Name: transcriptome-wide profiling of protein-rna interactions by cross-linking and immunoprecipitation mediated by flag-biotin tandem purification
Uploaded: 2020-05-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification at JoVE.com

الدعم المقدم من البرنامج الوطني للبحوث الأساسية في الصين (2017YFA0504204، 2018YFA0107604)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31630095)، ومركز علوم الحياة في جامعة تسينغهوا.

1. بناء خط الخلية
<ol><li>استنساخ الجين من الفائدة في pPiggyBac ناقلات PIGGYBac-FLAG-bio-[cDNA من الفائدة]-(Hygromycin-مقاومة) plasmid الذي يحمل epitope العلم البيوتين13,21 للتعبير عن علامة العلم البيوتين تنصهر RBP (FBRBP).</li>
	<li>Cotransfect FBRBP التعبير عن ناقلات مع ناقلات pBase في خط الخلية ا...

<ol>
	<li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates.">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li><li>Guallar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-dependent+chromatin+targeting+of+TET2+for+endogenous+retrovirus+control+in+pluripotent+stem+cells.">RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells.</a> Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).</li><li>Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Maps+of+ProQ+Binding+In+Vivo+Reveal+Target+Recognition+via+RNA+Structure+and+Stability+Control+at+mRNA+3'+Ends.">Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends.</a> Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).</li><li>Wei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBFox2+Binds+Nascent+RNA+to+Globally+Regulate+Polycomb+Complex+2+Targeting+in+Mammalian+Genomes.">RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes.</a> Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PARP-1+by+snoRNAs+Controls+Ribosome+Biogenesis+and+Cell+Growth+via+the+RNA+Helicase+DDX21.">Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).</li><li>Yao, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+Pre-rRNA+Sorting+via+Phase+Separation+Drives+the+Assembly+of+Dense+Fibrillar+Components+in+the+Human+Nucleolus.">Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus.</a> Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).</li><li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing.">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li><li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Argonaute+and+conventional+RNA-binding+protein+interactions+with+RNA+at+single-nucleotide+resolution+using+HITS-CLIP+and+CIMS+analysis.">Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).</li><li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=irCLIP+platform+for+efficient+characterization+of+protein-RNA+interactions.">irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions.</a> Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).</li><li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+(eCLIP).">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins.">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).</li><li>de Boer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li><li>Bi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Targets+Ribogenesis+Factor+WDR43+to+Chromatin+for+Transcription+and+Pluripotency+Control.">RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control.</a> Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).</li><li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT4+in+concert+with+Lin28+suppresses+microRNA+biogenesis+through+pre-microRNA+uridylation.">TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation.</a> Cell. 138 (4), 696-708 (2009).</li><li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28A+Is+a+Suppressor+of+ER-Associated+Translation+in+Embryonic+Stem+Cells.">LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+roles+for+the+ribosome+biogenesis+factor+Wdr43+in+zebrafish+development.">Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development.</a> PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).</li><li>Wilbert, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28+binds+messenger+RNAs+at+GGAGA+motifs+and+regulates+splicing+factor+abundance.">LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).</li><li>Hunziker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UtpA+and+UtpB+chaperone+nascent+pre-ribosomal+RNA+and+U3+snoRNA+to+initiate+eukaryotic+ribosome+assembly.">UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly.</a> Nature Communications. 7, 12090 (2016).</li><li>Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+vivo+biotinylation+to+study+protein-protein+and+protein-DNA+interactions+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).</li><li>Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+piggyBac+transposon-based+mammalian+cell+expression+system+for+inducible+protein+production.">Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).</li><li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li><li>Aktas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHX9+suppresses+RNA+processing+defects+originating+from+the+Alu+invasion+of+the+human+genome.">DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome.</a> Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).</li><li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Crosslinking+Immunoprecipitation+(eCLIP)+Method+for+Efficient+Identification+of+Protein-bound+RNA+in+Mouse+Testis.">Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).</li></ol>

هنا نقدم تعديل كليب - seq طريقة تسمى Fbioكليب -eq ، والاستفادة من نظام العلامات المزدوجة العلم biotin لأداء تنقية جنبا إلى جنب من مجمعات البروتين RNA. وقد ثبت أن نظام العلامات المزدوجة FLAG-BIOtin FLAG-FLAG (علم العلم) قوي في تحديد البروتينات والبروتينات والحمض النووي التفاعلات13,<sup cla...

