Name: transcriptome-wide profiling of protein-rna interactions by cross-linking and immunoprecipitation mediated by flag-biotin tandem purification
Uploaded: 2020-05-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification at JoVE.com

Grant support er fra National Basic Research Program of China (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), National Natural Science Foundation of China (31630095) og Center for Life Sciences på Tsinghua University.

1. Cellelinjekonstruktion
<ol><li>Klon genet af interesse i en PiggyBac vektor pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA af interesse]-(Hygromycin-resistente) plasmid, der bærer en FLAG-biotin epitop13,21 til at udtrykke en FLAG-biotin tag smeltet RBP (FBRBP).</li>
	<li>Cotransfect FBRBP udtrykke vektor med pBase vektor i en celle linje, der udtrykker BirAenzym 22. BEMÆRK: I denne undersøgelse blev FBRBP-genet trans...

<ol>
	<li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates.">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li><li>Guallar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-dependent+chromatin+targeting+of+TET2+for+endogenous+retrovirus+control+in+pluripotent+stem+cells.">RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells.</a> Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).</li><li>Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Maps+of+ProQ+Binding+In+Vivo+Reveal+Target+Recognition+via+RNA+Structure+and+Stability+Control+at+mRNA+3'+Ends.">Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends.</a> Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).</li><li>Wei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBFox2+Binds+Nascent+RNA+to+Globally+Regulate+Polycomb+Complex+2+Targeting+in+Mammalian+Genomes.">RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes.</a> Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PARP-1+by+snoRNAs+Controls+Ribosome+Biogenesis+and+Cell+Growth+via+the+RNA+Helicase+DDX21.">Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).</li><li>Yao, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+Pre-rRNA+Sorting+via+Phase+Separation+Drives+the+Assembly+of+Dense+Fibrillar+Components+in+the+Human+Nucleolus.">Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus.</a> Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).</li><li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing.">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li><li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Argonaute+and+conventional+RNA-binding+protein+interactions+with+RNA+at+single-nucleotide+resolution+using+HITS-CLIP+and+CIMS+analysis.">Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).</li><li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=irCLIP+platform+for+efficient+characterization+of+protein-RNA+interactions.">irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions.</a> Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).</li><li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+(eCLIP).">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins.">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).</li><li>de Boer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li><li>Bi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Targets+Ribogenesis+Factor+WDR43+to+Chromatin+for+Transcription+and+Pluripotency+Control.">RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control.</a> Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).</li><li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT4+in+concert+with+Lin28+suppresses+microRNA+biogenesis+through+pre-microRNA+uridylation.">TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation.</a> Cell. 138 (4), 696-708 (2009).</li><li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28A+Is+a+Suppressor+of+ER-Associated+Translation+in+Embryonic+Stem+Cells.">LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+roles+for+the+ribosome+biogenesis+factor+Wdr43+in+zebrafish+development.">Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development.</a> PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).</li><li>Wilbert, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28+binds+messenger+RNAs+at+GGAGA+motifs+and+regulates+splicing+factor+abundance.">LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).</li><li>Hunziker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UtpA+and+UtpB+chaperone+nascent+pre-ribosomal+RNA+and+U3+snoRNA+to+initiate+eukaryotic+ribosome+assembly.">UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly.</a> Nature Communications. 7, 12090 (2016).</li><li>Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+vivo+biotinylation+to+study+protein-protein+and+protein-DNA+interactions+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).</li><li>Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+piggyBac+transposon-based+mammalian+cell+expression+system+for+inducible+protein+production.">Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).</li><li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li><li>Aktas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHX9+suppresses+RNA+processing+defects+originating+from+the+Alu+invasion+of+the+human+genome.">DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome.</a> Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).</li><li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Crosslinking+Immunoprecipitation+(eCLIP)+Method+for+Efficient+Identification+of+Protein-bound+RNA+in+Mouse+Testis.">Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).</li></ol>

Her introducerer vi en modificeret CLIP-seq metode kaldet FbioCLIP-seq, drage fordel af FLAG-biotin dobbelt tagging system til at udføre tandem rensning af protein-RNA komplekser. DET DOBBELTE MÆRKNINGssystem FLAG-biotin har vist sig at være effektivt til at identificere proteinprotein- og protein-DNA-interaktioner13,21. Her demonstrerer vi den høje specificitet og bekvemmelighed af dette system i at identificere RNA'er interagere med proteiner. Ge...

