Name: transcriptome-wide profiling of protein-rna interactions by cross-linking and immunoprecipitation mediated by flag-biotin tandem purification
Uploaded: 2020-05-18T13:00:00
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Le soutien des subventions est du Programme national de recherche fondamentale de Chine (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), de la National Natural Science Foundation of China (31630095) et du Center for Life Sciences de l’Université de Tsinghua.

1. Construction de lignes cellulaires
<ol><li>Cloner le gène d’intérêt dans un vecteur PiggyBac pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA d’intérêt]-(Hygromycine-résistant) plasmide qui porte un FLAG-biotin epitope13,21 pour exprimer une étiquette FLAG-biotine fusionné RBP(FBRBP).</li>
	<li>Cotransfecter le vecteur d’expression FBRBP avec le vecteur pBase dans une lignée cellulaire exprimant l’enzyme BirA22. REMA...

<ol>
	<li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates.">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li><li>Guallar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-dependent+chromatin+targeting+of+TET2+for+endogenous+retrovirus+control+in+pluripotent+stem+cells.">RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells.</a> Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).</li><li>Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Maps+of+ProQ+Binding+In+Vivo+Reveal+Target+Recognition+via+RNA+Structure+and+Stability+Control+at+mRNA+3'+Ends.">Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends.</a> Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).</li><li>Wei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBFox2+Binds+Nascent+RNA+to+Globally+Regulate+Polycomb+Complex+2+Targeting+in+Mammalian+Genomes.">RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes.</a> Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PARP-1+by+snoRNAs+Controls+Ribosome+Biogenesis+and+Cell+Growth+via+the+RNA+Helicase+DDX21.">Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).</li><li>Yao, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+Pre-rRNA+Sorting+via+Phase+Separation+Drives+the+Assembly+of+Dense+Fibrillar+Components+in+the+Human+Nucleolus.">Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus.</a> Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).</li><li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing.">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li><li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Argonaute+and+conventional+RNA-binding+protein+interactions+with+RNA+at+single-nucleotide+resolution+using+HITS-CLIP+and+CIMS+analysis.">Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).</li><li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=irCLIP+platform+for+efficient+characterization+of+protein-RNA+interactions.">irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions.</a> Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).</li><li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+(eCLIP).">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins.">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).</li><li>de Boer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li><li>Bi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Targets+Ribogenesis+Factor+WDR43+to+Chromatin+for+Transcription+and+Pluripotency+Control.">RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control.</a> Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).</li><li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT4+in+concert+with+Lin28+suppresses+microRNA+biogenesis+through+pre-microRNA+uridylation.">TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation.</a> Cell. 138 (4), 696-708 (2009).</li><li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28A+Is+a+Suppressor+of+ER-Associated+Translation+in+Embryonic+Stem+Cells.">LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+roles+for+the+ribosome+biogenesis+factor+Wdr43+in+zebrafish+development.">Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development.</a> PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).</li><li>Wilbert, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28+binds+messenger+RNAs+at+GGAGA+motifs+and+regulates+splicing+factor+abundance.">LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).</li><li>Hunziker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UtpA+and+UtpB+chaperone+nascent+pre-ribosomal+RNA+and+U3+snoRNA+to+initiate+eukaryotic+ribosome+assembly.">UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly.</a> Nature Communications. 7, 12090 (2016).</li><li>Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+vivo+biotinylation+to+study+protein-protein+and+protein-DNA+interactions+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).</li><li>Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+piggyBac+transposon-based+mammalian+cell+expression+system+for+inducible+protein+production.">Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).</li><li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li><li>Aktas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHX9+suppresses+RNA+processing+defects+originating+from+the+Alu+invasion+of+the+human+genome.">DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome.</a> Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).</li><li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Crosslinking+Immunoprecipitation+(eCLIP)+Method+for+Efficient+Identification+of+Protein-bound+RNA+in+Mouse+Testis.">Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).</li></ol>

Ici, nous introduisons une méthode CLIP-seq modifiée appelée FBIoCLIP-seq, en profitant du système flag-biotine double marquage pour effectuer la purification en tandem des complexes protéines-ARN. Il a été démontré que le système de double étiquetage FLAG-biotine est puissant pour identifier les interactions protéine-protéines et protéines-ADN13,21. Ici, nous démontrons la grande spécificité et la commodité de ce système dans l’id...

