization-level-dependent STING response.</a> Immunology. 157 (2), 163-172 (2019).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Mature+and+Functional+Human+Myeloid+Subsets+in+Hematopoietic+Stem+Cell-Engrafted+NOD/SCID/IL2r+KO+Mice.">Development of Mature and Functional Human Myeloid Subsets in Hematopoietic Stem Cell-Engrafted NOD/SCID/IL2r KO Mice.</a> The Journal of Immunology. 188 (12), 6145-6155 (2012).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DPCR:+A+technology+review.">DPCR: A technology review.</a> Sensors (Switzerland). 18 (4), (2018).</li><li>Denton, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+HIV+Latency+in+Humanized+BLT+Mice.">Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice.</a> Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+immune+system+mouse+model+with+robust+lymph+node+development.">A human immune system mouse model with robust lymph node development.</a> Nature Methods. 15 (8), 623-630 (2018).</li><li>Satheesan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Replication+and+Latency+in+a+Humanized+NSG+Mouse+Model+during+Suppressive+Oral+Combinational+Antiretroviral+Therapy.">HIV Replication and Latency in a Humanized NSG Mouse Model during Suppressive Oral Combinational Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).</li><li>Bachmanov, A. A., Reed, D. R., Beauchamp, G. K., Tordoff, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+intake,+water+intake,+and+drinking+spout+side+preference+of+28+mouse+strains.">Food intake, water intake, and drinking spout side preference of 28 mouse strains.</a> Behavior Genetics. 32 (6), 435-443 (2002).</li><li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+T-cell+subsets+with+HLA-restricted+immune+responses+in+HLA+class+I+expressing+NOD/SCID/IL2r+null+humanized+mice.">Generation of functional human T-cell subsets with HLA-restricted immune responses in HLA class I expressing NOD/SCID/IL2r null humanized mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (29), 13022-13027 (2010).</li><li>Willinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+IL-3/GM-CSF+knock-in+mice+support+human+alveolar+macrophage+development+and+human+immune+responses+in+the+lung.">Human IL-3/GM-CSF knock-in mice support human alveolar macrophage development and human immune responses in the lung.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (6), 2390-2395 (2011).</li><li>Hanazawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+immunosuppressive+myeloid+cell+populations+in+human+interleukin-6+transgenic+NOG+mice.">Generation of human immunosuppressive myeloid cell populations in human interleukin-6 transgenic NOG mice.</a> Frontiers in Immunology. 9, (2018).</li><li>Huntington, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+trans-presentation+promotes+human+NK+cell+development+and+differentiation+in+vivo.">IL-15 trans-presentation promotes human NK cell development and differentiation in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206 (1), 25-34 (2009).</li><li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+function+of+human+innate+immune+cells+in+a+humanized+mouse+model.">Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).</li></ol>

De ernstig immuungecompromitteerde muisstam NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) is uitermate geschikt voor transplantatie van menselijke cellen en weefsels. Zowel aangeboren als adaptieve immuuntrajecten bij deze muizen zijn gecompromitteerd. NOG- en NSG-muizen herbergen een Prkdcscid mutatie die resulteert in een defecte T- en B-celfunctie. Bovendien missen deze muizen een functionele interleukine-2 receptor γ-keten (gemeenschappelijke gammakete...