RNAs والبروتينات RNA ملزمة (RBPs) السيطرة على العمليات الخلوية المتنوعة بما في ذلك الربط والترجمة والظهارة الحيوية الريبوسوم ، وتنظيم اللاجينية ، والتحول مصير الخلية1،2،3،4،5،6. وتتوقف الآليات الدقيقة لهذه العمليات على الترتيب المكاني والزماني الفريد للرنابات الوطنية والممارسات التجارية التقييدية. ولذلك، فإن خطوة هامة نحو فهم تنظيم الجيش الملكي النيبالي على المستوى الجزيئي هو الكشف عن المعلومات الموضعية حول المواقع الملزمة لـ RBPs.
وقد تم وضع استراتيجية يشار إليها بالربط المتبادل والمناعة (CLIP-seq) لالتقاط تفاعلات البروتين-الحمض النووي الريبي (RNA) مع ربط الأشعة فوق البنفسجية مع ربط عبر هاته تبعية مناعية للبروتين من الفائدة7. السمة الرئيسية للمنهجية هي التعريفي من التكافؤ عبر الروابط بين البروتين RNA ملزمة وجزيئاتها RNA ملزمة مباشرة (داخل ~ 1 Å) عن طريق الأشعة فوق البنفسجيةتشعيع 8. يمكن تحديد آثار الـ RBP بواسطة تجميع علامة CLIP ومكالمات الذروة ، والتي عادة ما يكون لها دقة 30-60 nt. بدلاً من ذلك، يمكن أن تؤدي خطوة النسخ العكسي من CLIP إلى الإنديلات (الإدراجات أو الحذف) أو استبدالات لمواقع الربط المتبادل، مما يسمح بتحديد مواقع ربط البروتين على الـ RNAs بدقة أحادية النيوكليوتيد. وقد تم تطوير خطوط الأنابيب مثل Novoalign و CIMS لتحليل نتائج تسلسل عالية الإنتاجية من كليب - seq8. كما تم اقتراح العديد من الطرق المعدلة CLIP-seq، بما في ذلك فرد-نوياتويد القرار عبر الربط والمناعة (iCLIP)، مقطع محسنة (eCLIP)، irCLIP، و ribonucleoside قابلة للفكّك معززة عبر الربط والمناعة (PAR-CLIP)9،10،11،12.
على الرغم من الاستخدام الواسع لأساليب CLIP-seq التقليدية في دراسة الممارسات التجارية التقييدية، فإن أساليب CLIP لها عدة عيوب. أولاً، قد يؤدي إجراء تحويل الأغشية الهلامية المُملة والتهلكة إلى فقدان المعلومات، ويسبب تعقيد تسلسل محدود. ثانياً، قد تؤدي طريقة CLIP المعتمدة على الأجسام المضادة للبروتين إلى سحب مركب بروتين بدلاً من بروتين مستهدف واحد، مما قد يؤدي إلى تفاعلات إيجابية كاذبة بين البروتين والرنا من الممارسات الناشئة عن الممارسات المضادة للدبابات (RBPs) المشتركة. ثالثاً، تتطلب الاستراتيجية القائمة على الأجسام المضادة كمية كبيرة من الأجسام المضادة عالية الجودة، مما يجعل تطبيق هذه الأساليب غير كاف لدراسة الممارسات التجارية التقييدية دون وجود أجسام مضادة عالية الجودة. رابعاً، تتطلب طريقة CLIP التقليدية من ATP المسمى بعلامة الإذاعة لتسمية الـ RNAs المرتبط بالبروتين.
التقارب العالي للبروتينات الحيوية يجعل من ذلك نهج قوي جدا لتنقية بروتينات معينة أو مجمعات البروتين. إن المعالجة الحيوية الفعالة للبروتينات التي تحمل تسلسلاً ببتيد اصطناعياً عن طريق الجرثومية البييرا ligase الحيوي في خلايا الثدييات يجعل من إستراتيجية فعالة لتنفيذ تنقية البيوتين في الجسم الحي13. وضعنا تعديل كليب- seq طريقة تسمى FbioCLIP-seq (FLAG-Bio-القصدير بوساطة Cروس-Lالتحبير وأناmmunoprecipitation تليها تسلسل عالية الإنتاجية) باستخدام العلامة FLAG-biotin التنقية جنبا إلى جنب14 (الشكل 1). من خلال تنقية جنبا إلى جنب وظروف الغسيل الصارمة، تتم إزالة تقريبا جميع RBPs التفاعل(الشكل 2). كما تسمح ظروف الغسيل الصارمة بالتحايل على SDS-PAGE ونقل الأغشية ، وهو أمر كثيف العمالة وصعب من الناحية الفنية. وعلى غرار eCLIP وeCLIP ، فإن طريقة FBIOCLIP-seq خالية من النظائر. تخطي الجل تشغيل ونقل الخطوات يتجنب فقدان المعلومات، ويحافظ على التفاعلات البروتين-RNA أصيلة سليمة، ويزيد من تعقيد المكتبة. وعلاوة على ذلك، فإن الكفاءة العالية لنظام وضع العلامات يجعلها خيارا جيدا ل RBPs دون الأجسام المضادة عالية الجودة المتاحة.
