Name: analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody
Uploaded: 2020-05-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody at JoVE.com

Biz Virginia Üniversitesi Kanser Merkezi Çekirdek Görüntüleme Tesisi, Biyomoleküler Analiz Tesisi, Gelişmiş Mikroskopi Tesisi ve Yardım için Core Vivarium Tesisi müteşekkiriz. J. T-S Yumurtalık Kanseri Akademisi (OCA-DoD) erken kariyer araştırmacısı. Bu çalışma NCI/NIH hibe (R01CA233752) j. T-S, ABD DoD Meme Kanseri Araştırma Programı (BCRP) atılım seviye-1 ödülü J. T-S (BC17097) ve U.S. DoD Yumurtalık Kanseri Araştırma Programı (OCRP) finansman ödülü (OC180412) J. T-S destek

Virginia Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından hayvanların işlenmesi ve tümör ksenogreftleri ile ilgili tüm prosedürler gözden geçirilerek onaylanmıştır ve ilgili mevzuat standartlarına uygun
1. Antikorların ekspresyonu ve saflaştırılması
<ol><li>CHO hücrelerinin bakımı<ol>
<li>FreeStyle CHO Media'da CHO hücrelerini büyüyün, 37 °C'de 37 °C'de 130 rpm'de %5 CO2'de cam veya tek kullanımlık delong Erlenmeyer ?...

<ol>
	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muromonab+CD3+(Orthoclone+OKT3).">Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3).</a> Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).</li><li>Tushir-Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-siRNA+conjugates:+drugging+the+undruggable+for+anti-leukemic+therapy.">Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy.</a> Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).</li><li>Gravitz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Nature. 504, 1 (2013).</li><li>Pagel, J. M., West, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T-Cell+Therapy.">Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy.</a> JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).</li><li>Brinkmann, U., Kontermann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+bispecific+antibodies.">The making of bispecific antibodies.</a> MAbs. 9, 182-212 (2017).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24, 50 (2018).</li><li>Shivange, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single-Agent+Dual-Specificity+Targeting+of+FOLR1+and+DR5+as+an+Effective+Strategy+for+Ovarian+Cancer.">A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer.</a> Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).</li><li>Wajant, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mode+of+Action+of+TRAIL+Receptor+Agonists-Common+Principles+and+Their+Translational+Exploitation.">Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).</li><li>Necela, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor-alpha+(FOLR1)+expression+and+function+in+triple+negative+tumors.">Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors.</a> PLoS One. 10, 0122209 (2015).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antitumor+activity+of+the+human+FOLR1-specific+monoclonal+antibody,+farletuzumab,+in+an+ovarian+cancer+mouse+model+is+mediated+by+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity.">The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).</li><li>Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Characterization+of+Cross-Linked+Species+in+Trastuzumab+Emtansine+(Kadcyla).">Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla).</a> Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).</li><li>Bauerschlag, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-idiotypic+antibody+abagovomab+in+advanced+ovarian+cancer.">Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer.</a> Future Oncology. 4, 769-773 (2008).</li><li>Narita, Y., Muro, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+molecular+targeted+therapy+for+gastric+cancer:+considerations+for+efficacy+and+safety.">Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety.</a> Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).</li><li>Jordan, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+expression+identifies+dynamic+functional+states+within+circulating+breast+cancer+cells.">HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells.</a> Nature. 537, 102-106 (2016).</li><li>Fakih, M., Vincent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adverse+events+associated+with+anti-EGFR+therapies+for+the+treatment+of+metastatic+colorectal+cancer.">Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer.</a> Current Oncology. 17, 18-30 (2010).</li><li>Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroPET/SPECT/CT+imaging+of+small+animal+models+of+disease.">MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease.</a> American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).</li><li>van der Wall, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+analysis+favours+SPECT+over+PET+and+CTA+for+evaluation+of+coronary+artery+disease:+the+SPARC+study.">Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study.</a> Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).</li><li>Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+and+SPECT+Imaging+of+Tumor+Biology:+New+Approaches+towards+Oncology+Drug+Discovery+and+Development.">PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development.</a> Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).</li><li>Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tutorial+on+Target-Mediated+Drug+Disposition+(TMDD)+Models.">A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models.</a> CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).</li></ol>

Anti-kanser terapötik ajan selektif ve tümör dokusu özel teslimat belirli bir hedefli tedavinin etkinliğini ve güvenliğini ölçmek içinanahtardır 13. Burada klinik, farletuzumab ve klinik olmayan BaCa antikorlarının ayrıntılı doku ve tümör dağılımını araştırmak için hızlı ve etkili bir yaklaşım tanımladık. Açıklanan yaklaşım yeni üretilen herhangi bir antikor için geçerlidir ve tümör / organ dağılımı özellikleri için klinik olarak etkili bir antikor (i...