RNA'er og RNA-bindende proteiner (RBP' er) styrer forskellige cellulære processer, herunder splejsning, oversættelse, ribosombiogenese, epigenetisk regulering og celle fate transition1,2,3,4,5,6. De sarte mekanismer i disse processer afhænger af den unikke rumlige og tidsmæssige arrangement af RNA'er og RBP'er. Derfor er et vigtigt skridt i retning af at forstå RNA-regulering på molekylært niveau at afsløre positionelle oplysninger om de bindende steder af RBPs.
En strategi kaldet krydsbinding og immunafhentning (CLIP-seq) er udviklet til at indfange protein-RNA-interaktioner med UV-krydsbinding efterfulgt af immunafhentning af protein af interesse7. Det vigtigste træk ved metoden er induktionen af kovale krydsforbindelser mellem et RNA-bindende protein og dets direkte bundne RNA-molekyler (inden for ~ 1 Å) ved UV-bestråling8. RBP-fodsporene kan bestemmes af CLIP-tagklynger og spidsopkald, som normalt har en opløsning på 30−60 nt. Alternativt kan den omvendte transskriptionstrin af CLIP føre til indels (indsættelser eller sletninger) eller erstatninger til krydsbindingsstederne, hvilket gør det muligt at identificere proteinbindingssteder på RNA'erne ved en opløsning af en enkelt nukleotid. Der er udviklet rørledninger som Novoalign og CIMS til analyse af sekventeringsresultaterne med høj kapacitet i CLIP-seq8. Der er også foreslået flere modificerede CLIP-seq-metoder, herunder individuel nukleotidopløsning krydsbinding og immunudfrielse (iCLIP), forbedret CLIP (eCLIP), irCLIP og fotoaktivatable ribonucleoside-enhanced cross-linking and immunoprecipitation (PAR-CLIP)9,10,11,12.
På trods af den udbredte brug af traditionelle CLIP-seq metoder i studiet af RBPs, CLIP metoder har flere ulemper. For det første kan den kedelige denatureret gelelektroforese og membranoverførselsprocedure føre til tab af information og forårsage begrænset sekvenskompleksitet. For det andet kan den proteinspecifikke antistofbaserede CLIP-metode trække et proteinkompleks ned i stedet for et enkelt målprotein, hvilket kan føre til falske positive protein-RNA-interaktioner fra de kopurified RBPs. For det tredje kræver den antistofbaserede strategi en stor mængde antistoffer af høj kvalitet, hvilket gør anvendelsen af disse metoder utilstrækkelig til undersøgelse af ringmekanismer uden antistoffer af høj kvalitet. For det fjerde kræver den traditionelle CLIP-metode radioaktivt mærkede ATP for at mærke de proteinbundne RNA'er.
Den høje affinitet af streptavidin til biotinylerede proteiner gør det til en meget kraftfuld tilgang til at rense specifikke proteiner eller protein komplekser. Den effektive biotinylation af proteiner, der bærer en kunstig peptid sekvens ved ektopisk udtrykt bakteriel BirA biotin ligase i pattedyr celler gør det til en effektiv strategi for at udføre biotin rensning in vivo13. Vi udviklede en modificeret CLIP-seq metode kaldet FbioCLIP-seq (FLAG-Biotin-medieret Cross-lhåndskrift og jegmmunoprecipitation efterfulgt af høj-throughput sekventering) ved hjælp af FLAG-biotin tag tandemrensning 14 (Figur 1). Gennem tandemrensning og strenge vaskebetingelser fjernes næsten alle de interagerende ringmekanismer med sideløbende ringmekanismer med samme måde (figur 2). De strenge vaskebetingelser gør det også muligt at omgå SDS-PAGE og membranoverførsel, som er arbejdskrævende og teknisk udfordrende. Og svarende til eCLIP og irCLIP, FbioCLIP-seq metode er isotop-fri. Ved at springe gelen over løbende og overføre trin undgår du tab af information, holder autentiske protein-RNA-interaktioner intakte og øger bibliotekets kompleksitet. Desuden gør mærkningssystemets høje effektivitet det til et godt valg for ringmekanismer uden antistoffer af høj kvalitet.
Her giver vi en trinvis beskrivelse af FbioCLIP-seq-protokollen for pattedyrceller. Kort, celler er krydsforbandet med 254 nm UV, efterfulgt af celle lysis og FLAG immunoprecipation (FLAG-IP). Dernæst renses protein-RNA-komplekserne yderligere ved biotinaffæritetsfangst, og RNA'er er fragmenteret ved delvis fordøjelse med MNase. Derefter dephosphorylated det proteinbundne RNA og ligated med en 3' linker. Der tilsættes en 5' RNA-linker, når RNA'et er fosforyleret med PNK og eluteret ved proteinase K-fordøjelse. Efter omvendt transskription forstærkes de proteinbundne RNA-signaler af PCR og renses ved agarosegelrensning. To RBPs blev valgt til at eksemplificere FbioCLIP-seq resultat. LIN28 er et vel karakteriseret RNA-bindende protein, der er involveret i mikroRNAmodning, proteinoversættelse og celleomprogrammering15,16,17. WDR43 er et WD40 domæne-holdige protein menes at koordinere ribososom biogenese, eukaryote transskription, og embryonale stamceller pluripotency kontrol14,18. I overensstemmelse med tidligere rapporterede resultater for LIN28 med CLIP-seq, FbioCLIP-seq afslører bindende steder af LIN28 på "GGAG" motiver i microRNA mir-let7g og mRNAs16,19 (Figur 3). WDR43 FbioCLIP-seq identificerede også den bindende præference for WDR43 med 5' eksterne transskriberede afstandsholdere (5'-ETS) af præ-rRNAs20 (Figur 4). Disse resultater validere pålideligheden af FbioCLIP-seq metode.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td>HL-2000 HybrilLinker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity Purification Beads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>112.06D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOAc</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 x FLAG peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>CIP buffer is in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0247S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M158-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porteinase K</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse trancriptase (SupperScriptIII)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation reagent (Trizol)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1614363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td>PNK buffer is in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligaes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EL0021</td>
			<td>T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td>T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mESC culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (80%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS (15%)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>purified recombinant protein; 10,000 fold dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoside mix (1%)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-008-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcriptome-wide profiling of protein-rna interactions by cross-linking and immunoprecipitation mediated by flag-biotin tandem purification