Les ARN et les protéines liant l’ARN contrôlent divers processus cellulaires, y compris l’épissage, la traduction, la biogenèse ribosome, la régulation épigénétique et la transition du destincellulaire 1,2,3,4,5,6. Les mécanismes délicats de ces processus dépendent de l’arrangement spatial et temporel unique des ARN et des PRR. Par conséquent, une étape importante vers la compréhension de la régulation de l’ARN au niveau moléculaire consiste à révéler les informations positionnelles sur les sites contraignants des P RB.
Une stratégie appelée liaison croisée et immunoprécipitation (CLIP-seq) a été mise au point pour capturer les interactions protéine-ARN avec les liaisons UV suivies de l’immunoprécipitation de la protéine d’intérêt7. La principale caractéristique de la méthodologie est l’induction de liens croisés covalents entre une protéine liant l’ARN et ses molécules d’ARN directement liées (dans ~1 Å) par irradiation UV8. Les empreintes RBP peuvent être déterminées par le clustering des balises CLIP et l’appel de pointe, qui ont généralement une résolution de 30−60 nt. Alternativement, l’étape de transcription inverse de CLIP peut conduire à des indélébiles (insertions ou suppressions) ou des substitutions aux sites de liaison croisée, ce qui permet d’identifier les sites de liaison protéique sur les ARN à une résolution à nucléotide unique. Des pipelines comme Novoalign et CIMS ont été développés pour l’analyse des résultats de séquençage à haut débit de CLIP-seq8. Plusieurs méthodes clip-seq modifiées ont également été proposées, y compris la résolution individu-nucléotide reliant et immunoprécipitant (iCLIP), clip amélioré (eCLIP), irCLIP, et ribonucleoside-amélioré photoactivatable cross-linking and immunoprecipitation (PAR-CLIP)9,10,11,12.
Malgré l’utilisation à grande échelle des méthodes traditionnelles clip-seq dans l’étude des P RB, les méthodes CLIP présentent plusieurs inconvénients. Tout d’abord, l’électrophoresis de gel dénaturé fastidieux et la procédure de transfert de membrane peuvent mener à la perte de l’information, et causer la complexité limitée de séquence. Deuxièmement, la méthode clip à base d’anticorps protéiques peut tirer vers le bas un complexe protéique au lieu d’une seule protéine cible, ce qui peut conduire à de fausses interactions positives protéine-ARN à partir des RBPs copurifiés. Troisièmement, la stratégie à base d’anticorps nécessite une grande quantité d’anticorps de haute qualité, ce qui rend l’application de ces méthodes inadéquate pour l’étude des RBPs sans anticorps de haute qualité disponibles. Quatrièmement, la méthode CLIP traditionnelle exige que l’ATP radioétique étiqueter les ARN liés aux protéines.
La forte affinité de la streptavidine avec les protéines biotinylées en fait une approche très puissante pour purifier des protéines ou des complexes protéiques spécifiques. La biotinylation efficace des protéines portant une séquence artificielle de peptide par ligase bactérien de biotine de BirA exprimée ectopiquement dans les cellules mammifères en fait une stratégie efficace pour exécuter la purification de biotine in vivo13. Nous avons développé une méthode clip-seq modifiée appelée FBIoCLIP-seq(FLAG-Bioteinté Cross-lencrage et jemmunoprecipitation suivie d’un séquençage à haut débit) en utilisant FLAG-biotin tag tandem purification14 (Figure 1). Grâce à la purification en tandem et à des conditions de lavage rigoureuses, presque tous les P RB en interaction sontéliminés ( figure 2). Les conditions de lavage rigoureuses permettent également de contourner le SDS-PAGE et le transfert de membrane, qui est exigeant en main-d’œuvre et techniquement difficile. Et semblable à eCLIP et irCLIP, la méthode FBIoCLIP-seq est sans isotopes. Sauter les étapes de fonctionnement et de transfert du gel permet d’éviter la perte d’informations, de garder intactes les interactions protéine-ARN authentiques et d’augmenter la complexité de la bibliothèque. De plus, l’efficacité élevée du système de marquage en fait un bon choix pour les P RB sans anticorps de haute qualité disponibles.
Ici, nous fournissons une description étape par étape du protocole CLIP-seq fbiopour les cellules mammifères. En bref, les cellules sont reliées entre elles par 254 nm UV, suivies de la lyse cellulaire et de l’immunoprécipitation FLAG (FLAG-IP). Ensuite, les complexes protéine-ARN sont encore purifiés par la capture d’affinité de biotine et les ARN sont fragmentés par digestion partielle avec MNase. Ensuite, l’ARN lié aux protéines est déphosphorylaté et ligaté avec un linker de 3'. Un lieneur d’ARN de 5' est ajouté après que l’ARN soit phosphorylaté avec PNK et élulisé par la digestion de proteinase K. Après transcription inverse, les signaux arn lié aux protéines sont amplifiés par PCR et purifiés par purification du gel agarose. Deux RBPs ont été choisis pour illustrer le résultat de FBIoCLIP-seq. LIN28 est une protéine liant l’ARN bien caractérisée impliquée dans la maturation des microARN, la traduction des protéines et la reprogrammationcellulaire 15,16,17. WDR43 est une protéine contenant du domaine WD40 qui coordonnerait la biogenèse ribosome, la transcription eucaryotique et le contrôle de la pluripotence des cellules souchesembryonnaires 14,18. Conformément aux résultats précédemment rapportés pour LIN28 avec CLIP-seq, FbioCLIP-seq révèle des sites contraignants de LIN28 sur des motifs « GGAG » dans le microARN mir-let7g et les ARNM16,19 (Figure 3). WDR43 FbioCLIP-seq a également identifié la préférence contraignante de WDR43 avec des espaceurs transcrits externes de 5' (5'-ETS) des pré-rRNAs20 (Figure 4). Ces résultats valident la fiabilité de la méthode FBIoCLIP-seq.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td>HL-2000 HybrilLinker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity Purification Beads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>112.06D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOAc</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 x FLAG peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>CIP buffer is in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0247S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M158-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porteinase K</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse trancriptase (SupperScriptIII)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation reagent (Trizol)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1614363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td>PNK buffer is in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligaes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EL0021</td>
			<td>T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td>T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mESC culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (80%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS (15%)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>purified recombinant protein; 10,000 fold dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoside mix (1%)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-008-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcriptome-wide profiling of protein-rna interactions by cross-linking and immunoprecipitation mediated by flag-biotin tandem purification