هنا نقدم وصفا خطوة بخطوة من بروتوكول FBIOكليب-seq لخلايا الثدييات. باختصار ، ترتبط الخلايا عبر 254 نانومتر فوق البنفسجية ، تليها تحلل الخلايا والمناعة FLAG (FLAG-IP). بعد ذلك ، يتم تنقية مجمعات البروتين-RNA عن طريق التقاط تقارب البيوتين ويتم تفتيت الحمض النووي الريبي عن طريق الهضم الجزئي مع MNase. ثم، فإن الحمض النووي الريبي البروتيني هو dephosphorylated و ligated مع رابط 3'. يتم إضافة رابط 5 'RNA بعد أن يتم phosphorylated الجيش الملكي النيبالي مع PNK و eluted بواسطة البروتين K الهضم. بعد النسخ العكسي، يتم تضخيم إشارات الحمض النووي الريبي البروتينية بواسطة PCR وتنقيتها تنقية جل agarose. تم اختيار اثنين من RBPs لتجسيد النتيجة FBIOCLIP-seq. LIN28 هو بروتين RNA ملزم بشكل جيد يشارك في نضج ميكرورنا ، وترجمة البروتين ، وإعادة برمجة الخلايا15،16،17. WDR43 هو WD40 المجال التي تحتوي على البروتين يعتقد أن تنسيق الريبوسوم biogenesis، النسخ eukaryotic، والسيطرة على الخلايا الجذعية الجنينية14،18. بما يتفق مع النتائج التي تم الإبلاغ عنها سابقا لLIN28 مع كليب- الصد، مكتب التحقيقات الفيدراليكليب-eq يكشف مواقع ملزمة من LIN28 على "GGAG" الزخارف في ميكرورنا مير let7g و mRNAs16،19 (الشكل 3). WDR43 FBIOCLIP-seq كما حددت تفضيل ملزم من WDR43 مع 5'الفواصل المنسوخة الخارجية (5'-ETS) من قبل rRNAs20 (الشكل 4). هذه النتائج التحقق من صحة موثوقية أسلوب FBIOCLIP-seq.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td>HL-2000 HybrilLinker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity Purification Beads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>112.06D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOAc</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 x FLAG peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>CIP buffer is in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0247S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M158-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porteinase K</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse trancriptase (SupperScriptIII)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation reagent (Trizol)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1614363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td>PNK buffer is in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligaes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EL0021</td>
			<td>T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td>T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mESC culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (80%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS (15%)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>purified recombinant protein; 10,000 fold dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoside mix (1%)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-008-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcriptome-wide profiling of protein-rna interactions by cross-linking and immunoprecipitation mediated by flag-biotin tandem purification