FDA ilk monoklonal antikor hedefleyen CD3 onayladı (OKT3, Muromonab) içinde 1 ,2. O zamandan beri önümüzdeki yirmi yıl için, bağışıklık kontrol noktası inhibitörleri karşı antikorların ezici başarısı nedeniyle antikor mühendisliği alanında hızlı bir patlama olmuştur3. Bağışıklık sisteminin dolaylı aktivasyonu yanında, antikorlar doğrudan bağışıklık efektörü hücreleri meşgul etmek için kanser hücrelerinin bayrak hedeflenmektedir, ölüm reseptör agonist yoluyla sitotoksisite tetiklemek, blok tümör hücre sağkalım sinyali, obstrüktif anjiyogenez (kan damarlarının büyümesi), kısıtlama bağışıklık kontrol noktası düzenleyicileri, konjuge ajanlar olarak radyoizopes, kemoterapi ilaçları ve siRNA teslim2. Buna ek olarak, hasta türetilmiş T-hücreleri ve NK hücreleri (CAR-T ve CAR-NK) yüzeyinde çeşitli antikorların tek zincir değişken parçaları (scFv) incelenmesi hücre tabanlı tedaviler için klinik araştırmaların hızlı büyüyen bir alandır4.
Tümör hücrelerini ifade eden antijene seçicilik sağlayan antikor bazlı ilaçların aşırı yüksek yakınlığı onu çekici bir ajan haline getirir. Aynı şekilde, terapötik bir antikor hedefli doğum ve tümör tutma (veya kimyasal bir ilaç) toksisite üzerinde etkinliğini dengelemek için anahtardır. Bu nedenle, içeren ancak bispesifik5 ve üç spesifik antikorlar6 ile sınırlı değildir protein mühendisliği tabanlı stratejiler çok sayıda önemli ölçüde intravenöz (IV) enjekte terapötik tümör retansiyonu optimize tümör retansiyonu geliştirmek için yararlanılmaktadır5,7. Burada, potansiyel olarak etkili anti-kanser antikorlarının tümör ve doku dağılımını ele almak için basit bir floresan tabanlı yöntemi tanımlıyoruz.
Hayvan dokuları görünür spektrumda heyecanlandığında otomatik floresana sahip olduğundan, antikorlar başlangıçta kızılötesi boyanın yakınında (örneğin, IRDye 800CW) etiketlenmiştir. Kavram araştırmaları için folat reseptör alfa-1 (FOLR1) farletuzumab denilen antikor ve onun türevi olarak adlandırılan Bispesifik çapa Sitotoksisite aktivatör (BaCa)7 antikor bu co-targets FOLR1 ve ölüm reseptör-5 (DR5)8 bir rekombinant antikor kullandık. FOLR1 yumurtalık ve TNBC kanser hücrelerinde, tümör ksenogreftlerinde ve hasta tümörlerinde iyi tanımlanmış aşırı ekspres hedef reseptördür9. Özellikle, klinik yumurtalık ve meme kanserleri için bağışıklık efektörü hücreleri ve antikor ilaç konjugeler (ADC) meşgul antikor tabanlı yaklaşımlar kullanarak FOLR1 yararlanmak için birden fazla çaba vardır10,11.
Bu yöntem de, biz klonlanmış, ifade ve klinik anti-FOLR1 (farletuzumab) cho ifade sistemi kullanarak diğer kontrol antikorları ile birlikte saflaştırılmış. IgG1 isotipi ve abagovomab12 adı verilen klinik anti-idiyotip-16 antikor negatif kontrol olarak kullanıldı. Protein-A arınmasını takiben, endike antikorlar IRDye 800CW ile etiketlendi ve yumurtalık tümörü ksenogreftleri taşıyan veya stably transfected insan FOLR1 gösteren çıplak farelerin kuyruk damarına uygulandı. Antikor lokalizasyonu canlı görüntüleme ile birden fazla farklı zaman noktalarında in vivo görüntüleme spektrumu kullanılarak izlendi7. Bu yöntem ışık emisyonsağlamak için herhangi bir genetik modifikasyon veya substrat enjeksiyon gerektirmez ve önemli ölçüde daha hızlı, maliyet etkin ve verimlidir. Aşağıda açıklanan genel klonlama, ifade, saflaştırma ve etiketleme protokolü, ağır ve hafif zincir dizileri mevcutsa herhangi bir klinik ve klinik olmayan antikora uygulanabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FreeStyle CHO media</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 12651-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Anti (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Clumping Agent</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 01-0057DG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringe</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>Cat #329420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper IVIS Spectrum</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Cat #124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO CD EfficientFeed B</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat #A10240-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-13-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>Cat # 709-175-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPure Plasmid Maxiprep kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat # K21007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap MabSelect SuRe Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Cat # 11-0034-93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion</td>
			<td>Takara BioScience</td>
			<td>STO344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW NHS Ester</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Cat # 929-70020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>Cat # 11695-6777-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant Eye Ointment</td>
			<td>Refresh Lacri-Lube</td>
			<td>Cat #4089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat # BMS1003A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat # 66333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop Vacuum Filters</td>
			<td>Millipore Express</td>
			<td>Cat #S2GPT02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: OVCAR-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: CHO-K cells</td>
			<td>Stable transformed in our lab</td>
			<td>ATCC CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: 4T1</td>
			<td>Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38</td>
			<td>Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC</td>
			<td>Authenticated by STR profiling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38 hFOLR1</td>
			<td>Generated in our laboratory (This paper)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody

Monoklonal antikorlar kanser hücrelerini ortadan kaldırmak için değişken bağımsız mekanizmalar tarafından çalışan yüksek afiniteli çok fonksiyonlu ilaçlardır. Son birkaç on yıl içinde, antikor-ilaç konjugeler alanı, bispesifik antikorlar, şimerik antijen reseptörleri (CAR) ve kanser immünoterapi temel ve terapötik araştırmaların en umut verici alan olarak ortaya çıkmıştır. Bir atılım hızında lösemi ve melanom bağışıklık kontrol noktası reseptörleri ve CAR-T hücreleri hedefleyen çok sayıda başarılı insan çalışmaları ile, antikor mühendisliği varyasyonları türetilen onkolojik terapötikler için son derece heyecan verici bir kez. Ne yazık ki, antikor ve CAR bazlı terapötik önemli ölçüde çok sayıda da tümör yatağında bağışıklık efektörü hücrelerin sınırlı durumu nedeniyle katı kanserlerin insan çalışmalarda hayal kırıklığı kanıtlamıştır. Daha da önemlisi, tümörler dışındaki dokularda terapötik antikorların nonspesifik dağılımı da klinik etkinlik eksikliğine katkıda, ilişkili toksisite ve klinik yetmezlik. Preklinik çalışmaların insan klinik izlerine sadık çevirisi farelertümörü ksenogreft etkinliği ve güvenlik çalışmalarına dayandığı için, burada tümörün ve terapötik antikorların genel doku dağılımının test edilmesi için bir yöntem vurgulanmaktadır. Bu protein-A saflaştırılmış antikor yakın Kızılötesi floresan boya ile etiketlenmesi ile elde edilir tümör taşıyan farelerin canlı görüntüleme takip.

Açıklanan metodolojide, ilk olarak folat reseptöralfası alfa-1 'i (FOLR1) hedefleyen antikorları ve farletuzumab ve lexatumumab'dan oluşan BaCa adı verilen bispesifik bir antikor ile abagovomab gibi kontrol antikorları (Ek Dosya 1'deverilen diziler) klonladık. DNA klonları (pVH, pVL) temsili değişken ağır (VH) ve değişken ışık (VL) etki alanlarının ayrıntıları Şekil 1A'dagösterilmiştir. Pozitif klonları doğrulamak için, sinyal peptid ileri (SP F...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody at JoVE.com

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Burada fare tümörü ksenogreft modellerinde antikorların in vivo lokalizasyonunu incelemek için bir protokol sayılmaktadır.

