Name: transcriptome-wide profiling of protein-rna interactions by cross-linking and immunoprecipitation mediated by flag-biotin tandem purification
Uploaded: 2020-05-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification at JoVE.com

Il sostegno alle sovvenzioni proviene dal National Basic Research Program of China (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), dalla National Natural Science Foundation of China (31630095) e dal Center for Life Sciences dell'Università di Tsinghua.

1. Costruzione della linea cellulare
<ol><li>Clonare il gene di interesse in un piggyBac vettore pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA di interesse]-(resistente alla igromicina) plasmide che porta un epitopo FLAG-biotina13,21 per esprimere un tag FLAG-biotina fusa RBP(FBRBP).</li>
	<li>Cotrasfetto il vettore di espressione FBRBP con il vettore pBase in una linea cellulare che esprime l'enzima BirA22. NOTA: In questo studio, i...

<ol>
	<li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates.">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li><li>Guallar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-dependent+chromatin+targeting+of+TET2+for+endogenous+retrovirus+control+in+pluripotent+stem+cells.">RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells.</a> Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).</li><li>Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Maps+of+ProQ+Binding+In+Vivo+Reveal+Target+Recognition+via+RNA+Structure+and+Stability+Control+at+mRNA+3'+Ends.">Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends.</a> Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).</li><li>Wei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBFox2+Binds+Nascent+RNA+to+Globally+Regulate+Polycomb+Complex+2+Targeting+in+Mammalian+Genomes.">RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes.</a> Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PARP-1+by+snoRNAs+Controls+Ribosome+Biogenesis+and+Cell+Growth+via+the+RNA+Helicase+DDX21.">Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).</li><li>Yao, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+Pre-rRNA+Sorting+via+Phase+Separation+Drives+the+Assembly+of+Dense+Fibrillar+Components+in+the+Human+Nucleolus.">Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus.</a> Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).</li><li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing.">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li><li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Argonaute+and+conventional+RNA-binding+protein+interactions+with+RNA+at+single-nucleotide+resolution+using+HITS-CLIP+and+CIMS+analysis.">Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).</li><li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=irCLIP+platform+for+efficient+characterization+of+protein-RNA+interactions.">irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions.</a> Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).</li><li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+(eCLIP).">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins.">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).</li><li>de Boer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li><li>Bi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Targets+Ribogenesis+Factor+WDR43+to+Chromatin+for+Transcription+and+Pluripotency+Control.">RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control.</a> Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).</li><li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT4+in+concert+with+Lin28+suppresses+microRNA+biogenesis+through+pre-microRNA+uridylation.">TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation.</a> Cell. 138 (4), 696-708 (2009).</li><li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28A+Is+a+Suppressor+of+ER-Associated+Translation+in+Embryonic+Stem+Cells.">LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+roles+for+the+ribosome+biogenesis+factor+Wdr43+in+zebrafish+development.">Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development.</a> PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).</li><li>Wilbert, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28+binds+messenger+RNAs+at+GGAGA+motifs+and+regulates+splicing+factor+abundance.">LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).</li><li>Hunziker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UtpA+and+UtpB+chaperone+nascent+pre-ribosomal+RNA+and+U3+snoRNA+to+initiate+eukaryotic+ribosome+assembly.">UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly.</a> Nature Communications. 7, 12090 (2016).</li><li>Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+vivo+biotinylation+to+study+protein-protein+and+protein-DNA+interactions+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).</li><li>Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+piggyBac+transposon-based+mammalian+cell+expression+system+for+inducible+protein+production.">Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).</li><li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li><li>Aktas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHX9+suppresses+RNA+processing+defects+originating+from+the+Alu+invasion+of+the+human+genome.">DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome.</a> Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).</li><li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Crosslinking+Immunoprecipitation+(eCLIP)+Method+for+Efficient+Identification+of+Protein-bound+RNA+in+Mouse+Testis.">Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).</li></ol>

Qui introduciamo un metodo CLIP-seq modificato chiamato FbioCLIP-seq, sfruttando il sistema di doppia etichettatura FLAG-biotina per eseguire la purificazione tandem dei complessi proteina-RNA. Il sistema di doppia etichettatura FLAG-biotina si è dimostrato potente nell'identificare le interazioni proteina-proteina e proteina-DNA13,21. Qui dimostriamo l'alta specificità e convenienza di questo sistema nell'identificare gli RNA che interagiscono con l...

