Name: transcriptome-wide profiling of protein-rna interactions by cross-linking and immunoprecipitation mediated by flag-biotin tandem purification
Uploaded: 2020-05-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification at JoVE.com

Grant støtte er fra National Basic Research Program of China (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), National Natural Science Foundation of China (31630095), og Center for Life Sciences ved Tsinghua University.

1. Cellelinjekonstruksjon
<ol><li>Klone genet av interesse i en PiggyBac vektor pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA av interesse]-(Hygromycin-resistent) plasmid som bærer en FLAG-biotin epitop13,21 å uttrykke en FLAG-biotin tag smeltet RBP (FBRBP).</li>
	<li>Cotransfect FBRBP uttrykker vektor med pBase vektor i en cellelinje som uttrykker BirAenzymet 22. MERK: I denne studien ble FBRBP-genet transfisert til emb...

<ol>
	<li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates.">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li><li>Guallar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-dependent+chromatin+targeting+of+TET2+for+endogenous+retrovirus+control+in+pluripotent+stem+cells.">RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells.</a> Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).</li><li>Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Maps+of+ProQ+Binding+In+Vivo+Reveal+Target+Recognition+via+RNA+Structure+and+Stability+Control+at+mRNA+3'+Ends.">Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends.</a> Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).</li><li>Wei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBFox2+Binds+Nascent+RNA+to+Globally+Regulate+Polycomb+Complex+2+Targeting+in+Mammalian+Genomes.">RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes.</a> Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PARP-1+by+snoRNAs+Controls+Ribosome+Biogenesis+and+Cell+Growth+via+the+RNA+Helicase+DDX21.">Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).</li><li>Yao, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+Pre-rRNA+Sorting+via+Phase+Separation+Drives+the+Assembly+of+Dense+Fibrillar+Components+in+the+Human+Nucleolus.">Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus.</a> Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).</li><li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing.">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li><li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Argonaute+and+conventional+RNA-binding+protein+interactions+with+RNA+at+single-nucleotide+resolution+using+HITS-CLIP+and+CIMS+analysis.">Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).</li><li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=irCLIP+platform+for+efficient+characterization+of+protein-RNA+interactions.">irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions.</a> Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).</li><li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+(eCLIP).">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins.">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).</li><li>de Boer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li><li>Bi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Targets+Ribogenesis+Factor+WDR43+to+Chromatin+for+Transcription+and+Pluripotency+Control.">RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control.</a> Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).</li><li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT4+in+concert+with+Lin28+suppresses+microRNA+biogenesis+through+pre-microRNA+uridylation.">TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation.</a> Cell. 138 (4), 696-708 (2009).</li><li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28A+Is+a+Suppressor+of+ER-Associated+Translation+in+Embryonic+Stem+Cells.">LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+roles+for+the+ribosome+biogenesis+factor+Wdr43+in+zebrafish+development.">Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development.</a> PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).</li><li>Wilbert, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28+binds+messenger+RNAs+at+GGAGA+motifs+and+regulates+splicing+factor+abundance.">LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).</li><li>Hunziker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UtpA+and+UtpB+chaperone+nascent+pre-ribosomal+RNA+and+U3+snoRNA+to+initiate+eukaryotic+ribosome+assembly.">UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly.</a> Nature Communications. 7, 12090 (2016).</li><li>Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+vivo+biotinylation+to+study+protein-protein+and+protein-DNA+interactions+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).</li><li>Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+piggyBac+transposon-based+mammalian+cell+expression+system+for+inducible+protein+production.">Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).</li><li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li><li>Aktas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHX9+suppresses+RNA+processing+defects+originating+from+the+Alu+invasion+of+the+human+genome.">DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome.</a> Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).</li><li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Crosslinking+Immunoprecipitation+(eCLIP)+Method+for+Efficient+Identification+of+Protein-bound+RNA+in+Mouse+Testis.">Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).</li></ol>

Her introduserer vi en modifisert CLIP-seq metode kalt FbioCLIP-seq, dra nytte av FLAG-biotin dobbel merking system for å utføre tandem rensing av protein-RNA komplekser. FLAG-biotin dobbelt merking systemet har vist seg å være kraftig i å identifisere protein-protein og protein-DNAinteraksjoner 13,21. Her demonstrerer vi den høye spesifisiteten og bekvemmeligheten til dette systemet i å identifisere RNAs som samhandler med proteiner. Gjennom ta...