Hedef Antijen Spesifik Terapötik Antikor tümör ve doku dağılımının analizi

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Bu protokol antikorların ekspresyonu ve saflaştırılmasını ve tümör ve dokuda antikor dağılımının gerçek zamanlı olarak izlenmesini göstermektedir. Açıklanan protokol ile tarama antikorları sınırlı spesifik olmayan doku dağılımına sahip antikorların seçilmesine yardımcı olacak ve tümör lokalizasyonlarını zenginleştirecektir. Açıklanan teknik hızlı ve uygun maliyetlidir.Tek foton emisyon bilgisayarlı tomografi ve pozitron emisyon tomografisi gibi diğer teknikler çok pahalıdır ve radyoaktif ve diğer gelişmiş izleyiciler gerektirir. Bu teknik sadece kanserin antikorları hedeflemesi ile sınırlı değildir. Vücuttaki antikor dağılımının analizi için akciğer veya kalp hastalıkları gibi başka bir hastalığa uygulanabilir.Prosedürü gösteren, Jeremy Gatesman, benim üniversiteden bir veteriner teknisyeni olacak. Medya 200 mililitre Ham CHO hücreleri, Delong, Erlenmeyer şişeleri şaşırttı. 50 mikrogram değişken ağır klon DNA ile CHO serbest ortam beş mililitre birleştirin ve 75 mikrogram 15 mililitrelik bir tüp değişken ışık klon DNA.Sonra, tüpü girdap. Karışımı oda sıcaklığında beş dakika bekletin. DNA çözeltisine mililitre polietilenm insifa başına 750 mikrolitre mikrolitre ekleyin ve agresif bir şekilde 30 saniye boyunca girdap.Karışımı oda sıcaklığında beş dakika daha bekletin. Şişeyi elle sallarken tüm karışımı CHO hücrelerine ekleyin. 130 RPM'de sallayarak hücreleri hemen 37 derecede kuluçkaya yatırın.Ertesi gün, hücrelere 100 X anti-kümelenme ajanı iki mililitre ve 100 X antibakteriyel antimikotik çözelti iki mililitre ekleyin. Şişeleri 32 ila 34 santigrat derecede, 130 RPM'de sallayarak kuluçkaya yatırın. 10 ila 11 gün boyunca hücreleri kültüre devam, Tryptone N1 yem 10 mililitre ekleyerek, ve her beşinci günde 100 X glutamin takviyesi iki mililitre.Hücre canlılığının 10 veya 11 gün içinde %80'in üzerinde kalmasını sağlamak için hücreleri her üç günde bir sayın, kültürü 3000 kat G'de santrifüj ederek antikor arınması için ortayı hasat edin ve 40-60 dakika 40 ila 60 dakika dört santigrat derece. Ardından, temiz ortamı 0,22 mikrometrelik şişe filtresiyle filtreleyin. Antikorları arındırmak için, protein A sütununa iki sütun luk bağlama tamponu ile dengeleyin.Filtrelenmiş ortamı dakikada bir mililitre akış hızında sütundan geçirin. Ardından sütunu iki sütun ciltli arabellekle yıkayın. 500 mikrolitre fraksiyonları içine antikor uzaklaştırmak için elüsyon tampon beş mililitre kullanın.Ve fraksiyon için nötralizasyon tampon 10 mikrolitre ekleyerek ima antikor pH nötralize. IgG için varsayılan protokolü kullanarak saflaştırılmış antikor konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçün. Bir litre çekim tamponunda diyaliz kaseti kullanarak 0,5 mililitre antikor diyalize alın.Dört saat sonra, taze tampon için diyaliz kaseti aktarın ve bir gecede diyaliz. Bir konjugasyon reaksiyonu ayarlamak için, 500 mikrolitre toplam hacmi antikor bir miligram başına IRR boya 800 CWU 0.03 mikrogram ekleyin. Karışımı 20 santigrat derecede iki saat kuluçkaya yatırın, ardından PBS'ye karşı geniş diyaliz ile etiketli konjugatları arındırın.Boya 780 nanometre emiciliği ölçerek etiketleme derecesini tahmin edin ve proteinin 280 nanometrede emilmesi. Fare ksenini geliştirmek için, hayvanın derisini hafifçe kaldırın ve altta yatan kas tabakasından ayırın. 26 gauge iğne ile deri altına 100 mikrolitre hücre süspansiyonu enjekte edin.Bodrum matris orta enjeksiyon sitesinden çıkan karışımı önleyecektir deri altında hücreleri ile birlikte yarı katı jel benzeri yapısı bilgilendirmek böylece iğne çıkarmadan önce birkaç saniye bekleyin. Vivo görüntüleme gerçekleştirmek için, kuyruk damarı üzerinden boya etiketli antikor enjekte. Fareyi anestezi ettikten sonra pedal reflekslerine yanıt eksikliği olup olmadığını kontrol edin ve ılık su uygulayarak damarı genişleyin.100 mikrolitrelik bir hacimde etiketli antikor 25 mikrogram enjekte etmek için 26 gauge iğne ile 1cc insülin şırınga kullanın. Negatif kontrol olarak, etiket ve kanser hücrelerini hedef almaz non-spesifik IgG inotip antikor enjekte. Antikor enjeksiyonlarından sekiz, 24 ve 48 saat sonra invivo görüntüleme gerçekleştirin.Görüntüleme yazılımında, başlatmayı tıklatın. Sahne sıcaklığının 37 santigrat derece olduğunu doğrulayın. Kontrol panelinde, görüntüleme sihirbazı aracılığıyla floresan görüntüleme ayarlayın ve uyarma ayarlayın 773 nanometre, emisyon 792 nanometers.Anestezili fareyi görüntüleme odasına aktarın. Burun konisi kullanarak görüntüleme alanına yerleştirin. Hazır olduğunuzda, görüntü edinimi için denetim paneline edin'i tıklatın ve otomatik pozlama'yı tıklatın.Oluşturulan görüntü, sayar veya foton birimlerinde görüntülenen optik floresan ve yoğunlukile fotoğrafik görüntü deki floresan bindirmedir. Değişken ağır ve değişken ışık etki alanları ile pozitif cDNA klonları koloni PCR ile doğrulandı. SDS sayfasını azaltmayan ve azaltarak çalışan saflaştırılmış farletuzumab'ın temsili sonuçları burada gösterilmiştir.Ağır ve hafif zincirler 50 ve 25 kilodalton bantlar üretildikten sonra üretti. Antikorların hücre yüzeyindeki yerli proteinlere bağlanması da doğrulandı. Floresan etiketli antikorlar, tam R1 ile aşılanmış farelere enjekte edilen kuyruk damarıydı.Hayvanlar IVIS kullanılarak birden fazla zaman noktasında görüntü olarak yaşanmış. tümörleriçine tam R1 ve BaCa antikorlarının veri confirs selektif zenginleştirme. Bu protokolü denerken, CHO hücrelerinin bakımının antikor verimi için kritik öneme sahip olduğunu unutmayın.Ve rekabetçi tümör lokalizasyonu için floresan boya konjugasyonu benzer derecede olması önemlidir. Bu işlemden sonra canlı fare görüntüleme verilerini desteklemek için doku immünohistokimyası ve doku veya tümöre özgü ELISA gibi diğer yöntemler de uygulanabilmektedir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Hedef hücre ön zenginleştirme ve tüm genom amplifikasyon tek hücre aşağı akım karakterizasyonu için

