Name: transcriptome-wide profiling of protein-rna interactions by cross-linking and immunoprecipitation mediated by flag-biotin tandem purification
Uploaded: 2020-05-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification at JoVE.com

תמיכה במענק היא מהתוכנית הלאומית למחקר בסיסי של סין (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31630095) והמרכז למדעי החיים באוניברסיטת צגחואה.

1. בניית קו תא
<ol><li>לשבט את הגן של עניין לתוך pPiggyBac וקטור וקטור pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA של עניין]-(היגרומיצין עמיד) plasmid הנושאת אפיטופ דגל ביוטין13,21 כדי לבטא תג דגל-ביוטין התמזגו RBP(FBRBP).</li>
	<li>שיתוף תרגום RBP FBהמביע וקטור עם וקטור pBase לתוך קו תא המביע את אנזים BirA<s...

<ol>
	<li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates.">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li><li>Guallar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-dependent+chromatin+targeting+of+TET2+for+endogenous+retrovirus+control+in+pluripotent+stem+cells.">RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells.</a> Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).</li><li>Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Maps+of+ProQ+Binding+In+Vivo+Reveal+Target+Recognition+via+RNA+Structure+and+Stability+Control+at+mRNA+3'+Ends.">Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends.</a> Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).</li><li>Wei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBFox2+Binds+Nascent+RNA+to+Globally+Regulate+Polycomb+Complex+2+Targeting+in+Mammalian+Genomes.">RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes.</a> Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PARP-1+by+snoRNAs+Controls+Ribosome+Biogenesis+and+Cell+Growth+via+the+RNA+Helicase+DDX21.">Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).</li><li>Yao, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+Pre-rRNA+Sorting+via+Phase+Separation+Drives+the+Assembly+of+Dense+Fibrillar+Components+in+the+Human+Nucleolus.">Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus.</a> Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).</li><li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing.">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li><li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Argonaute+and+conventional+RNA-binding+protein+interactions+with+RNA+at+single-nucleotide+resolution+using+HITS-CLIP+and+CIMS+analysis.">Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).</li><li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=irCLIP+platform+for+efficient+characterization+of+protein-RNA+interactions.">irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions.</a> Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).</li><li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+(eCLIP).">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins.">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).</li><li>de Boer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li><li>Bi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Targets+Ribogenesis+Factor+WDR43+to+Chromatin+for+Transcription+and+Pluripotency+Control.">RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control.</a> Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).</li><li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT4+in+concert+with+Lin28+suppresses+microRNA+biogenesis+through+pre-microRNA+uridylation.">TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation.</a> Cell. 138 (4), 696-708 (2009).</li><li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28A+Is+a+Suppressor+of+ER-Associated+Translation+in+Embryonic+Stem+Cells.">LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+roles+for+the+ribosome+biogenesis+factor+Wdr43+in+zebrafish+development.">Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development.</a> PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).</li><li>Wilbert, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28+binds+messenger+RNAs+at+GGAGA+motifs+and+regulates+splicing+factor+abundance.">LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).</li><li>Hunziker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UtpA+and+UtpB+chaperone+nascent+pre-ribosomal+RNA+and+U3+snoRNA+to+initiate+eukaryotic+ribosome+assembly.">UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly.</a> Nature Communications. 7, 12090 (2016).</li><li>Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+vivo+biotinylation+to+study+protein-protein+and+protein-DNA+interactions+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).</li><li>Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+piggyBac+transposon-based+mammalian+cell+expression+system+for+inducible+protein+production.">Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).</li><li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li><li>Aktas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHX9+suppresses+RNA+processing+defects+originating+from+the+Alu+invasion+of+the+human+genome.">DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome.</a> Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).</li><li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Crosslinking+Immunoprecipitation+(eCLIP)+Method+for+Efficient+Identification+of+Protein-bound+RNA+in+Mouse+Testis.">Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).</li></ol>

כאן אנו מציגים שיטת CLIP-seq שונה בשם FBIoCLIP-seq, ניצול של מערכת תיוג כפול FLAG-ביוטין כדי לבצע טיהור טנדם של תסביכי חלבון-RNA. מערכת התיוג הכפול FLAG-biotin הוכחה כחזקת עוצמה בזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבוןוחלבון-DNA 13,21. כאן אנו מדגימים את הייפציפיות והנוחות הגבוהות של...