رنا والبروتينات RNA ملزمة (RBPs) السيطرة على العمليات البيولوجية المتعددة. 10- إن الترتيب المكاني والزماني للرنابات الوطنية والممارسات التجارية التقييدية يكمن في التنظيم الدقيق لهذه العمليات. وقد وُضعت استراتيجية تسمى CLIP-seq (الربط المتبادل والمناعة) لالتقاط تفاعلات البروتين والرنا الذاتية مع ربط الأشعة فوق البنفسجية المتداخلة متبوعة بالمناعة. وعلى الرغم من الاستخدام الواسع النطاق لأسلوب CLIP-seq التقليدي في دراسة RBP، فإن طريقة CLIP محدودة بسبب توافر أجسام مضادة عالية الجودة، والملوثات المحتملة من الممارسات التجارية التقييدية المشتركة، وشرط التلاعب بالنظائر، واحتمال فقدان المعلومات أثناء إجراء تجريبي شاق. هنا وصفنا تعديل طريقة CLIP-seq تسمى FbioCLIP-seq باستخدام تنقية العلامة FLAG-biotin جنبا إلى جنب. من خلال تنقية جنبا إلى جنب وظروف الغسيل الصارمة، تتم إزالة تقريبا جميع البروتينات تفاعل RNA ملزمة. وهكذا، فإن الـ RNAs التي تتفاعل بصورة غير مباشرة بواسطة هذه الممارسات التجارية التقييدية المشتركة قد انخفضت أيضاً. يسمح أسلوبنا FBIOCLIP-seq بالكشف الفعال عن الرنا الرنا المباشرة المربوطة بالبروتين دون إجراءات نقل الغشاء SDS-PAGE بطريقة خالية من النظائر والخالية من الأجسام المضادة للبروتين.