RNA- og RNA-bindende proteiner (RBP' er) styrer flere biologiske processer. Den rumlige og tidsmæssige placering af RNA'er og ringmekanismer ligger til grund for den skrøbelige regulering af disse processer. En strategi kaldet CLIP-seq (krydsbinding og immunfrit) er udviklet til at indfange endogene protein-RNA interaktioner med UV cross-linking efterfulgt af immunoprecipitation. På trods af den udbredte brug af konventionel CLIP-seq-metode i RBP-studiet er CLIP-metoden begrænset af tilgængeligheden af antistoffer af høj kvalitet, potentielle forurenende stoffer fra de copurified RBP'er, kravet om isotopmanipulation og potentielt tab af oplysninger under en kedelig forsøgsprocedure. Her beskriver vi en modificeret CLIP-seq metode kaldet FbioCLIP-seq ved hjælp af FLAG-biotin tag tandem rensning. Gennem tandemrensning og strenge vaskebetingelser fjernes næsten alle interagerende RNA-bindende proteiner. De RNA'er, der indirekte medieres af disse copurified RBP'er, er således også reduceret. Vores FbioCLIP-seq-metode muliggør effektiv påvisning af direkte proteinbundne RNA'er uden SDS-PAGE- og membranoverførselsprocedurer på en isotopfri og proteinspecifik antistoffri måde.