Les protéines liant l’ARN et l’ARN (P RB) contrôlent de multiples processus biologiques. L’arrangement spatial et temporel des ARN et des PRR sous-tend la réglementation délicate de ces processus. Une stratégie appelée CLIP-seq (liaison croisée et immunoprécipitation) a été mise au point pour capturer les interactions protéine-ARN endogènes avec les liaisons UV suivies d’immunoprécipitation. Malgré l’utilisation à grande échelle de la méthode clip-seq conventionnelle dans l’étude RBP, la méthode CLIP est limitée par la disponibilité d’anticorps de haute qualité, de contaminants potentiels provenant des P RB copurifiés, de l’exigence de manipulation des isotopes et de la perte potentielle d’information au cours d’une procédure expérimentale fastidieuse. Ici, nous décrivons une méthode clip-seq modifiée appelée FBIoCLIP-seq en utilisant la purification tandem tag FLAG-biotine. Grâce à la purification en tandem et à des conditions de lavage rigoureuses, presque toutes les protéines liant l’ARN interagissent sont éliminées. Ainsi, les ARN qui interagissent indirectement sous la couverture de ces PRR copurifiés sont également réduits. Notre méthode FBIoCLIP-seq permet une détection efficace des ARN directs liés aux protéines sans SDS-PAGE et sans procédures de transfert de membrane s’il n’y a pas d’isotopes et d’anticorps spécifiques aux protéines.