Menselijk immunodeficiëntievirus (HIV) is een chronische infectie met meer dan 37 miljoen geïnfecteerde personen wereldwijd1. Combinatie antivirale therapie (cART) is een levensreddende therapie, maar een remedie is nog steeds gerechtvaardigd. Er is dus behoefte aan diermodellen die het menselijk immuunsysteem en de reacties ervan weerspiegelen om verder onderzoek naar HIV te vergemakkelijken. Meerdere soorten gehumaniseerde muizen die cel- en weefselengraftment kunnen ondersteunen, zijn ontwikkeld door menselijke cellen te transplanteren in ernstig immunodeficiënte muizen2. Dergelijke gehumaniseerde muizen zijn gevoelig voor HIV-infectie en bieden een belangrijk alternatief voor niet-menselijke primaat simian immunodeficiëntie virus modellen, omdat ze goedkoper en eenvoudiger te gebruiken dan niet-menselijke primaten. Gehumaniseerde muizen hebben onderzoek naar hiv-virale overdracht, pathogenese, preventie en behandeling3,4,5,6,7,8,9,10,11vergemakkelijkt.
We presenteren een flexibel gehumaniseerd modelsysteem voor HIV-onderzoek ontwikkeld door het transplanteren van navelstrengbloed afkomstige menselijke stamcellen in muizen van de NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/ JicTac (NOG) achtergrond. Naast het feit dat van niet-foetale oorsprong, de praktische bio-engineering van deze muizen is minder technisch veeleisend in vergelijking met de microchirurgische procedures die betrokken zijn bij de transplantatie van de bloed-lever-thymus (BLT) constructie.
We laten zien hoe je hiv-infectie vast te stellen door middel van intravaginale transmissie en hoe het plasma virale belasting te controleren met een gevoelige druppel digitale PCR (ddPCR) gebaseerde setup. Vervolgens beschrijven we de oprichting van standaard cART gegeven als onderdeel van de dagelijkse muis dieet. Het doel van deze gecombineerde methoden is om stress voor de dieren te verminderen en grootschalige experimenten te vergemakkelijken waarbij de tijd die wordt besteed aan het hanteren van elk dier beperkt is12.
Bij mensen veroorzaakt een CCR5Δ32/wt of CCR5Δ32/ Δ32 genotype een verminderde gevoeligheid voor hiv-infectie met zender/stichtersvirussen13, en sommige voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij bio-engineering gehumaniseerde muizen met stamcellen voor hiv-studies. Dit geldt vooral in onze regio omdat natuurlijk voorkomende varianten in het CCR5-gen, met name Δ32-deleties, vaker voorkomen in Scandinavische en Baltische inheemse populaties in vergelijking met de rest van de wereld14,15. Zo bevat ons protocol een eenvoudige, hoge doorvoertest voor het screenen van donorhematopoietische stamcellen voor CCR5-varianten voorafgaand aan transplantatie.
Voor de intravaginale blootstelling kozen we de zender / oprichter R5 virus RHPA4259, geïsoleerd van een vrouw in een vroeg stadium van infectie die intravaginale besmet was16. We stelden de muizen bloot aan een virale dosis die voldoende was om een succesvolle overdracht in de meerderheid van de muizen op te leveren, maar onder een 100% transmissiesnelheid. Het kiezen van een dergelijke dosis maakt een voldoende dynamisch bereik in transmissiesnelheid mogelijk, zodat antivirale effecten van een kandidaat-geneesmiddel kunnen leiden tot beschermde dieren in hiv-preventie-experimenten en verminderde virale belasting voor behandelingsstudies.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blue pad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-031</td>
			<td>Should be sterilized prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>557835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 (clone OKT3) FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 (clone SK7) BUV395</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 (clone AC136) FITC</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-113-740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 (clone SK3) BUV 496</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564652/51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 (clone 2D1) APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>368511/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 (clone RPA-T8) BV421</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>562428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for probes (no dUTP)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10,02,95,21,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4263</td>
			<td>For suspension buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>17896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing solution 10X</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td>Dilute 1:10 in dH20 immediately before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>422302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8192-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17144002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo v.10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Mesoft</td>
			<td>157300</td>
			<td>Should be sterilized prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer (B&#252;rker-T&#252;rk)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>DOWC1597418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane gas</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>9658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR Fortessa X20 flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72692405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse cART food</td>
			<td>ssniff Spezialdi&#228;ten GmbH</td>
			<td>Custom made product</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td></td>
			<td>Custom made product</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, Microlance 3, 30G &#189;&#34;</td>
			<td>BD</td>
			<td>304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>NOG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>436912C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR-approved microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.692.405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution 100X</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Hot Start II DNA polymerase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>2149P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>100005398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX100 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1886-3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX100 Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNAse size F + reaction buffer</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0501-500</td>
			<td>Dissolve in H20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softject 1 mL syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>5010-200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypane blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon S (virus disinfectant)</td>
			<td>Dupont</td>
			<td>7511</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