يتم عرض التمثيل التخطيطي للإجراء FBIOCLIP-seq في الشكل 1. بالمقارنة مع العلم بوساطة أو streptavidin بوساطة خطوة واحدة من التنقية التقارب ، ورف biotin التنقية جنبا إلى جنب إزالة تقريبا جميع البروتينات المشتركة ، وتجنب تلوث البروتين غير المباشر - RNA التفاعلات(الشكل 2). ...

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification at JoVE.com

Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

هنا نقدم تعديل بروتوكول CLIP-seq يسمى FbioCLIP-eq مع تنقية جنبا إلى جنب العلم biotin لتحديد أهداف الحمض النووي الريبي من البروتينات RNA ملزمة (RBPs) في خلايا الثدييات.

نسخ على نطاق التنميط من البروتين RNA التفاعلات من خلال ربط عبر والمناعة بوساطة العلم Biotin تنقية جنبا إلى جنب

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

فقط وفقط البروتينات ملزمة السيطرة على العمليات البيولوجية المتعددة. هذه الطريقة FLAG-Biotin CLIP-seq، وبالتالي لمحة عالمية عن الترتيب الخاص والزمني للرنا رنا و RBPs في خلايا الثدييات. هذه الطريقة تسمح بالكشف الفعال عن الرنا الرنا البروتينية المباشرة دون SDS-PAGE وإجراءات نقل الغشاء.بالمقارنة مع التقليدية كليب-seq هو النظائر الحرة وأنها لا تتطلب الأجسام المضادة البروتين محددة. تبدأ من خلال طلاء حوالي 3 ملايين الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في لوحة 10 سم واحتضانها بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، وإزالة المتوسطة مع فراغ وعلاج الخلايا مع مليلتر اثنين من 0.25٪ التربسين EDTA لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.إخماد التربسين مع أربعة ملليلترات من المتوسط MESC الطازجة، ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر. ثم، الطرد المركزي لهم في 300 مرة G لمدة ثلاث دقائق في أربع درجات مئوية وإزالة فائقة. تعليق الخلايا في أربعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة ونقلها مرة أخرى إلى لوحة 10 سنتيمترا لربط عبر.يشع الخلايا بأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر، ثم نقل الخلايا المترابطة إلى أنبوب 15 ملليلتر. تدور أسفل هذه الخلايا في 300 مرة G لمدة ثلاث دقائق في أربع درجات مئوية، ثم إزالة supernatant وlyse الخلايا مع 500 ميكرولترات من العازلة A أعدت وفقا لاتجاهات المخطوطات. نقل الخلايا إلى RNAse خالية من 1.5 ملليلتر أنبوب, واحتضان لهم في أربع درجات مئوية مع تناوب لطيف لمدة 30 إلى 60 دقيقة.علاج lysate مع 30 ميكرولترات من DNAse 1 في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم، وقف رد الفعل عن طريق إضافة أربعة ميكرولترات من 0.5 EDTA الضرس. تدور أسفل بيليه غير قابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي في 12، 000 مرات G لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية، ونقل سوبرنات إلى أنبوب جديد المبردة قبل 1.5 ملليلتر.نقل الخلية إلى الخرز FLAG بعد توازنها، واحتضان العينة في أربع درجات مئوية أثناء تدوير لمدة ساعتين إلى أربع ساعات. بعد الحضانة، الطرد المركزي الخرز لمدة دقيقتين في 3000 مرات G وإزالة عظمى. إضافة 500 ميكرولترات من العازلة A إلى العينة، ومحتضنة في 4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق، ثم تدور أسفل الخرز وإزالة ناظر.كرر الغسيل مع Buffer A ، تليها غسولتان مع المخزن المؤقت المبرد B.To مع ثلاث ببتيد FLAG ، وإعداد حل elution كما هو موضح في مخطوطة النص وتدور أسفل حبات FLAG. إزالة supernatant مع طرف ماصة نهاية ضيقة وإضافة 200 ميكرولترات من ثلاثة X FLAG حل elution لكل عينة. احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية مع تناوب لطيف.ثم تدور أسفل الخرز لمدة دقيقتين في 3000 مرة G.Transfer supernate إلى أنبوب جديد وتكرار elution مرتين. حفظ 5٪ من الأراضي الممَلَس لتحليل البقعة الغربية أو تلطيخ الفضة للتحقق من كفاءة علم المناعة FLAG. نقل المزائلين المسحوبة إلى الخرز streptavidin المعدة وتدوير العينات بلطف في أربع درجات مئوية لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات أو بين عشية وضحاها.