La représentation schématique de la procédure CLIP-seq du Fbioest indiquée dans la figure 1. Par rapport à la purification d’affinité en une étape médiée par flag ou à base de streptavidine, la purification en tandem FLAG-biotine a éliminé presque toutes les protéines copurifiées, évitant ainsi la contamination des interactions indirectes protéine-ARN (figure 2). Les résultats représentatifs de FBIoCLIP-seq pour LIN28 et...

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Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

Ici, nous présentons un protocole CLIP-seq modifié appelé FBIoCLIP-seq avec purification tandem FLAG-biotine pour déterminer les cibles arn des protéines liant l’ARN (RBPs) dans les cellules mammifères.

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

Seules et seules les protéines contraignantes contrôlent de multiples processus biologiques. Cette méthode FLAG-Biotin CLIP-seq, donc pour profiler globalement l’arrangement spécial et temporel des ARN et des RBPs dans les cellules mammifères. Cette méthode permet la détection efficace des ARN directs liés aux protéines sans SDS-PAGE et les procédures de transfert de membrane.Par rapport à clip-seq traditionnel est sans isotopes et il ne nécessite pas d’anticorps spécifiques aux protéines. Commencez par placage d’environ 3 millions de cellules souches embryonnaires de souris dans une plaque de 10 centimètres et les incuber pendant la nuit. Le lendemain, retirer le milieu avec un vide et traiter les cellules avec deux millilitres de 0,25% trypsine EDTA pendant deux minutes à température ambiante.Étanchez la trypsine avec quatre millilitres de moyenne MESC fraîche, et transférez les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez-les à 300 fois G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius et retirez le supernatant. Suspendre les cellules en quatre millilitres de PBS froid et les transférer à la plaque de 10 centimètres pour la liaison croisée.Rayonnez les cellules avec une lumière UV de 254 nanomètres, puis transférez les cellules croisées dans un tube de 15 millilitres. Faites tourner ces cellules à 300 fois G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius, puis retirez le supernatant et lysez les cellules avec 500 microlitres de tampon A préparés selon les directives manuscrites. Transférez les cellules dans un tube de 1,5 millilitre sans RNAse et incubez-les à quatre degrés Celsius avec rotation douce pendant 30 à 60 minutes.Traiter le lysate avec 30 microlitres de DNAse 1 à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, arrêtez la réaction en ajoutant quatre microlitres de 0,5 molaire EDTA. Faites tourner la pastille insoluble en centrifugant à 12 000 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, et transférez le supernatant dans un nouveau tube pré-refroidi de 1,5 millilitre.Transférer la cellule lysate dans des perles FLAG prééquilibrées et incuber l’échantillon à quatre degrés Celsius pendant la rotation de deux à quatre heures. Après l’incubation, centrifuger les perles pendant deux minutes à 3000 fois G et enlever le supernatant. Ajouter 500 microlitres de tampon A à l’échantillon, et incubé à 4 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis faire tourner les perles et enlever le surnatant.Répétez le lavage avec le tampon A, suivi de deux lavages avec une elute tampon B.To pré-réfrigérée avec un peptide FLAG de trois X, préparez la solution d’élitution telle que décrite dans le manuscrit du texte et faites tourner les perles FLAG. Retirez le supernatant avec une pointe de pipette à extrémité étroite et ajoutez 200 microlitres des trois solutions d’élitution X FLAG à chaque échantillon. Incuber les échantillons pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius avec rotation douce.Puis faites tourner les perles pendant deux minutes à 3000 fois G.Transférer le supernate dans un tube frais et répéter l’élitution deux fois. Économisez 5 % des évasés pour l’analyse des taches occidentales ou la coloration argentée pour vérifier l’efficacité de l’immunoprécipitation FLAG. Transférer les élitants tirés sur des perles de streptavidine préparées et faire pivoter les échantillons doucement à quatre degrés Celsius pendant une à trois heures ou toute la nuit.Ensuite, recueillir les perles sur un support magnétique et enlever le