Gli RNA e le proteine leganti l'RNA (RRP) controllano diversi processi cellulari tra cui splicing, traduzione, biogenesi ribosoma, regolazione epigenetica e transizione del destinocellulare 1,2,3,4,5,6. I delicati meccanismi di questi processi dipendono dalla disposizione spaziale e temporale unica di RTA e RRP. Pertanto, un passo importante verso la comprensione della regolazione dell'RNA a livello molecolare è quello di rivelare le informazioni posizionali sui siti vincolanti degli RRP.
È stata sviluppata una strategia denominata cross-linking e immunoprecipitazione (CLIP-seq) per catturare le interazioni proteina-RNA con il cross-linking UV seguito dall'immunoprecipitazione della proteina di interesse7. La caratteristica chiave della metodologia è l'induzione di collegamenti incrociati covalenti tra una proteina legante l'RNA e le sue molecole di RNA direttamente legate (entro ~1 Å) dall'irradiazione UV8. Le impronte RBP possono essere determinate dal clustering di tag CLIP e dalle chiamate di picco, che di solito hanno una risoluzione di 30−60 nt. In alternativa, la fase di trascrizione inversa di CLIP può portare a indeli (inserimenti o deduzioni) o sostituzioni ai siti di collegamento incrociato, che consente l'identificazione di siti di legame proteico sugli RNA con una risoluzione mono nucleotidica. Condotte come Novoalign e CIMS sono state sviluppate per l'analisi dei risultati di sequenziamento ad alta produttività di CLIP-seq8. Sono stati proposti anche diversi metodi CLIP-seq modificati, tra cui il cross-linking e l'immunoprecipitazione della risoluzione del nucleotide individuale (iCLIP), CLIP avanzato (eCLIP), irCLIP e cross-linking e immunoprecipitazione fotoattivibili ribonucleoside (PAR-CLIP)9,10,11,12.
Nonostante l'ampio uso dei metodi CLIP-seq tradizionali nello studio degli RRP, i metodi CLIP presentano diversi inconvenienti. In primo luogo, la noiosa elettroforesi del gel denaturato e la procedura di trasferimento a membrana possono portare alla perdita di informazioni e causare una complessità della sequenza limitata. In secondo luogo, il metodo CLIP specifico della proteina basato su anticorpi può abbattere un complesso proteico anziché una singola proteina bersaglio, il che può portare a false interazioni proteina-RNA positive dagli RRP copurificati. In terzo luogo, la strategia basata su anticorpi richiede una grande quantità di anticorpi di alta qualità, il che rende l'applicazione di questi metodi inadeguata per lo studio degli RRB senza anticorpi di alta qualità disponibili. In quarto luogo, il metodo TRADIZIONALE CLIP richiede ATP radioetichettato per etichettare gli RNA legati alle proteine.
L'alta affinità della streptavidina con le proteine biotinilate lo rende un approccio molto potente per purificare specifiche proteine o complessi proteici. L'efficiente biotinylazione delle proteine che trasportano una sequenza peptidica artificiale mediante la biotina ligasi bira etopica nelle cellule di mammifero lo rende una strategia efficiente per eseguire la purificazione della biotina in vivo13. Abbiamo sviluppato un metodo CLIP-seq modificato chiamato FbioCLIP-seq(FLAG-Biotin-mediated Cross-linking e Immunoprecipitation seguito da sequenziamento ad alta produttività) utilizzando la purificazione tandem flag-biotinatag 14 (Figura 1). Attraverso la purificazione tandem e le rigorose condizioni di lavaggio, quasi tutti gli RRB interagenti vengono rimossi (Figura 2). Le rigorose condizioni di lavaggio consentono anche di aggirare l'SDS-PAGE e il trasferimento a membrana, che è ad alta intensità di manodopera e tecnicamente impegnativo. E simile a eCLIP e irCLIP, il metodo FbioCLIP-seq è privo di isotopi. Saltare il gel in esecuzione e trasferire i passaggi evita la perdita di informazioni, mantiene intatte le autentiche interazioni proteina-RNA e aumenta la complessità della libreria. Inoltre, l'elevata efficienza del sistema di etichettatura lo rende una buona scelta per gli RMP senza anticorpi di alta qualità disponibili.
Qui forniamo una descrizione dettagliata del protocollo FBIoCLIP-seq per le cellule di mammifero. In breve, le cellule sono reticate da UV a 254 nm, seguite da lisi cellulare e immunoprecipitazione FLAG (FLAG-IP). Successivamente, i complessi proteina-RNA vengono ulteriormente purificati dalla cattura dell'affinità della biotina e gli RNA sono frammentati dalla digestione parziale con la MNasi. Quindi, l'RNA legato alla proteina viene defosforilato e legato con un linker 3 '. Un linker 5' di RNA viene aggiunto dopo che l'RNA è fosforilato con PNK ed eluitato dalla digestione della proteinasi K. Dopo la trascrizione inversa, i segnali di RNA legati alle proteine vengono amplificati dalla PCR e purificati dalla purificazione del gel di agarosio. Due RMP sono stati scelti per esemplificare il risultato di FbioCLIP-seq. LIN28 è una proteina legante l'RNA ben caratterizzata coinvolta nella maturazione dei microRNA, nella traduzione delle proteine e nella riprogrammazionecellulare 15,16,17. WDR43 è una proteina wd40 contenente il dominio che si pensa coordini la biogenesi ribosoma, la trascrizione eucariotica e il controllo della pluripotenza delle cellule staminali embrionali14,18. Coerentemente con i risultati precedentemente riportati per LIN28 con CLIP-seq, FbioCLIP-seq rivela siti di legame di LIN28 su motivi "GGAG" nel microRNA mir-let7g emRNAAs 16,19 ( Figura3). WDR43 FbioCLIP-seq ha anche identificato la preferenza di associazione di WDR43 con distanziale trascritto esterno da 5' (5'-ETS) di pre-rRNA20 (Figura 4). Questi risultati convalidano l'affidabilità del metodo FBIoCLIP-seq.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td>HL-2000 HybrilLinker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity Purification Beads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>112.06D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOAc</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 x FLAG peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>CIP buffer is in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0247S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M158-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porteinase K</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse trancriptase (SupperScriptIII)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation reagent (Trizol)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1614363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td>PNK buffer is in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligaes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EL0021</td>
			<td>T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td>T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mESC culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (80%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS (15%)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>purified recombinant protein; 10,000 fold dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoside mix (1%)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-008-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcriptome-wide profiling of protein-rna interactions by cross-linking and immunoprecipitation mediated by flag-biotin tandem purification