חלבונים מחייבים RNAs ו- RNA שולטים בתהליכים תאיים מגוונים, כולל שחבור, תרגום, ביוגנזה ריבוזום, ויסות אפיגנטי ומעברלגורל תאים 1,2,3,4,5,6. המנגנונים העדינים של תהליכים אלה תלויים בהסדר המרחבי והזמני הייחודי של RNAs ו-RBPs. לכן, צעד חשוב לקראת הבנת ויסות RNA ברמה המולקולרית היא לחשוף את המידע המיקום על אתרי האיגוד של RBPs.
אסטרטגיה המכונה קישור צולב וimmunoprecipitation (CLIP-seq) פותחה כדי ללכוד אינטראקציות חלבון-RNA עם קישור צולב UV ואחריו immunoprecipitation של החלבון שלעניין 7. התכונה העיקרית של המתודולוגיה היא אינדוקציה של קוולנטי cross-links בין חלבון מחייב RNA מולקולות RNA הקשורות ישירות שלה (בתוך ~ 1 Å) על ידי קרינה UV8. ניתן לקבוע את עקבות ה- RBP על-ידי קיבוץ באשכולות תגיות CLIP וקריאה לשיא, שבדרך כלל יש להם רזולוציה של 30-60 nt. לחלופין, שלב שעתוק הפוך של CLIP יכול להוביל לכופרים (הוספות או מחיקות) או החלפות לאתרים המקשרים צולב, המאפשר זיהוי של אתרי איגוד חלבונים ב- RNAs ברזולוציה של נוקלאוטיד יחיד. צינורות כמו Novoalign ו CIMS פותחו לניתוח של תוצאות רצף תפוקה גבוהה של CLIP-seq8. כמו כן הוצעו מספר שיטות שונות של CLIP-seq, כולל קישור צולב וחיבור חיסוני (iCLIP), קליפ משופר (eCLIP), irCLIP, ו-ribonucleoside-משופרת בקישור צולב ואימונו-פקטריציה (PAR-CLIP)9,10,11,12.
למרות השימוש הרחב בשיטות CLIP-seq מסורתיות בחקר RBPs, שיטות CLIP יש מספר חסרונות. ראשית, אלקטרופורזה ג'ל מייגע והליך העברת קרום עלול להוביל לאובדן מידע, ולגרום למורכבות רצף מוגבלת. שנית, שיטת CLIP מבוססת נוגדן ספציפית לחלבון עשויה למשוך את תסביך חלבון במקום חלבון יעד יחיד, אשר עלול להוביל לאינטראקציות חלבון-RNA חיוביות כוזבות מן RBPs copurified. שלישית, האסטרטגיה מבוססת נוגדנים דורשת כמות גדולה של נוגדנים באיכות גבוהה, מה שהופך את היישום של שיטות אלה לא מספיק לצורך המחקר של RBPs ללא נוגדנים באיכות גבוהה זמין. רביעית, שיטת CLIP המסורתית דורשת ATP עם תווית רדיו כדי לתייג את ה-RNAs המאוגדים בחלבון.
הזיקה הגבוהה של סטרפטאבידין לחלבונים ביוטינילציה הופכת אותו לגישה חזקה מאוד לטהר חלבונים ספציפיים או תסביכי חלבון. biotinylation יעיל של חלבונים נושאים רצף פפטיד מלאכותי על ידי חוץ חוץ ביוטין חיידקי BirA biotin ligase בתאים יונקים עושה את זה אסטרטגיה יעילה לבצע טיהור ביוטין ב vivo13. פיתחנו שיטת CLIP-seq שונה בשם FBIoקליפ-seq (FLAG-ביופח בתיווך Cross-lסימון בדיו ואניmmunop recipitationואחריו רצף תפוקה גבוהה) באמצעות דגל-ביוטין תג טנדםטיהור 14 ( איור1). באמצעות טיהור דו-מושבי ותנאי שטיפה מחמירים, כמעט כל ה-RBPs אינטראקציה מוסרים(איור 2). תנאי השטיפה המחמירים מאפשרים גם לעקוף את העברת ה-SDS-PAGE והמברנה, שהיא עבודה אינטנסיבית ומאתגרת מבחינה טכנית. ובדומה ל-eCLIP ול-irCLIP, שיטת ה-FBIOCLIP-seq היא ללא איזוטופים. דילוג על הג'ל פועל ולהעביר שלבים מונע אובדן מידע, שומר על אינטראקציות אותנטיות של חלבון-RNA ללא פגע ומגביר את מורכבות הספרייה. יתר על כן, היעילות הגבוהה של מערכת התיוג עושה את זה בחירה טובה עבור RBPs ללא נוגדנים באיכות גבוהה זמין.
כאן אנו מספקים תיאור שלב אחר שלב של פרוטוקול ה-FBIOCLIP-seq עבור תאים יונקים. בקצרה, תאים מקושרים על ידי 254 נה"מ UV, ואחריו פירוק תא ו- FLAG immunoprecipitation (FLAG-IP). לאחר מכן, תסביכי החלבון-RNA מטוהרים עוד יותר על ידי לכידת זיקה ביוטין וRNAs מפוצלים על ידי עיכול חלקי עם MNase. לאחר מכן, RNA האוגד בחלבון הוא dephosphorylated ורצועה עם מקשר 3 '. מקשר RNA 5' מתווסף לאחר RNA הוא זרחן עם PNK ו- eluted על ידי עיכול K חלבונים. לאחר שעתוק הפוך, אותות RNA הקשורים לחלבון מוגברים על ידי PCR ומטוהרים על ידי טיהור ג'ל agarose. שני RBPs נבחרו כדי להדגים את התוצאהקליפ-seq FBIO. LIN28 הוא חלבון מחייב RNA מאופיין היטב מעורב התבגרות microRNA, תרגום חלבונים, ותכנות מחדש של תאים15,16,17. WDR43 הוא חלבון המכיל תחום WD40 חשב לתאם ביוגנזה ריבוזום, שעתוק אאוקריוטי, ובקרה pluripotency תאי גזעעוברי 14,18. עולה בקנה אחד עם תוצאות שדווחו בעבר עבור LIN28 עם CLIP-seq, FBIOCLIP-seq חושף אתרים מחייבים של LIN28 על "GGAG" מוטיבים microRNA מיר-let7g ו mRNAs16,19 (איור 3). WDR43 FBIOCLIP-seq זיהה גם את העדפת האיגוד של WDR43 עם 5' חיצוני מתעתק רווחים (5'-ETS) של pre-rRNAs20 (איור 4). תוצאות אלה מאמתות את האמינות של שיטת ה-FBIOCLIP-seq.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td>HL-2000 HybrilLinker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity Purification Beads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>112.06D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOAc</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 x FLAG peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>CIP buffer is in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0247S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M158-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porteinase K</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse trancriptase (SupperScriptIII)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation reagent (Trizol)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1614363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td>PNK buffer is in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligaes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EL0021</td>
			<td>T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td>T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mESC culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (80%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS (15%)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>purified recombinant protein; 10,000 fold dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoside mix (1%)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-008-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcriptome-wide profiling of protein-rna interactions by cross-linking and immunoprecipitation mediated by flag-biotin tandem purification