Den skematiske repræsentation af FbioCLIP-seq-proceduren er vist i figur 1. Sammenlignet med FLAG-medieret eller streptavidin-medieret et-trins affinitetsrensning fjernede FLAG-biotin tandemrensning næsten alle kopurificerede proteiner, så man undgik forurening af indirekte protein-RNA-interaktioner (Figur 2). Repræsentative resultater for FbioCLIP-seq for LIN28 og WDR43 er afbildet i figur 3 og <strong cla...

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification at JoVE.com

Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

Her præsenterer vi en modificeret CLIP-seq protokol kaldet FbioCLIP-seq med FLAG-biotin tandem rensning for at bestemme RNA-målene for RNA-bindende proteiner (RBPs) i pattedyrceller.

Transkription-wide profilering af Protein-RNA interaktioner ved cross-linking og immunoprecipation medieret af FLAG-Biotin Tandem Rensning

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

Kun og kun bindende proteiner styrer flere biologiske processer. Denne FLAG-Biotin CLIP-seq-metode, og dermed til globalt at profilere den særlige og tidsmæssige arrangement af RNA'er og RBP'er i pattedyrceller. Denne metode muliggør effektiv påvisning af direkte proteinbundne RNA'er uden SDS-PAGE og membranoverførselsprocedurerne.Sammenlignet med traditionel CLIP-seq er isotopfri, og det kræver ikke proteinspecifikt antistof. Begynd med plating omkring 3 millioner mus embryonale STAMCELLER i en 10 centimeter plade og inkubere dem natten over. Den næste dag fjernes mediet med et vakuum, og cellerne behandles med to milliliter 0,25 %trypsin EDTA i to minutter ved stuetemperatur.Sluk trypsin med fire milliliter frisk MESC medium, og overføre cellerne til en 15 milliliter centrifuge rør. Derefter centrifuge dem på 300 gange G i tre minutter ved fire grader Celsius og fjerne supernatant. Ophæng cellerne i fire milliliter kold PBS og overføre dem tilbage til 10 centimeter plade til krydsbinding.Udstråle cellerne med et 254 nanometer UV-lys, og overfør derefter de krydsforbundne celler til et 15 milliliterrør. Spin ned denne celler på 300 gange G i tre minutter ved fire grader Celsius, derefter fjerne supernatant og lyse cellerne med 500 mikroliter buffer A udarbejdet i henhold til manuskript retninger. Overfør cellerne til et RNAse-frit 1,5 milliliterrør, og inkuber dem ved fire grader Celsius med skånsom rotation i 30 til 60 minutter.Lysatet med 30 mikroliter DNAse 1 ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Derefter stoppe reaktionen ved at tilføje fire mikroliter af 0,5 molar EDTA. Drej den uopløselige pellet ved centrifugering ved 12,000 gange G i 20 minutter ved fire grader Celsius, og overfør supernatanten til et nyt forkølet 1,5 milliliterrør.Cellerelysatet overføres til præekvilibrerede FLAG-perler, og prøven inkuberes ved fire grader Celsius, mens den roterer i to til fire timer. Efter inkubationen centrifuger perlerne i to minutter ved 3000 gange G og fjern supernatanten. Tilsæt 500 mikroliter buffer A til prøven, og inkuberes ved 4 grader Celsius i fem minutter, drej derefter ned perlerne og fjern supernatanten.Gentag vasken med Buffer A, efterfulgt af to vasker med forkølet Buffer B.To elute med et tre X FLAG-peptid, klargør elution-opløsningen som beskrevet i tekstmanuskriptet, og drej flag-perlerne ned. Fjern supernatanten med en smal endepipettespids, og tilsæt 200 mikroliter af de tre X FLAG-opløsninger til hver prøve. Inkuber prøverne i 30 minutter ved fire grader Celsius med skånsom rotation.Drej derefter perlerne ned i to minutter ved 3000 gange G.Overfør superfæatet til et frisk rør og gentag elution to gange. Spar 5% af eluer til Western blot analyse eller sølv farvning for at kontrollere effektiviteten af FLAG immunoprecipitation. Overfør de trak elluenter til forberedt streptavidin perler og rotere prøverne forsigtigt ved fire grader Celsius i en til tre timer eller natten