humanized nog mice for intravaginal hiv exposure and treatment of hiv infection

Gehumaniseerde muizen bieden een geavanceerd platform om menselijke immunodeficiëntievirus (HIV) virologie te bestuderen en antivirale geneesmiddelen te testen. Dit protocol beschrijft de oprichting van een menselijk immuunsysteem bij volwassen NOG muizen. Hier leggen we alle praktische stappen uit van isolatie van navelstrengbloed afkomstig van menselijke CD34+ cellen en hun daaropvolgende intraveneuze transplantatie in de muizen, tot de manipulatie van het model door hiv-infectie, combinatie antiretrovirale therapie ( cART) en bloedafname. Ongeveer 75.000 hCD34+ cellen worden intraveneus geïnjecteerd in de muizen en het niveau van menselijk chimerisme, ook bekend als humanisering, in het perifere bloed wordt in de lengterichting geschat voor maanden door flow cytometrie. Een totaal van 75.000 hCD34+ cellen levert 20%–50% menselijke CD45+ cellen op in het perifere bloed. De muizen zijn gevoelig voor intravaginale infectie met HIV en bloed kan eenmaal per week worden bemonsterd voor analyse, en twee maal per maand voor langere perioden. Dit protocol beschrijft een test voor kwantificering van plasma virale belasting met behulp van druppel digitale PCR (ddPCR). We laten zien hoe de muizen effectief kunnen worden behandeld met een standaard-of-care cART-regime in het dieet. De levering van cART in de vorm van gewone muis chow is een aanzienlijke verfijning van het experimentele model. Dit model kan worden gebruikt voor preklinische analyse van zowel systemische als actuele pre-exposure profylaxeverbindingen en voor het testen van nieuwe behandelingen en HIV-genezingsstrategieën.

De gatingstrategie voor de analyse van de zuiverheid van stamcellen is afgebeeld in figuur 1. Figuur 1A-C toont de gezuiverde CD34+ populatie en figuur 1D-F de CD34-flow-through die wordt gebruikt om te illustreren dat de minimale hoeveelheid cd34+ populatie verloren gaat in het isolatieproces. De zuiverheid van geïsoleerde CD34+ stamcellen lag tussen 85%-95% met minder dan 1% T-celverontreiniging....

Watch this Scientific Journal Video about Humanized NOG Mice for Intravaginal HIV Exposure and Treatment of HIV Infection at JoVE.com

Humanized NOG Mice for Intravaginal HIV Exposure and Treatment of HIV Infection

We hebben een protocol ontwikkeld voor de generatie en evaluatie van een gehumaniseerd en menselijk immunodeficiëntievirus besmet NOG muismodel op basis van stamceltransplantatie, intravaginale blootstelling aan het menselijke immunodeficiëntievirus en druppeldigitale PCR RNA Kwantificering.

Gehumaniseerde NOG Muizen voor intravaginale HIV Blootstelling en behandeling van HIV-infectie

Humanized mice provide a sophisticated platform to study human immunodeficiency virus (HIV) virology and to test antiviral drugs. This protocol describes ...