חלבונים מחייבי RNA ו-RNA שולטים בתהליכים ביולוגיים מרובים. הסידור המרחבי והזמני של RNAs ו-RBPs מדגיש את הרגולציה העדינה של תהליכים אלה. אסטרטגיה הנקראת CLIP-seq (קישור צולב ו-immunoprecipitation) פותחה כדי ללכוד אינטראקציות חלבון-RNA אנדוגניים עם קישור צולב UV ואחריו immunoprecipitation. למרות השימוש הרחב בשיטת CLIP-seq קונבנציונלית במחקר RBP, שיטת CLIP מוגבלת על ידי הזמינות של נוגדנים באיכות גבוהה, מזהמים פוטנציאליים מן RBPs copurified, דרישה של מניפולציה איזוטופ, ואובדן פוטנציאלי של מידע במהלך הליך ניסיוני מייגע. כאן אנו מתארים שיטת CLIP-seq שונה הנקראת FBIoCLIP-seq באמצעות טיהור תג FLAG-ביוטין טנדם. באמצעות טיהור דו-מושבי ותנאי שטיפה מחמירים, כמעט כל החלבונים המחייבים את ה-RNA האינטראקציה מוסרים. לכן, RNAs אינטראקציה בעקיפין מתווכים על ידי RBPs אלה copurified מופחתים גם. שיטת ה-FBIoCLIP-seq שלנו מאפשרת זיהוי יעיל של RNAs מאוגדים בחלבון ישיר ללא נהלי העברת SDS-PAGE וממברנה באופן ללא איזוטופים וללא נוגדנים ספציפיים לחלבון.