RNAs og RNA-bindende proteiner (RBPs) kontrollerer ulike cellulære prosesser, inkludert skjøting, oversettelse, ribosombiogenese, epigenetisk regulering og celleskjebneovergang1,2,3,4,5,6. De delikate mekanismene i disse prosessene avhenger av det unike romlige og timelige arrangementet av RNAer og RBPer. Derfor er et viktig skritt mot å forstå RNA-regulering på molekylært nivå å avsløre posisjonsinformasjon om de bindende stedene til RBPs.
En strategi referert til som kryss-linking og immunprecipitation (CLIP-seq) er utviklet for å fange protein-RNA interaksjoner med UV kryss-linking etterfulgt av immunforutslettelse av protein av interesse7. Hovedtrekket ved metodikken er induksjon av kovalente kryssforbindelser mellom et RNA-bindende protein og dets direkte bundne RNA-molekyler (innen ~ 1 Å) ved UV-bestråling8. RBP-fotavtrykkene kan bestemmes av CLIP-kodeklynging og toppsamtaler, som vanligvis har en oppløsning på 30-60 nt. Alternativt kan det omvendte transkripsjonstrinnet i CLIP føre til indels (innsettinger eller slettinger) eller erstatninger til krysskoblingsstedene, noe som gjør det mulig å identifisere proteinbindingssteder på RNA-ene ved en enkeltkjerneotidoppløsning. Rørledninger som Novoalign og CIMS er utviklet for analyse av sekvenseringsresultatene med høy gjennomstrømning av CLIP-seq8. Flere modifiserte CLIP-seq metoder har også blitt foreslått, inkludert individuell-nukleotid oppløsning kryss-linking og immunoprecipitation (iCLIP), forbedret CLIP (eCLIP), irCLIP, og fotoaktiv ribonucleoside-forbedret kryss-linking og immunoprecipitation (PAR-CLIP)9,10,11,12.
Til tross for den brede bruken av tradisjonelle CLIP-seq metoder i studien av RBPs, har CLIP-metodene flere ulemper. For det første kan den kjedelige denaturerte gelelektroforese og membranoverføringsprosedyren føre til tap av informasjon, og forårsake begrenset sekvenskompleksitet. For det andre kan den proteinspesifikke antistoffbaserte CLIP-metoden trekke ned et proteinkompleks i stedet for et enkelt målprotein, noe som kan føre til falske positive protein-RNA-interaksjoner fra de copurified RBPs. For det tredje krever den antistoffbaserte strategien en stor mengde antistoffer av høy kvalitet, noe som gjør anvendelsen av disse metodene utilstrekkelig for studiet av RBPs uten antistoffbaserte antistoffer tilgjengelige. For det fjerde krever den tradisjonelle CLIP-metoden radiomerket ATP for å merke de proteinbundne RTA-ene.
Den høye affiniteten til streptavidin til biotinylererte proteiner gjør det til en svært kraftig tilnærming for å rense spesifikke proteiner eller proteinkomplekser. Effektiv biotinylering av proteiner som bærer en kunstig peptidsekvens ved ektopisk uttrykt bakteriell BirA biotin ligase i pattedyrceller gjør det til en effektiv strategi for å utføre biotinrensing in vivo13. Vi utviklet en modifisert CLIP-seq metode kalt FbioCLIP-seq(FLAG-Biotinn-mediert Cross-linking og jegmmunoprecipitation etterfulgt av høy gjennomstrømning sekvensering) ved hjelp av FLAG-biotin tag tandem rensing14 (Figur 1). Gjennom tandemrensing og strenge vaskeforhold fjernes nesten alle de interagerende RBPs (figur 2). De strenge vaskeforholdene gjør det også mulig å omgå SDS-PAGE og membranoverføring, som er arbeidsintensiv og teknisk utfordrende. Og i likhet med eCLIP og irCLIP, er FbioCLIP-seq-metoden isotopfri. Hoppe gel kjører og overføring trinn unngår tap av informasjon, holder autentisk protein-RNA interaksjoner intakt, og øker biblioteket kompleksitet. Videre gjør den høye effektiviteten av merkesystemet det til et godt valg for RBPs uten høykvalitets antistoffer tilgjengelig.
Her gir vi en trinnvis beskrivelse av FbioCLIP-seq-protokollen for pattedyrceller. Kort sagt, celler er krysskoblet av 254 nm UV, etterfulgt av cellelysis og FLAG immunprecipitation (FLAG-IP). Deretter blir protein-RNA-kompleksene ytterligere renset av biotin affinitetsfangst og RNA-er fragmentert av delvis fordøyelse med MNase. Deretter er den proteinbundne RNA defosforylert og ligated med en 3'linker. En 5' RNA linker tilsettes etter at RNA er fosforylert med PNK og eluted av proteinase K fordøyelsen. Etter omvendt transkripsjon forsterkes de proteinbundne RNA-signalene av PCR og renses ved agarose gelrensing. To RBPs ble valgt til å eksemplifisere FbioCLIP-seq resultatet. LIN28 er et godt karakterisert RNA-bindende protein involvert i microRNA modning, proteinoversettelse og celleomprogrammering15,16,17. WDR43 er et WD40-domeneholdig protein som antas å koordinere ribosometbiogenese, eukaryotisk transkripsjon og embryonal stamcellepuripotencykontroll14,18. I samsvar med tidligere rapporterte resultater for LIN28 med CLIP-seq, avslører FbioCLIP-seq bindende nettsteder av LIN28 på "GGAG" motiver i microRNA mir-let7g og mRNAs16,19 ( Figur3). WDR43 FbioCLIP-seq identifiserte også den bindende preferansen til WDR43 med 5' eksterne transkriberte avstandssyr (5'-ETS) av pre-rRNAs20 (figur 4). Disse resultatene validerer påliteligheten til FbioCLIP-seq-metoden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td>HL-2000 HybrilLinker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity Purification Beads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>112.06D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOAc</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 x FLAG peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>CIP buffer is in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0247S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M158-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porteinase K</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse trancriptase (SupperScriptIII)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation reagent (Trizol)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1614363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td>PNK buffer is in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligaes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EL0021</td>
			<td>T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td>T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mESC culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (80%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS (15%)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>purified recombinant protein; 10,000 fold dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoside mix (1%)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-008-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcriptome-wide profiling of protein-rna interactions by cross-linking and immunoprecipitation mediated by flag-biotin tandem purification