ثم، وجمع الخرز على موقف مغناطيسي وإزالة افرا. اغسل الخرز مرتين مع 500 ميكرولترات من Buffer C مع دوران لطيف لمدة خمس دقائق لكل غسل. المقبل، وغسل الخرز مرتين مع 500 ميكرولترات من العازلة D، ومرتين مع 500 ميكرولترات من الجليد الباردة PNK العازلة، وجمع الخرز على المنصة المغناطيسية وإزالة supernatant في بين يغسل.لإجراء الهضم الجزئي للرنا، أضف 100 ميكرولترات من محلول MNA لكل عينة ودوامة مضنية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع خلاط حراري لمدة 10 دقائق. جمع الخرز مع موقف مغناطيسي لمدة 30 ثانية وإزالة supernatant. ثم قم بغسلها بمخزن PNK-EDTA المؤقت، و Buffer C، و PNK buffer وفقاً لتوجيهات المخطوطة.جمع الخرز مع موقف المغناطيسي وإزالة العازلة. ثم، إضافة مزيج التفاعل CIP ودوامة الخرز في 37 درجة مئوية مع خلاط الحرارية لمدة 10 دقائق. سرعان ما يغسل الخرز مرتين مع 500 ميكرولترات من الجليد الباردة PNK EDTA العازلة، تليها اثنين من يغسل مع 500 ميكرولترات من الجليد الباردة PNK العازلة.بعد يغسل، إضافة 40 ميكروليتر من ثلاثة مزيج ربط الرابط رئيس إلى الخرز، ودوامة لهم في 16 درجة مئوية مع خلاط الحرارية لمدة ثلاث ساعات أو بين عشية وضحاها. إن الربط الفعال بين الرابط والحلفاء أمر بالغ الأهمية لهذه التجربة. تحقق من أنبوب التفاعل في بعض الأحيان للتأكد من أن هذه لا تتعجل أثناء الربط.بعد الحضانة، كرر يغسل مع PNK EDTA ومخازن PNK، إضافة 40 ميكرولترات من PNK مختلطة إلى الخرز، ودوامة لهم في 37 درجة مئوية مع خلاط الحرارية لمدة 10 دقائق. اغسل الخرز بمخازن PNK EDTA وPNK، ثم تابع مع عزل RNA كما هو موضح في مخطوطة النص. بالمقارنة مع العلم بوساطة أو streptavidin بوساطة خطوة واحدة تنقية التقارب، إزالة تنقية جنبا إلى جنب العلم Biotin-1 تقريبا جميع البروتينات النقية الأساسية، وتجنب تلوث التفاعلات غير المباشرة البروتين RNA.LIN28 وWDR43، تم تنفيذ Fbio CLIP-seq باستخدام خلايا الماوس الجنينية الجذعية. في المجموع، تم استرجاع حوالي 7.7 مليون و 2.2 مليون قراءة فريدة من نوعها لLIN28 و WDR43 على التوالي. مقارنة بين وجهات النظر المسار تظهر أنماط ملزمة مختلفة في RN45 قبل rrna مكان.المواقع المترابطة على GGA G عزر من قبل let7 ز RNA من قبل LIN28، FBIO كليب-eq أو التي تم تحديدها. وعلاوة على ذلك، تم تحديد زخارف الحمض النووي الريبي المخصب في مواقع الربط، والنسبة المئوية للنيوكليوتيدات المتحولة في أنواع مختلفة من الطفرات. تبين أن LIN28 يفضل ربط إلى النوكليوتيدات الجينية.حسنا، في الساعة 10:00 مساء، هذا البروتوكول، من المهم أن نؤكد كفاءة المناعة للتأكد من أن البروتين فقط المجمعات تم تنقيتها بنجاح.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

تحليل ج- كيت يجند المروج باستخدام الكروماتين مناعي

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

التحقيق في توليف الحمض النووي الريبي استخدام الوسم 5-بروموريديني وإيمونوبريسيبيتيشن

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

مروج التقاط مرحبا c: عالية الاستبانة، وعلى نطاق الجينوم التنميط التفاعلات المروج

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين للنسيج الدهني البنى موريني

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

تحليل متعدد المواقع المتغيرة- تكرار جنبا إلى جنب من البكتيريا المسببة للأمراض الأسماك Yersinia ruckeri بواسطة متعددة PCR والكهربائي الشعرية

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein بوساطة تحرير الجينات الدقيقة عن طريق أنبوب الكهربائي

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

اختبار لتحديد كمية البروتين-RNA الربط في البكتيريا

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

تحديد آثار أقدام RNA: مجمعات البروتين عن طريق الحمض النووي الريبي المناعيفية جنبا إلى جنب تليها التسلسل (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

تحويل، تحرير الجينوم والفينولات في نتروجين تحديد شجرة كاناباسيا الاستوائية Parasponia أندرسوني

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...