Detta protokoll kan användas för att korrelera kalcium aktivitetsmönster med genuttryck på encellsnivå ge forskare att undersöka nya frågor om sambanden mellan dessa två funktioner. I motsats till tidigare metoder, som vanligtvis studerar hela vävnader, zoomar vår teknik in på den enda cellnivå som gör det möjligt för oss att bedöma cellens autonoma relationer mellan kalciumaktivitet och genuttryck. Börja med UV sterilisera två 35 millimeter plast Petri rätter och en 35 millimeter cell kultur maträtt i cirka 30 minuter.
Arbeta i laminär flöde huva, tillsätt 10 milliliter av två millimolar kalcium lösning till var och en av två 50 milliliter plast koniska rör, en UV-steriliserad Petriskål, och UV-steriliserade cell kultur skålen. Tillsätt två milliliter kalcium och magnesium fri lösning till den andra UV-steriliserade Petri-skålen och fyll två 100 millimeter plast Petriskålar och en 35 millimeter plast Petriskål med 0.1X MMR kompletteras med gentamicin. Fyll sedan en 60 millimeters plast Petriskål med 70%etanol.
Omedelbart före dissektionen, blanda noggrant 0,01 gram kollagen b i ett rör av kalciumlösning. Lägg till lösningen till en ny 60 millimeter plast Petriskål och använda en dissekera mikroskop för att identifiera embryon av den önskade utvecklingsstadiet. Använd en steril överföringspipett för att flytta minst sex lämpliga embryon till en 100 millimeters platta som innehåller MMR plus gentamicin.
Flytta sedan ett embryo från anläggningen plattan i den andra 100 millimeters platta av MMR plus gentamicin och placera denna dissekeringsplatta under mikroskopet. Med hjälp av ett par trubbiga tnötröror för att stabilisera embryot, skala försiktigt bort vitelline membranet som omger embryot med ett par fina tnötspinne. När hela membranet har tagits bort, använd de fina tången för att nypa embryot längs den främre bakre axeln för att separera de dorsala och ventrala regionerna.
Använd den nya sterila överföringspipetten för att överföra ryggdelen till den 60 millimeters plattan av kollagenlösningen i en till två minuter innan du försiktigt överför preparatet tillbaka till dissektionsplattan. För att slutföra dissektionen, ta försiktigt bort alla av de kvarvarande endodermal och mesodermal kontaminering från den presumtiva nervvävnaden i ektodermen och försiktigt överföra explant till 35 millimeters platta av kalciumlösning. När ytterligare tre explants har samlats in, använd en P1000 mikropipette för att överföra alla fyra explants till 35 millimeters platta av kalcium och magnesium fri lösning var noga med att undvika all kontakt mellan explants och luft vatten gränssnitt.
Sedan snurra försiktigt skålen så att alla explants kluster i mitten av plattan och inkubera exemplaren i en timme i rumstemperatur så att vävnaderna att separera. Under denna inkubation, överför de två sista embryona till den andra skålen av MMR med gentamicin, och täck skålen så att dessa exemplar kan utvecklas ostört. I slutet av inkubationen, använd superlim för att fästa en mikrostyrd täckplatta på botten av 35 millimeter cellodlingsfatet och använd en P100-mikropipette för att samla de dissocierade explanterna.
Håll pipetten i en grund vinkel nära cellodlingsfatets yta, placera pipettspetsen i hörnet av gallret inåt och utvisa cellupphängningen ordentligt över det inragade området. Helst kommer cellerna att bosätta sig i en stram, tät kluster. Låt cellerna hålla sig till plattan i en timme i rumstemperatur.
Medan cellerna är lösa, bestämma och spela in utvecklingsstadiet av syskon kontroll embryon. Vid slutet av inkubationen, flytta provskålen till en ljusskyddad plats och aspirera 100 mikroliter av lösning från kanten av skålen. Blanda denna lösning med sju mikroliter av en nyberedd Fluo-4 AM Pluronic F127 syralösning med upp och ner pipettering innan du returnerar hela volymen till provet skålen.
Snurra försiktigt för att blanda och täcka plattan med aluminiumfolie. Efter en timme i rumstemperatur, ersätta en milliliter av explant kultur skålen supernatant med tre milliliter av färska två millimolar kalciumlösning. Byt sedan ut tre milliliter supernatant med tre milliliter färsk kalciumlösning ytterligare två gånger.
För avbildning av kalciumaktivitet inom explanterna, placera provplattan på scenen för ett inverterat konfokalmikroskop som skyddas från exponering av omgivande ljus och använd en markör för att märka skyltens främre punkt så att samma synfält kan hittas vid efterföljande bildtagningstillfällen. Använd de 10 och 20 gånger målen för att lokalisera ett prov under mikroskopet och välj ett lämpligt synfält som är celltätt men inte så tätt att cellerna klumpas ihop eller är svåra att skilja individuellt. Justera mikroskopfokuset så att den rutnätsstyrda täckbilden syns, vilket ändrar det ursprungliga synfältet tills ett identifierbart tal är i bildruta vid behov.
Få en ljus fältbild av det markerade synfältet med den rutnätsstyrda täckbilden i fokus och en ljus fältbild av det markerade synfältet med cellerna i fokus. Utan en tydlig bild av den inrastrerade täckbilden och synfältet kan du inte samregistrera dina celler med de i fiskbilderna som du genererar senare. Sedan belysa proverna med en 488 nanometer laser.
För en två timmars bild, ändra bildhanteringskonfigurationen för att spela in 901 bildrutor med en skanningstid på 3,93 sekunder i ett intervall på åtta sekunder innan du kör konfigurationen för att skaffa bilden. När avbildningen är klar, ta bort plattan från mikroskopet skede och ersätta kulturen supernatant med en milliliter av 1X MEMFA för en två timmars inkubation vid rumstemperatur var noga med att registrera utvecklingsstadiet av syskon kontroll embryon i början av inkubationen. Visualiseringen av en sammansatt tomt som innehåller spår för alla celler som registrerats i ett experiment avslöjar i vilken utsträckning bulk eller populationsmätningar kan skymma mer nyanserade mönster av tillsatta beteende.
När de registrerade profilerna för enskilda cell är isolerade, exempel på oregelbunden spikning aktivitet som är karakteristisk för neurala stamceller kan tydligt identifieras. För att kvantifiera denna komplexitet kan olika dataanalysmetoder tillämpas inklusive olika parametrar för att definiera en topp. Om plattorna hanteras ungefär eller tvättarna utförs för kraftfullt under fluorescerande in situ-hybridisering, kan cellerna rubbas från plattan ytor gör det omöjligt för cellerna att matchas över bilder.
Om den här störningen bara påverkar några av cellerna i synfältet kan det ändå vara möjligt att upptäcka och tilldela några av cellerna inom bilden. Den maximala mängden data får man dock från ett experiment där hybridiseringen utförs noggrant och få celler förloras eller flyttas mellan bilderna. Resultat från experiment som samlar kalcium aktivitet med uttrycket av neurala progenitor markör gener kan avslöja många samband mellan specifika mönster av kalcium aktivitet och neuro-transmitter fenotyper.
Med dessa data kan forskare undersöka mer komplexa funktioner i dessa dynamiska kalciummönster och relationer till genuttryck snarare än att begränsas till enkel spikräkning.