over.Derefter indsamle perlerne på en magnetisk stativ og fjern supernatant. Vask perlerne to gange med 500 mikroliter buffer C med skånsom rotation i fem minutter pr vask. Dernæst vaskes perlerne to gange med 500 mikroliter buffer D, og to gange med 500 mikroliter iskold PNK buffer, indsamle perlerne på den magnetiske stativ og fjerne supernatanten i mellem vasker.For at udføre delvis RNA-fordøjelse skal der tilsættes 100 mikroliter MNA-opløsning til hver prøve og vortex indstillet til 37 grader Celsius med en termisk mixer i 10 minutter. Saml perlerne med en magnetisk stander i 30 sekunder og fjern supernatanten. Vask dem derefter med PNK-EDTA buffer, Buffer C og PNK buffer i henhold til manuskriptanvisninger.Saml perlerne med den magnetiske stativ og fjern bufferen. Derefter tilsættes CIP reaktion mix og vortex perlerne ved 37 grader Celsius med en termisk mixer i 10 minutter. Vask hurtigt perlerne to gange med 500 mikroliter iskold PNK EDTA buffer, efterfulgt af to vasker med 500 mikroliter iskold PNK buffer.Efter vask, tilsæt 40 mikroliter af tre prime linker ligation mix til perlerne, og vortex dem ved 16 grader Celsius med en termisk mixer i tre timer eller natten over. Effektiv ligation af linker til de allierede er afgørende for dette eksperiment. Reaktionsrøret kontrolleres af og til for at sikre, at disse ikke udfældes under ligation.Efter inkubationen gentages vaskerne med PNK EDTA og PNK-buffere, tilsættes 40 mikroliter PNK blandet til perlerne, og vortex dem ved 37 grader Celsius med den termiske mixer i 10 minutter. Vask perlerne med PNK EDTA og PNK buffere, og fortsæt derefter med RNA isolation som beskrevet i tekstmanuskriptet. Sammenlignet med FLAG-medieret eller streptavidin medieret et skridt affinitet rensning, FLAG-Biotin tandem rensning fjernet næsten alle de centrale rensede proteiner, undgå forurening af indirekte protein RNA interaktioner.LIN28 og WDR43, Fbio CLIP-seq blev udført ved hjælp af mus embryonale STAMCELLER. I alt blev der hentet mellem 7,7 og 2,2 millioner unikke læsninger for henholdsvis LIN28 og WDR43. Sammenligning af sporvisningerne viser forskellige bindingsmønstre i RN45 pre-rRNA locus.De krydsforbundne steder på GGA G motiv af pre-let7-g RNA ved LIN28, Fbio CLIP-seq eller identificeret. Desuden blev berigede RNA-motiver i bindingsstederne og procentdelen af muterede nukleotider i forskellige typer mutationer bestemt. Viser, at LIN28 foretrækker at binde sig til genet nukleotid.Nå, på 10:00, denne protokol, er det vigtigt at bekræfte effektiviteten af immunoprecipitation for at sikre, at proteinet kun komplekser blev renset med succes.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Analyse af c-KIT ligand-promotoren ved anvendelse af chromatinimmunpræcipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Undersøgelse af RNA syntese ved hjælp af 5-Bromouridine mærkning og Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Promotor Capture Hej-C: Høj opløsning, Genome-wide profilering af promotor interaktioner

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Kromatin Immunoprecipitation af Murine brunt fedtvæv

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus variabel-tal tandem-Gentag analyse af den fisk-patogene bakterie Yersinia ruckeri ved MULTIPLEX PCR og kapillar elektroforese

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-medieret præcis Genredigering ved Rørelektroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

En analyse til kvantificering af protein-RNA-binding i bakterier

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identifikation af fodspor af RNA: protein komplekser via RNA Immunopræcipitation i tandem efterfulgt af sekventering (RIPiT-SEQ)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Omdanne, genomredigering og Phenotyping kvælstofbindende tropisk Cannabaceae træ Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...