RNA- og RNA-bindende proteiner (RBO-er) kontrollerer flere biologiske prosesser. Det romlige og timelige arrangementet av RNA-er og RBPer ligger til grunn for den delikate reguleringen av disse prosessene. En strategi kalt CLIP-seq (krysskobling og immunforebutning) er utviklet for å fange endogene protein-RNA interaksjoner med UV kryss-linking etterfulgt av immunprecipitation. Til tross for den brede bruken av konvensjonell CLIP-seq-metode i RBP-studien, er CLIP-metoden begrenset av tilgjengeligheten av antistoffer av høy kvalitet, potensielle forurensninger fra de copurified RBPs, kravet om isotopmanipulasjon og potensielt tap av informasjon under en kjedelig eksperimentell prosedyre. Her beskriver vi en modifisert CLIP-seq metode kalt FbioCLIP-seq ved hjelp av FLAG-biotin tag tandem rensing. Gjennom tandemrensing og strenge vaskeforhold fjernes nesten alle de interagerende RNA-bindende proteinene. Dermed reduseres RNA-ene som samhandler indirekte mediert av disse kopurifiserte RBP-ene også. Vår FbioCLIP-seq-metode muliggjør effektiv påvisning av direkte proteinbundne RNA-er uten SDS-PAGE- og membranoverføringsprosedyrer på en isotopfri og proteinspesifikk antistofffri måte.

Den skjematiske representasjonen av FbioCLIP-seq-prosedyren vises i figur 1. Sammenlignet med FLAG-mediert eller streptavidin-mediert ett-trinns affinitetsrensing, fjernet FLAG-biotin tandemrensing nesten alle kopurified proteiner, unngå forurensning av indirekte protein-RNA interaksjoner (figur 2). Representative resultater for FbioCLIP-seq for LIN28 og WDR43 er avbildet i figur 3 og figu...

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification at JoVE.com

Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

Her presenterer vi en modifisert CLIP-seq protokoll kalt FbioCLIP-seq med FLAG-biotin tandem rensing for å bestemme RNA mål av RNA-bindende proteiner (RBPs) i pattedyr celler.

Transkripsjonsomfattende profilering av protein-RNA interaksjoner ved krysskobling og immunoprecipitation mediert av FLAG-Biotin Tandem rensing