הייצוג השרטוטי של הליך ה-FBIOCLIP-seq מוצג באיור 1. בהשוואה לטיהור זיקה חד-שלבי-שלבי-שלד,טיהור ה-FLAG-ביוטין הסיר כמעט את כל החלבונים הדו-תכליתיים, ומנע זיהום של אינטראקציות עקיפות של חלבון-RNA(איור 2). תוצאות מייצגות עבור FBIoCLIP-seq עבור LIN28 ו- WDR43 מתוארות <strong cl...

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification at JoVE.com

Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

כאן אנו מציגים פרוטוקול קליפ-seq שונה בשם FBIoקליפ-seq עם טיהור דגל-ביוטין טנדם כדי לקבוע את מטרות RNA של חלבונים מחייבים RNA (RBPs) בתאים יונקים.

פרופיל תמלול רחב של אינטראקציות חלבון-RNA על ידי קישור צולב וחיסונים בתיווך על ידי טיהור דגל-ביוטין טנדם

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

רק חלבונים מחייבים שולטים בתהליכים ביולוגיים מרובים. שיטת FLAG-Biotin CLIP-seq זו, ומכאן פרופיל גלובלי של הסידור המיוחד והקצבי של RNAs ו- RBPs בתאי יונקים. שיטה זו מאפשרת זיהוי יעיל של RNAs מאוגדי חלבון ישירים ללא SDS-PAGE והליכי העברת הממברנה.בהשוואה ל- CLIP-seq המסורתי הוא ללא איזוטופ והוא אינו דורש נוגדן ספציפי לחלבון. התחל על ידי ציפוי על 3 מיליון תאי STEM עובריים עכבר בצלחת 10 ס"מ ודגירה אותם בן לילה. למחרת, להסיר את המדיום עם ואקום ולטפל בתאים עם שני מיליליטר של 0.25% trypsin EDTA במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.מרווה את הטריפסין עם ארבעה מיליליטר של מדיום MESC טרי, ומעבירים את התאים לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה אותם ב 300 פעמים G במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. להשעות את התאים בארבעה מיליליטר של PBS קר ולהעביר אותם בחזרה לצלחת 10 ס"מ לקישור צולב.להקרין את התאים עם אור UV 254 ננומטר, ולאחר מכן להעביר את התאים המקושרים לצינור 15 מיליליטר. לסובב את התאים האלה ב 300 פעמים G במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להסיר את על טבעי lyse התאים עם 500 microliters של Buffer A מוכן על פי הוראות כתב היד. מעבירים את התאים לצינור 1.5 מיליליטר נטול RNAse, ומדרגים אותם בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין במשך 30 עד 60 דקות.לטפל lysate עם 30 microliters של DNAse 1 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, לעצור את התגובה על ידי הוספת ארבעה microliters של 0.5 EDTA טוחן. לסובב את גלולה מסיסים על ידי צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולהעביר את supernatant לצינור חדש מקורר מראש 1.5 מיליליטר.מעבירים את התא לליזט לחרוזי FLAG מוגדרים מראש, ודגירה את המדגם בארבע מעלות צלזיוס תוך כדי סיבוב במשך שעתיים עד ארבע שעות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את חרוזים במשך שתי דקות ב 3000 פעמים G ולהסיר את supernatant. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של מאגר A לדגימה, ודגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן לסובב את חרוזים ולהסיר את על טבעי.חזור על הכביסה עם מאגר A, ואחריו שתי שטיפות עם Buffer B.To מצונן מראש - אלוט עם שלושה X FLAG-peptide, להכין את פתרון elution כמתואר בכתב היד טקסט ולסובב את קדילי דגל. הסר את העל-טבעי עם קצה צר של פיפיאט והוסף 200 מיקרוליטרים של שלושת פתרון האלוטיון של X FLAG לכל דגימה. דגירה הדגימות במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין.ואז לסובב את חרוזים במשך שתי דקות ב 3000 פעמים G. להעביר את supernate לצינור טרי ולחזור על האלוטיון פעמיים. חסוך 5% מהאלואנטים לניתוח כתמים מערביים או כתמי כסף כדי לבדוק את היעילות של immunoprecipitation של FLAG. מעבירים את האלונטים המושכים ל חרוזי סטרפטוודין מוכנים ומסובבים את הדגימות בעדינות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה עד שלוש שעות או לילה.