surnatant. Laver les perles deux fois avec 500 microlitres de Tampon C avec rotation douce pendant cinq minutes par lavage. Ensuite, lavez les perles deux fois avec 500 microlitres de Buffer D, et deux fois avec 500 microlitres de tampon PNK glacé, en recueillant les perles sur le support magnétique et en enlevant le supernatant entre les lavages.Pour effectuer la digestion partielle de l’ARN, ajouter 100 microlitres de solution MNA à chaque échantillon et vortex réglé à 37 degrés Celsius avec un mélangeur thermique pendant 10 minutes. Recueillir les perles avec un support magnétique pendant 30 secondes et enlever le surnatant. Ensuite, lavez-les avec le tampon PNK-EDTA, le tampon C et le tampon PNK selon les instructions manuscrites.Recueillir les perles avec le support magnétique et enlever le tampon. Ajouter ensuite le mélange de réaction CIP et vortexer les perles à 37 degrés Celsius à l’aide d’un mélangeur thermique pendant 10 minutes. Lavez rapidement les perles deux fois avec 500 microlitres de tampon PNK EDTA glacé, suivi de deux lavages avec 500 microlitres de tampon PNK glacé.Après les lavages, ajouter 40 microlitres de trois mélanges de ligature linker premier aux perles, et les vortex à 16 degrés Celsius avec un mélangeur thermique pendant trois heures ou toute la nuit. Une ligature efficace du lien avec les alliés est essentielle pour cette expérience. Vérifiez le tube de réaction de temps en temps pour s’assurer que ceux-ci ne précipitent pas pendant la ligature.Après l’incubation, répéter les lavages avec des tampons PNK EDTA et PNK, ajouter 40 microlitres de PNK mélangés aux perles, et les vortex à 37 degrés Celsius avec le mélangeur thermique pendant 10 minutes. Lavez les perles avec des tampons PNK EDTA et PNK, puis procédez à l’isolement de l’ARN tel que décrit dans le manuscrit du texte. Comparé à flag-médié ou streptavidin médié une purification d’affinité d’étape, purification de tandem flag-biotine enlevé presque toutes les protéines purifiées de noyau, évitant la contamination des interactions indirectes d’ARN de protéine.LIN28 et WDR43, FBIo CLIP-seq a été effectué à l’aide de cellules SOUCHES embryonnaires de souris. Au total, environ 7,7 millions et 2,2 millions de lectures uniques ont été récupérées pour LIN28 et WDR43 respectivement. La comparaison des vues de la voie montre différents modèles de liaison dans le locus pré-rRNA de la RN45.Les sites reliés entre les deux sur le motif GGA G de l’ARN pré-let7-g par LIN28, FBIo CLIP-seq ou identifiés. En outre, des motifs enrichis d’ARN dans les sites de liaison, et le pourcentage de nucléotides mutés dans différents types de mutations ont été déterminés. Montrant que LIN28 préfère se lier au nucléotide génétique.Eh bien, à 22h00, ce protocole, il est important de confirmer l’efficacité de l’immunoprécipitation pour s’assurer que les complexes protéiques seulement ont été purifiés avec succès.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Analyse du promoteur du ligand c-KIT utilisant l&#39;immunoprécipitation de la chromatine

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Recherche

Génétique

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Enquête de synthèse de l’ARN à l’aide de 5-Bromouridine étiquetage et immunoprécipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Capture promoteur Salut-c : Haute résolution, Genome-wide profilage des Interactions de promoteur

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Immunoprécipitation de la chromatine du murin tissu adipeux brun

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Nombre variable Tandem-répétition Analyse du Bacterium Yersinia ruckeri par Multiplex PCR et Capillary Electrophoresis

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Un jeu d'enfant pour quantifier la liaison protéine-ARN chez les bactéries

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identification des empreintes de pas de l'ARN: Complexes protéiques par l'intermédiaire de l'immunoprécipitation d'ARN dans Tandem suivi du séquençage (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenoty the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii (en plus de la transformation, de l'édition du génome et du phénotypage de l'arbre tropical de Cannabaceae parasponia andersonii)

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...