Denne protokol kan bruges til at korrelere calcium aktivitetsmønstre med genekspression på enkelt celleniveau bemyndigelse forskere til at undersøge nye spørgsmål om forholdet mellem disse to funktioner. I modsætning til tidligere tilgange, som typisk studerer hele væv, zoomer vores teknik ind på det enkelte celleniveau, så vi kan vurdere cellekonomiske relationer mellem calciumaktivitet og genekspression. Begynd med UV sterilisere to 35 millimeter plast petriskåle og en 35 millimeter cellekultur skål i ca 30 minutter.
Arbejde i laminar flow hætte, tilsæt 10 milliliter af to millimolar calcium opløsning til hver af to 50 milliliter plast koniske rør, en UV-steriliseret Petriskål, og UV-steriliseret cellekultur parabol. Tilsæt to milliliter calcium og magnesium fri opløsning til den anden UV-steriliserede petriskål og fyld to 100 millimeter plast petriskåle og en 35 millimeter plast petriskål med 0,1 X MMR suppleret med gentamicin. Fyld derefter en 60 millimeter plastik petriskål med 70% ethanol.
Umiddelbart før dissektion, grundigt blandes 0,01 gram kollagen B i et rør af calcium opløsning. Tilsæt opløsningen til en ny 60 millimeter plast petriskål og bruge en dissekere mikroskop til at identificere embryoner i den ønskede udviklingsfase. Brug en steril overførselspipette til at flytte mindst seks passende embryoner til en 100 millimeter plade, der indeholder MMR plus gentamicin.
Flyt derefter et foster fra holdepladen ind i den anden 100 millimeter plade af MMR plus gentamicin, og læg denne dissektionsplade under mikroskopet. Brug et par stumpe kraftafces til at stabilisere embryonet, skal du forsigtigt skrælle vitellinemembranen omkring fosteret væk med et par fine kraftafcesser. Når hele membranen er fjernet, skal du bruge de fine kraftanger til at klemme fosteret langs den forreste bageste akse for at adskille de dorsale og ventrale områder.
Brug den nye sterile overførselspipette til at overføre rygdelen til den 60 millimeter plade af kollagenopløsning i et til to minutter, før prøven overføres omhyggeligt tilbage til dissektionspladen. For at fuldføre dissektion, omhyggeligt fjerne alle de resterende endodermal og mesodermal forurening fra den formodede neurale væv af ektoderm og forsigtigt overføre explant til 35 millimeter plade af calcium opløsning. Når yderligere tre explants er blevet indsamlet, skal du bruge en P1000 mikropipette til at overføre alle fire af de explants til 35 millimeter plade af calcium og magnesium fri løsning, der skal sikre at undgå enhver kontakt mellem explants og luftvand interface.
Derefter forsigtigt hvirvle skålen, således at alle de explants klynge i midten af pladen og inkubere prøverne i en time ved stuetemperatur for at gøre det muligt for væv til at adskille. Under denne inkubation overføres de sidste to embryoner til den anden skål MMR med gentamicin, og skålen dækkes, så disse prøver kan udvikle sig uforstyrret. I slutningen af inkubationen skal du bruge superlim til at fastgøre en mikro-styret dækslæb til bunden af den 35 millimeter cellekulturskål og bruge en P100 mikropipette til at indsamle de dissocierede explants.
Hold pipetten i en lavvandet vinkel tæt på overfladen af cellekulturskålen, placer pipetten i hjørnet af gitteret, der vender indad, og udstød celleaffjedringen på tværs af det gitterede område. Ideelt set vil cellerne bosætte sig i en stram, tæt klynge. Lad cellerne holde sig til pladen i en time ved stuetemperatur.
Mens cellerne er ved at bosætte sig, bestemme og registrere udviklingsstadiet af søskende kontrol embryoner. Ved inkubationens afslutning flyttes prøveskålen til et lysbeskyttet sted, og der aspirerer 100 mikroliter opløsning fra skålens kant. Bland denne opløsning med syv mikroliter af en frisklavet Fluo-4 AM Pluronic F127 syreopløsning med op- og nedrør, før hele volumenet returneres til prøveskålen.
Swirl forsigtigt at blande og dække pladen med aluminiumsfolie. Efter en time ved stuetemperatur udskiftes en milliliter af den eksplante kulturskål supernatant med tre milliliter frisk to millimolar calciumopløsning. Derefter erstattes tre milliliter supernatant med tre milliliter frisk calciumopløsning to gange mere.
Ved calciumaktivitetsbilleddannelse i explants anbringes prøvepladen på scenen af et omvendt konfokal mikroskop, der er beskyttet mod eksponering for omgivende lys, og brug en markør til at mærke pladens forreste punkt, så det samme synsfelt kan findes ved efterfølgende billedbehandlinger. Brug 10- og 20-tidens målsætningerne til at finde en prøve under mikroskopet og vælge et passende synsfelt, der er celletæt, men ikke så tæt, at cellerne er klumpet eller vanskelige at skelne individuelt. Juster mikroskopfokus, så den gitter-styrede dækslæb er synlig, og skift det oprindelige synsfelt, indtil et identificerbart tal er i rammen efter behov.
Få et lyst feltbillede af det markerede synsfelt med gitterbekendte dækslæb i fokus og et lyst feltbillede af det valgte synsfelt med cellerne i fokus. Uden et klart billede af den gridded coverslip og synsfeltet, vil du ikke være i stand til at co-registrere dine celler med dem i fisk billeder, du vil generere senere. Belys derefter prøverne med en 488 nanometerlaser.
Hvis du har et billede på to timer, skal du ændre billedkonfigurationen til at optage 901 billeder med en scanningstid på 3,93 sekunder i et interval på otte sekunder, før konfigurationen køres for at hente billedet. Når billeddannelsen er færdig, skal du fjerne pladen fra mikroskopstadiet og erstatte kultursupernatanten med en milliliter 1X MEMFA til to timers inkubation ved stuetemperatur, idet man skal registrere den udviklingsmæssige fase af søskendekontrolembryonerne i begyndelsen af inkubationen. Visualiseringen af et sammensat plot, der indeholder spor for alle de celler, der er registreret i et eksperiment, afslører, i hvor høj grad masse- eller populationsmålinger kan skjule mere nuancerede spikingadfærdsmønstre.
Når de registrerede profiler af de enkelte celler er isoleret, eksempler på den uregelmæssige spiking aktivitet karakteristisk for neurale progenitor celler kan tydeligt identificeres. For at kvantificere denne kompleksitet kan der anvendes forskellige dataanalysemetoder, herunder forskellige parametre til at definere en stigning. Hvis pladerne håndteres groft, eller vaskerne udføres for kraftigt under fluorescerende in situ-hybridisering, kan cellerne løsnes fra pladeoverfladerne, hvilket gør det umuligt for cellerne at blive matchet på tværs af billeder.
Hvis denne afbrydelse kun påvirker nogle af cellerne i synsfeltet, kan det stadig være muligt at registrere og tildele nogle af cellerne i billedet. Men den maksimale mængde data opnås fra et eksperiment, hvor hybridiseringen udføres omhyggeligt, og få celler går tabt eller flyttes mellem billeder. Resultater fra eksperimenter, der samler calciumaktivitet med ekspression af neurale progenitormarkørgener, kan afsløre talrige sammenhænge mellem specifikke mønstre af calciumaktivitet og neuro-transmitter fænotyper.
Med disse data kan forskere sonde mere komplekse træk ved disse dynamiske kalkmønstre og relationerne til genekspression i stedet for at være begrænset til simpel spike optælling.