לאחר מכן, לאסוף את חרוזים על מעמד מגנטי ולהסיר את supernatant. לשטוף את חרוזים פעמיים עם 500 microliters של חיץ C עם סיבוב עדין במשך חמש דקות לכל לשטוף. לאחר מכן, לשטוף את חרוזים פעמיים עם 500 microliters של חיץ D, ופעמיים עם 500 microliters של חיץ PNK קר כקרח, איסוף חרוזים על מעמד מגנטי והסרת supernatant בין שטיפות.לביצוע עיכול RNA חלקי, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של פתרון MNA לכל מדגם ומערבולת ב-37 מעלות צלזיוס עם מערבל תרמי למשך 10 דקות. לאסוף את חרוזים עם מעמד מגנטי במשך 30 שניות ולהסיר את supernatant. לאחר מכן, שטפו אותם עם חיץ PNK-EDTA, מאגר C ומאגר PNK בהתאם לכיווני כתב היד.לאסוף את חרוזים עם מעמד מגנטי ולהסיר את המאגר. לאחר מכן, מוסיפים את תערובת התגובה CIP ומערבולת את חרוזים ב 37 מעלות צלזיוס עם מערבל תרמי במשך 10 דקות. לשטוף במהירות את חרוזים פעמיים עם 500 microliters של חיץ PNK EDTA קר כקרח, ואחריו שתי שטיפות עם 500 microliters של חיץ PNK קר כקרח.לאחר הכביסה, מוסיפים 40 מיקרוליטרים של שלוש רצועות קישור עיקריות לערבב את חרוזים, ומערבולת אותם ב 16 מעלות צלזיוס עם מערבל תרמי במשך שלוש שעות או לילה. קשירה יעילה של המקשר לבעלות הברית היא קריטית לניסוי זה. בדוק את צינור התגובה מדי פעם כדי לוודא כי אלה לא לזרז במהלך קשירה.לאחר הדגירה, חזרו על השטיפה עם מאגרי PNK EDTA ו- PNK, הוסיפו 40 מיקרוליטרים של PNK מעורבבים לתרוזות, ומערבולת אותם ב 37 מעלות צלזיוס עם מערבל תרמי במשך 10 דקות. לשטוף את חרוזים עם מאגרי PNK EDTA ו PNK, ולאחר מכן להמשיך עם בידוד RNA כמתואר בכתב היד טקסט. בהשוואה לטיהור זיקה חד-שלבי בתיווך FLAG-Biotin או סטרפטבידין, טיהור טנדם FLAG-Biotin הסיר כמעט את כל החלבונים המטוהרים המרכזיים, תוך הימנעות מזיהום של אינטראקציות RNA עקיפות של חלבונים.LIN28 ו- WDR43, FBIO CLIP-seq בוצע באמצעות תאי STEM עובריים של העכבר. בסך הכל, כ-7.7 מיליון ו-2.2 מיליון קריאות ייחודיות אוחזרו עבור LIN28 ו-WDR43 בהתאמה. השוואה בין תצוגות הרצועה מציגה תבניות איגוד שונות בלוקוס RN45 שלפני rRNA.האתרים המקושרים במוטיב GGA G של RNA טרום-let7-g על ידי LIN28, FBIO CLIP-seq או מזוהה. כמו כן, נקבעו מוטיבים מועשרים של RNA באתרי הכריכה, ואחוז הנוקלאוטידים שעברו מוטציה בסוגים שונים של מוטציות. מראה כי LIN28 מעדיף להיקשר לנוקלאוטיד הגן.ובכן, בשעה 22: 00, פרוטוקול זה, חשוב לאשר את היעילות של immunoprecipitation כדי לוודא כי קומפלקסים חלבון בלבד טוהרו בהצלחה.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

ניתוח של C-KIT ליגנד האמרגן באמצעות Immunoprecipitation הכרומטין

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

חקירה של סינתזת RNA באמצעות Labelling 5-Bromouridine ו- Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

יזם לכידת שלום-c: ברזולוציה גבוהה, הגנום כולו פרופיל של אינטראקציות יזם

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

כרומטין Immunoprecipitation של רקמת שומן חום מאתר

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

משתנה רב-לוקוס-ניתוח חוזר של מספר מחזור של הדג -חיידק הפתוגניים באמצעות מולטיפלקס ואלקטרופורזה קפיסימית

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 ריבונואופפרוטאין-תיווך מדויק לעריכה גנטית על ידי אלקטרופורציה

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

זיהוי של טביעות רגליים של RNA: מכלולי חלבון באמצעות RNA Immunoprecipitation בטנדם ואחריו רצף (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

שינוי צורה, הגנום עריכת ופנוהקלדת החנקן-תיקון טרופי קנאביציים עץ Parasponia אנדרסונii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...