Le proteine leganti RNA e RNA (RRP) controllano molteplici processi biologici. La disposizione spaziale e temporale degli RRN e degli RRP è alla base della delicata regolazione di questi processi. È stata sviluppata una strategia chiamata CLIP-seq (cross-linking e immunoprecipitation) per catturare le interazioni proteina-RNA endogena con il cross-linking UV seguito dall'immunoprecipitazione. Nonostante l'ampio uso del metodo CLIP-seq convenzionale nello studio RBP, il metodo CLIP è limitato dalla disponibilità di anticorpi di alta qualità, potenziali contaminanti dagli RRP copurificati, requisito di manipolazione degli isotopi e potenziale perdita di informazioni durante una noiosa procedura sperimentale. Qui descriviamo un metodo CLIP-seq modificato chiamato FbioCLIP-seq utilizzando la purificazione tandem tag FLAG-biotina. Attraverso la purificazione tandem e le rigorose condizioni di lavaggio, quasi tutte le proteine interagenti leganti l'RNA vengono rimosse. Pertanto, anche gli RNA che interagiscono indirettamente mediati da questi RMP copurificati sono ridotti. Il nostro metodo FBIoCLIP-seq consente un rilevamento efficiente di RNA dirette legate alle proteine senza SDS-PAGE e procedure di trasferimento di membrana in modo privo di isotopi e specifico per proteine.