Het vaststellen van dit gehumaniseerde muismodel kan helpen bij preklinische HIV-onderzoeken. Zo kunnen bijvoorbeeld zowel verschillende virale stammen als nieuwe hiv-interventies worden geëvalueerd. Deze protocollen kunnen worden gebruikt om de status van stamceldonor CCR5 te evalueren en om gehumaniseerde muizen efficiënt te infecteren met HIV en om virale belasting van muisplasma te kwantificeren.Het RNA-kwantificeringsprotocol kan eenvoudig worden aangepast om elke virale RNA-sequentie naar keuze te kwantificeren die detecteerbaar is in plasmamonsters. Voor genetische screening van navelstrengbloedmonsters voor CCR5 delta 32-varianten, incubeer 1,25 microliter van niet-pelleted flowthrough met 11,25 microliter pcr-mix met 200 micromolar dNTP-mix, 0,01 eenheid per microliter van high-fidelity DNA polymerase en voorwaartse en omgekeerde primers zoals beschreven in de tabel. Pas het volume met nuclease-vrij water aan op ongeveer 12,5 microliter voor elke PCR-reactie en versterk de genomische fragmenten met het PCR-fietsprogramma zoals aangegeven in de tabel.Aan het einde van de reactie, scheiden van de PCR producten op een 2%agarose gel. PCR-producten van de wilde type allelen en de delta 32 allelen leveren PCR-fragmenten op van respectievelijk 196 basisparen en 164 basisparen, waardoor de banden gemakkelijk te onderscheiden zijn door gelelektroforese. Voor intravaginale HIV-blootstelling plaatst u een verwarmingslamp gericht op het midden van de werkruimte waar de muis zich zal bevinden en plaatst u steriele pipettips van microliter in een geschikte pipet in de motorkap.Plaats een container met vloeibaar ontsmettingsmiddel in de kap voor onmiddellijke inactivatie van materialen en vloeistoffen die in contact zijn geweest met het virus. Plaats de verdoofde muis op een steriele blauwe pad in de supine positie onder de lamp met de staart van de muis naar de achterkant van de kap en bevestig het gebrek aan reactie op pedaal reflex in de muis. Grijp het dier aan de voet van de staart.Voorzichtig tillen van de muis door de staart basis, ondersteuning van het dier in een ondersteboven rechtop positie. Gebruik een steriele pijptip om het genitale gebied te stimuleren met zachte strelen naar de anus om het legen van het rectum te induceren en om de druk op de vagina te verlichten. Om de vaginale opening bloot te leggen, wikkel je de muizenstaart voorzichtig over de vingers, zodat de vulva van nature opengaat.Met behulp van een nieuwe pipettip plaatst u de tip op het niveau van de vaginale opening en laat u atraumatisch 20 microliters van het virus vrij in de vagina, waardoor de zwaartekracht de virale suspensie in de vagina kan trekken. Wanneer al het virus is geleverd, bewaar de muis in deze positie gedurende vijf minuten om zwaartekracht-geïnduceerde lekkage van het virus te voorkomen. Breng de muis vervolgens voorzichtig terug naar zijn thuiskooi in de supine-positie en controleer tot volledig herstel.Gebruik een virusRNA-isolatiekit volgens de instructies van de fabrikant om RNA te isoleren van ontdooide monsters van het muisplasma. Voeg het monster toe dat zich aan de kolom bindt en voeg een DNase-behandelingsstap toe om ervoor te zorgen dat alle DNA in het plasmamonster wordt verwijderd. Bewaar vervolgens de RNA-monsters minstens een uur op 80 graden Celsius.Om cDNA te synthetiseren, gebruikt u reverse transcriptase volgens standaardprotocollen, waaronder 0,5 microliter van een RNase-remmer binnen de cDNA-reactie om RNA-afbraak te voorkomen, voert u vervolgens cDNA-synthese uit zoals beschreven in de tabel en slaat u de cDNA-monsters minstens een uur op bij 80 graden Celsius. Om monsters voor ddPCR voor te bereiden, mengt u 11 microliter ddPCR-sondereactiemengsel met polymerase en dPP's met 250 nanomolar van kleine groefbindingsonde en 900 nanomolar van elk van de voorwaartse en omgekeerde primers, zoals aangegeven in de tabel. Voeg drie microliters van elk cDNA-monster toe en pas de totale PCR-volumes aan op 22 microliter met nuclease-vrij water.Gebruik druppelgeneratieolie voor sondes op een druppelgenerator volgens het protocol van de fabrikant om de PCR-mixen te emulgeren. Voer vervolgens het