Этот протокол может быть использован для корреляции моделей активности кальция с экспрессией генов на уровне одной клетки, что дает исследователям возможность исследовать новые вопросы о взаимосвязи между этими двумя особенностями. В отличие от предыдущих подходов, которые обычно изучают целые ткани, наша техника масштабируется до уровня одной клетки, что позволяет нам оценить клеточную автономную связь между активностью кальция и экспрессией генов. Начните с УФ-стерилизации двух 35-миллиметровых пластиковых чаш Петри и одной 35-миллиметровой клеточной культуры в течение примерно 30 минут.
Работая в ламинарном капюшоне потока, добавьте 10 миллилитров двух миллимолярный раствор кальция к каждой из двух 50 миллилитров пластиковых конических трубок, одно уф-стерилизованной чашке Петри и уф-стерилизованной клеточной культуре. Добавьте два миллилитров раствора кальция и магния в другую уф-стерилизованную чашку Петри и заполните две 100-миллиметровые пластиковые чашки Петри и одну 35-миллиметровую пластиковую чашку Петри с 0,1X MMR, дополненную гентамицином. Затем заполните 60-миллиметровую пластиковую чашку Петри 70%этанолом.
Непосредственно перед вскрытием тщательно смешайте 0,01 грамма коллагенового В в одну трубку раствора кальция. Добавьте раствор в новую 60-миллиметровую пластиковую чашку Петри и используйте рассеченный микроскоп для выявления эмбрионов желаемой стадии развития. Используйте стерильную трубу для переноса по крайней мере шести соответствующих эмбрионов в одну 100-миллиметровую пластину, содержащую MMR плюс гентамицин.
Затем перемести один эмбрион из удерживаемой пластины во вторую 100-миллиметровую пластину MMR плюс гентамицин и поместите эту пластину вскрытия под микроскоп. Используя пару тупых типсов для стабилизации эмбриона, тщательно очистите вителлиновую мембрану, окружающую эмбрион, парой тонких типсов. Когда вся мембрана была удалена, используйте тонкие щипцы, чтобы ущипнуть эмбрион вдоль передней задней оси, чтобы отделить спинной и брюшной области.
Используйте новую стерильную трубу для переноса спинной части в 60-миллиметровую пластину коллагенового раствора в течение одной-двух минут, прежде чем тщательно перенести образец обратно в пластину вскрытия. Для завершения вскрытия тщательно удалите все остаточные эндодермальные и мезодермальные загрязнения из предполагаемой нервной ткани эктодерма и аккуратно перенесите эксплант на 35-миллиметровую пластину раствора кальция. Когда еще три explants были собраны, использовать P1000 микропипетт для передачи всех четырех explants на 35-миллиметровую пластину кальция и магния свободный раствор заботится, чтобы избежать любого контакта между explants и интерфейс воздушной воды.
Затем аккуратно закружить блюдо так, что все explants кластера в центре пластины и инкубировать образцы в течение одного часа при комнатной температуре, чтобы ткани разобщиться. Во время этой инкубации перенесите последние два эмбриона на второе блюдо MMR с гентамицином и накройте блюдо, чтобы эти образцы развивались спокойно. В конце инкубации используйте суперклей, чтобы прикрепить микроуправленную крышку к нижней части 35-миллиметровой клеточной культуры и использовать микропипют P100 для сбора диссоциированных эксплантов.
Держа пипетку под мелким углом близко к поверхности клеточной культуры блюдо, положение пипетки кончик в углу сетки, обращенной внутрь и твердо изгнать клеточной подвески через сетчатую область. В идеале клетки оседают в плотном плотном скоплении. Разрешить клетки придерживаться пластины в течение одного часа при комнатной температуре.
В то время как клетки оседают, определить и записать стадию развития эмбрионов контроля брата. В конце инкубации перемести образец блюда в светло-защищенное место и аспирировать 100 микролитров раствора от края блюда. Смешайте этот раствор с семью микролитров свежеприготовленного раствора кислоты Fluo-4 AM Pluronic F127 с помощью трубок вверх и вниз, прежде чем вернуть весь объем образца блюда.
Закружить осторожно, чтобы смешать и покрыть пластину алюминиевой фольгой. После одного часа при комнатной температуре, заменить один миллилитр explant культуры блюдо супернатант с тремя миллилитров свежих двух миллимолярной раствора кальция. Затем замените три миллилитров супернатанта еще три миллилитров свежего раствора кальция еще два раза.
Для визуализации активности кальция в explants, поместите образец пластины на стадии перевернутого конфокального микроскопа защищены от воздействия окружающего света и использовать маркер для обозначения передней точки пластины, так что то же поле зрения можно найти на последующих сеансов изображения. Используйте цели 10 и 20 раз, чтобы найти образец под микроскопом и выбрать соответствующее поле зрения, которое является плотной, но не настолько плотной, что клетки слипаются или трудно различить индивидуально. Отрегулируйте фокус микроскопа так, чтобы сетка-правилом охватывается, изменяя исходное поле зрения до тех пор, пока идентифицируемое число не будет в кадре по мере необходимости.
Получите яркое полевое изображение выбранного поля зрения с помощью сетчатого крышки в фокусе и яркое полевое изображение выбранного поля зрения с ячейками в фокусе. Без четкого изображения сетчатой крышки и поля зрения, вы не сможете совместно зарегистрировать свои клетки с теми, в рыбе изображения вы будете генерировать позже. Затем осветите образцы 488 нанометровым лазером.
Для двухчасового изображения измените конфигурацию изображения, чтобы записать 901 кадр со временем сканирования 3,93 секунды с интервалом в восемь секунд до запуска конфигурации для получения изображения. После того, как изображение завершено, удалить пластину со стадии микроскопа и заменить культуру supernatant с одним миллилитр 1X MEMFA в течение двух часов инкубации при комнатной температуре заботы для записи стадии развития эмбрионов контроля брата в начале инкубации. Визуализация композитного участка, содержащего следы для всех клеток, записанных в эксперименте, показывает, в какой степени объемные или демографические измерения могут скрывать более тонкие закономерности пикового поведения.
Когда записанные профили отдельных клеток изолированы, можно четко определить примеры нерегулярной пиковой активности, характерной для нейронных клеток-предшественников. Для количественной оценки этой сложности можно применять различные методы анализа данных, включая различные параметры для определения всплеска. Если пластины обрабатываются грубо или моет выполняются слишком сильно во время флуоресцентной на месте гибридизации, клетки могут быть выбиты из поверхностей пластины, что делает невозможным для клеток, которые будут соответствовать через изображения.
Если это нарушение затрагивает только некоторые клетки в поле зрения, все еще может быть возможно обнаружить и назначить некоторые клетки в изображении. Тем не менее, максимальный объем данных получен из эксперимента, в котором гибридизация выполняется тщательно и несколько клеток теряются или перемещается между изображениями. Результаты экспериментов по сопоставлению активности кальция с экспрессией генов нейронных маркеров-предшественников могут выявить многочисленные связи между специфическими моделями активности кальция и фенотипами нейропередатчиков.
С помощью этих данных исследователи могут исследовать более сложные особенности этих динамических моделей кальция и отношения к экспрессии генов, а не ограничиваться простым подсчетом шипов.