La rappresentazione schematica della procedura FBIOCLIP-seq è illustrata nella figura 1. Rispetto alla purificazione dell'affinità in un solo passaggio mediata da FLAG o streptavidina, la purificazione tandem FLAG-biotina ha rimosso quasi tutte le proteine copurificate, evitando la contaminazione delle interazioni indirette proteina-RNA (Figura 2). I risultati rappresentativi per FbioCLIP-seq per LIN28 e WDR43 sono illustrati nella <stron...

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification at JoVE.com

Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

Qui presentiamo un protocollo CLIP-seq modificato chiamato FbioCLIP-seq con purificazione tandem FLAG-biotina per determinare gli obiettivi di RNA delle proteine leganti l'RNA (RRP) nelle cellule dei mammiferi.

Profilazione a livello di trascrizione delle interazioni proteina-RNA attraverso il cross-linking e l'immunoprecipitazione mediata dalla purificazione tandem FLAG-Biotina

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

Solo e solo le proteine leganti controllano più processi biologici. Questo metodo FLAG-Biotin CLIP-seq, quindi per profilare globalmente la disposizione speciale e temporale di RTA e RRP nelle cellule di mammifero. Questo metodo consente un rilevamento efficiente degli RNA diretti legati alle proteine senza SDS-PAGE e delle procedure di trasferimento della membrana.Rispetto al tradizionale CLIP-seq è privo di isotopi e non richiede anticorpi specifici per proteine. Inizia placcando circa 3 milioni di cellule staminali embrionali di topo in una piastra di 10 centimetri e incubandole durante la notte. Il giorno successivo, rimuovere il mezzo con un vuoto e trattare le cellule con due millilitri dello 0,25% di tripside EDTA per due minuti a temperatura ambiente.Tempra la triptina con quattro millilitri di mezzo MESC fresco e trasferisci le cellule in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Quindi, centrifugarli a 300 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il supernatante. Sospendere le celle in quattro millilitri di PBS freddo e trasferirle di nuovo nella piastra di 10 centimetri per il cross-linking.Irradiare le cellule con una luce UV di 254 nanometri, quindi trasferire le cellule collegate incrociate in un tubo da 15 millilitri. Far girare queste cellule a 300 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius, quindi rimuovere il supernatante e lisciviare le cellule con 500 microlitri di Buffer A preparati secondo le indicazioni manoscritte. Trasferire le cellule in un tubo di 1,5 millilitro privo di RNAse e incubarle a quattro gradi Celsius con una rotazione delicata per 30-60 minuti.Trattare il lisato con 30 microlitri di DNAsi 1 a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, interrompere la reazione aggiungendo quattro microlitri di EDTA molare 0,5. Spingi il pellet insolubile centrifugando a 12.000 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius e trasferisci il supernatante in un nuovo tubo prerimente refrigerato da 1,5 millilitri.Trasferire il lisato cellulare in perline FLAG prealibrate e incubare il campione a quattro gradi Celsius mentre si ruota per due o quattro ore. Dopo l'incubazione, centrifugare le perline per due minuti a 3000 volte G e rimuovere il supernatante. Aggiungere 500 microlitri di Buffer A al campione e incubare a 4 gradi Celsius per cinque minuti, quindi girare giù per le perline e rimuovere il supernatante.Ripetere il lavaggio con buffer A, seguito da due lavaggi con un'elute Buffer B.To pre refrigerata con un peptide X FLAG, preparare la soluzione di eluizione come descritto nel manoscritto testuale e far girare le perline FLAG. Rimuovere il supernatante con una punta di pipetta a estremità stretta e aggiungere 200 microlitri della soluzione di eluizione X FLAG a ciascun campione. Incubare i campioni per 30 minuti a quattro gradi Celsius con una rotazione delicata.Quindi girare giù le perline per due minuti a 3000 volte G.Trasferire il supernato su un tubo fresco e ripetere l'eluizione due volte. Salvare il 5% degli eluenti per l'analisi western della macchia o la colorazione dell'argento per verificare l'efficienza dell'immunoprecipitazione FLAG. Trasferire gli eluenti tirati su perline di streptavidina preparate e ruotare delicatamente i campioni a quattro gradi Celsius per una o tre ore o durante la