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Kanser Araştırmaları

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Üç boyutlu Timik Kültür Sistemi Murine indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı Tümör Antijen-spesifik Timik Emigrants oluşturmak için

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

Vitro tümör hücre Rechallenge içinde akıllı Chimeric antijen reseptör T hücre antitümör işlevi değerlendirilmesi için

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Kanser Araştırmalarında Terapötik ve Tanısal Antikor Biyodağılımının Değerlendirilmesi için In Vivo Immunofluoresence Lokalizasyonu

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Tümör Antijene Özgü T Hücrelerinin Üretimi için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Kullanılması

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Analyzing Tumor Gene Expression Factors with the CorExplorer Web Portal

CorExplorer Web Portalı ile Tümör Gen Ekspresyonu Faktörlerinin Analizi

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Organotipik Tümör Doku Dilimlerinde Gerçek Zamanlı İlaç Yanıtının Ölçülmesi

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Meme Kanseri Beyin Metastatik Tümör Büyümesini İncelemek ve Hedeflemek için Ex Vivo Beyin Dilimi Modeli

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Implementation of Minimally Invasive Brain Tumor Resection in Rodents for High Viability Tissue Collection

Yüksek Canlılık Doku Toplanması için Kemirgenlerde Minimal İnvaziv Beyin Tümörü Rezeksiyonunun Uygulanması

The present protocol describes a standardized paradigm for rodent brain tumor resection and tissue preservation. In clinical practice, maximal tumor ...