PCR-programma uit zoals beschreven in de tabel. Voor cART-behandeling na bevestigde HIV-infectie, voer de muizen met pellets bereid door een externe leverancier met een standaard cART-regime, zoals aangegeven in de tabel.Gebruik een roodgekleurd cART dieet om het gemakkelijk te onderscheiden van gewone muis chow en gebruik een controle chow dieet zonder cART in een standaard bruine kleur. Voor het initiëren van de behandeling plaatst u het cART-bevattende chow-dieet in steriele kooien voordat u de muizen van de oude kooi naar de nieuwe kooi overbrengt. Controleer vervolgens de gewichten van de muizen en controleer dagelijks het verbruik van cART-bevattende chow om ervoor te zorgen dat de muizen zich aanpassen aan de verandering.Hier wordt de flow cytometrie gating strategie voor analyse van de stamcel zuiverheid afgebeeld, met de zuiverheid van de geïsoleerde CD34 positieve stamcellen meestal variërend tussen 85 tot 95%met een minder dan 1%T cel besmetting. PCR-analyse toont de CCR5-variantstatus van de gezuiverde donorsamstcellen aan, waardoor CCR5 delta 32 heterozygootdonoren gemakkelijk identificeerbaar zijn. De frequentie van het mutantengenype in een groep van 19 donoren was ongeveer 15,8%, in overeenstemming met grotere epidemiologische studies van Scandinavische populaties.Drie tot vijf maanden na de adoptieoverdracht van 7,5 keer 10 naar de 4e menselijke CD45 positieve cellen in ontvangende muizen, 20 tot 50% van de witte bloedcellen teruggewonnen uit de ontvanger dierlijke perifere bloedmonsters zijn menselijke CD45 positieve cellen en de muizen zullen hebben ontwikkeld menselijke B en T cellen. 64% van de muizen raakt besmet met HIV na vaginale blootstelling zoals aangetoond. Vier weken na de overstap naar een 40-daags dieet met standaard cART, dalen de virale belastingen bij hiv-positieve muizen tot onder de detectielimiet.Na stopzetting van het dieet, het virus rebounds, spiegelen klinische gegevens. Belangrijk is dat muizen op cART de verandering in dieet goed verdragen. Het is van cruciaal belang om te onthouden dat deze dieren immunodeficiënt zijn en daardoor kwetsbaar voor het milieu.Vasthouden aan aseptische technieken zal de algehele diergezondheid en protocol succes te verhogen. Na de vaststelling van het gehumaniseerde muiscohort voor HIV-infectie kan het protocol worden aangepast voor virale RNA-kwantificering in weefsels of voor het testen van nieuwe interventies in verschillende virale stammen. De flexibiliteit en toegankelijkheid van gehumaniseerde muizen voor hiv-infectiestudies hebben kritieke vooruitgang in hiv-virologie, immunologie en behandelingsonderzoek mogelijk gemaakt.Voordat u probeert protocollen met besmettelijk HIV, moet u goedkeuring krijgen van lokale ambtenaren van de werkomgeving en zich houden aan goedgekeurde ontsmettingsprocedures.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Visualiseren Cel-cel Overdracht van hiv met behulp van TL-Klonen van HIV en Live confocale microscopie

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

Ontwikkeling van Cell-type-specifieke anti-HIV-gp120 aptameren voor siRNA levering

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro uncoating van HIV-1 Kernen

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Snelle screening van HIV reverse transcriptase en integrase-remmers

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolatie van exosomen uit het plasma van HIV-1 positieve personen

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Meting van<em&gt; In Vitro</em&gt; Integratie activiteit van HIV-1 Preintegration Complexen

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

SILAC Based Proteoom karakterisatie van exosomen van HIV-1 geïnfecteerde cellen

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Eencellige kwantificatie van mRNA en oppervlak eiwituitdrukking in Simian Immunodeficiëntie Virus-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van Rhesus Makaken

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Gehumaniseerd knik/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) muis Model voor HIV-replicatie en Latency Studies

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...