notte.Quindi, raccogliere le perline su un supporto magnetico e rimuovere il supernatante. Lavare le perline due volte con 500 microlitri di Buffer C con rotazione delicata per cinque minuti per lavaggio. Successivamente, lavare le perline due volte con 500 microlitri di Buffer D e due volte con 500 microlitri di tampone PNK ghiacciato, raccogliendo le perline sul supporto magnetico e rimuovendo il supernatante tra un lavaggio e l'altro.Per eseguire la digestione parziale dell'RNA, aggiungere 100 microlitri di soluzione MNA a ciascun campione e vortice impostato a 37 gradi Celsius con un miscelatore termico per 10 minuti. Raccogliere le perline con un supporto magnetico per 30 secondi e rimuovere il supernatante. Quindi, lavarli con tampone PNK-EDTA, buffer C e buffer PNK secondo le indicazioni del manoscritto.Raccogliere le perline con il supporto magnetico e rimuovere il tampone. Quindi, aggiungere il mix di reazione CIP e vortice le perline a 37 gradi Celsius con un miscelatore termico per 10 minuti. Lavare rapidamente le perline due volte con 500 microlitri di tampone PNK EDTA ghiacciato, seguiti da due lavaggi con 500 microlitri di tampone PNK ghiacciato.Dopo i lavaggi, aggiungere 40 microlitri di tre primi mix di legatura del linker alle perline e vortice a 16 gradi Celsius con un miscelatore termico per tre ore o durante la notte. Una legatura efficiente del linker agli alleati è fondamentale per questo esperimento. Controllare occasionalmente il tubo di reazione per assicurarsi che questi non precipitino durante la legatura.Dopo l'incubazione, ripetere i lavaggi con tamponi PNK EDTA e PNK, aggiungere 40 microlitri di PNK mescolati alle perline e vortice a 37 gradi Celsius con il miscelatore termico per 10 minuti. Lavare le perline con tamponi PNK EDTA e PNK, quindi procedere con l'isolamento dell'RNA come descritto nel manoscritto testuale. Rispetto alla purificazione mediata da FLAG o streptavidina in un solo passaggio, la purificazione tandem FLAG-Biotina ha rimosso quasi tutte le proteine purificate del nucleo, evitando la contaminazione delle interazioni indirette dell'RNA proteico.LIN28 e WDR43, Fbio CLIP-seq è stato eseguito utilizzando cellule staminali embrionali del topo. In totale, sono state recuperate circa 7,7 milioni e 2,2 milioni di letture univoche rispettivamente per LIN28 e WDR43. Il confronto delle viste della traccia mostra diversi modelli di rilegatura nel locus RN45 pre-rRNA.I siti cross-linked sul motivo GGA G di RNA pre-let7-g di LIN28, Fbio CLIP-seq o identificati. Inoltre, sono stati determinati motivi di RNA arricchiti nei siti di legame e la percentuale di nucleotidi mutati in diversi tipi di mutazioni. Dimostrando che LIN28 preferisce legarsi al nucleotide genico.Bene, alle 22:00, questo protocollo, è importante confermare l'efficienza dell'immunoprecipitazione per assicurarsi che solo i complessi proteici siano stati purificati con successo.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Analisi del promotore di ligandi di c-KIT utilizzando l&#39;immunoprecipitazione cromatina

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Ricerca

Genetica

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Indagine della sintesi di RNA usando 5-Bromouridine di etichettatura e di immunoprecipitazione

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Promotore cattura Ciao-c: Ad alta risoluzione, Genome-wide profilatura delle interazioni del promotore

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Immunoprecipitazione della cromatina del tessuto adiposo marrone murino

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Numero variabile Tandem-ripetizione Analisi del batterio patogeno del pesce Yersinia ruckeri di Multiplex PCR e elettroforesi capillare

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteina-mediato Precision Gene Editing da Elettroporazione Tube

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Un saggio per quantificare il legame proteino-RNA nei batteri

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identificazione delle impronte di RNA:Complessi proteici tramite l'immunoprecipitazioni dell'RNA in Tandem seguita dal sequenziamento (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Trasformazione, editing del genoma e fenotipizzazione dell'azoto-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...