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

Bare og bare bindende proteiner kontrollerer flere biologiske prosesser. Denne FLAG-Biotin CLIP-seq-metoden, derav for å globalt profilere det spesielle og det timelige arrangementet av RNA-er og RBPer i pattedyrceller. Denne metoden muliggjør effektiv påvisning av direkte proteinbundne RNA-er uten SDS-PAGE og membranoverføringsprosedyrene.Sammenlignet med tradisjonelle CLIP-seq er isotop gratis og det krever ikke proteinspesifikt antistoff. Begynn med å plating om 3 millioner mus embryonale STAMCELLER i en 10 centimeter plate og inkubere dem over natten. På neste dag fjerner du mediet med et vakuum og behandler cellene med to milliliter på 0,25% trypsin EDTA i to minutter ved romtemperatur.Slu trypsin med fire milliliter frisk MESC medium, og overføre cellene til en 15 milliliter sentrifuge rør. Deretter sentrifuger dem på 300 ganger G i tre minutter ved fire grader Celsius og fjern supernatanten. Suspender cellene i fire milliliter kald PBS og overfør dem tilbake til 10 centimeter plate for krysskobling.Utstråle cellene med et 254 nanometer UV-lys, og overfør deretter de krysskoblede cellene til et 15 milliliter rør. Spinn ned disse cellene ved 300 ganger G i tre minutter ved fire grader Celsius, og fjern deretter de supernatante og lyse cellene med 500 mikroliter buffer A utarbeidet i henhold til manuskriptretninger. Overfør cellene til et RNAse-fritt 1,5 milliliter rør, og inkuber dem ved fire grader Celsius med mild rotasjon i 30 til 60 minutter.Behandle lysatet med 30 mikroliter dnase 1 ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Deretter stopper du reaksjonen ved å legge til fire mikroliter på 0,5 molar EDTA. Spinn ned den uoppløselige pelleten ved å sentrifugere ved 12 000 ganger G i 20 minutter ved fire grader Celsius, og overfør supernatanten til et nytt prekjølt 1,5 milliliter rør.Overfør cellelylat til pre equilibrated FLAG perler, og inkuber prøven på fire grader Celsius mens du roterer i to til fire timer. Etter inkubasjonen sentrifuger perlene i to minutter ved 3000 ganger G og fjern supernatanten. Tilsett 500 mikroliter buffer A i prøven, og inkubert ved 4 grader Celsius i fem minutter, spinn deretter ned perlene og fjern det overnaturlige.Gjenta vasken med Buffer A, etterfulgt av to vasker med forhåndskjølt Buffer B.To elute med en tre X FLAG-peptid, forberede elution løsningen som beskrevet i teksten manuskriptet og spinne ned FLAG-perler. Fjern supernatanten med en smal endepipettespiss og tilsett 200 mikroliter av de tre X FLAG-elutionløsningene til hver prøve. Inkuber prøvene i 30 minutter ved fire grader Celsius med mild rotasjon.Deretter spinner du ned perlene i to minutter ved 3000 ganger G.Overfør supernatet til et friskt rør og gjenta elution to ganger. Spar 5% av eluents for vestlig flekk analyse eller sølv farging for å sjekke effektiviteten av FLAG immunprecipitation. Overfør de trukket eluents til forberedt streptavidin perler og rotere prøvene forsiktig ved fire grader Celsius i en til tre timer eller over natten.Deretter samler du perlene på et magnetisk stativ og fjerner det overnaturlige. Vask perlene to ganger med 500 mikroliter buffer C med mild rotasjon i fem minutter per vask. Deretter vasker du perlene to ganger med 500 mikroliter buffer D, og to ganger med 500 mikroliter iskald PNK-buffer, samler perlene på magnetstativet og fjerner det overnaturlige mellom vaskene.For å utføre delvis RNA-fordøyelse, tilsett 100 mikroliter MNA-løsning til hver prøve og virvel satt til 37 grader Celsius med en termisk mikser i 10 minutter. Samle perlene med et magnetisk stativ i 30 sekunder og fjern det overnaturlige. Vask dem deretter med PNK-EDTA buffer, Buffer C og PNK buffer i henhold til manuskriptretninger.Samle perlene med magnetstativet og fjern bufferen. Deretter legger du til CIP-reaksjonsblandingen og virvler perlene ved 37 grader Celsius med en termisk mikser i 10 minutter. Vask perlene raskt to ganger med 500 mikroliter iskald PNK EDTA-buffer, etterfulgt av to vasker med 500 mikroliter iskald PNK-buffer.Etter vaskene, legg til 40 mikroliter av tre prime linker ligation blanding til perlene, og vortex dem på 16 grader Celsius med en termisk mikser i tre timer eller over natten. Effektiv ligasjon av linker til de allierte er avgjørende for dette eksperimentet. Kontroller av og til reaksjonsrøret for å forsikre deg om at disse ikke utløses under ligation.Etter inkubasjonen gjentar du vaskene med PNK EDTA- og PNK-buffere, legger til 40 mikroliter PNK blandet til perlene, og virvler dem ved 37 grader Celsius med varmeblanderen i 10 minutter. Vask perlene med PNK EDTA- og PNK-buffere, og fortsett deretter med RNA-isolasjon som beskrevet i tekstmanuskriptet. Sammenlignet med FLAG-mediert eller streptavidin mediert ett trinn affinitet rensing, FLAG-Biotin tandem rensing fjernet nesten alle kjernen renset proteiner, unngå forurensning av indirekte protein RNA interaksjoner.LIN28 og WDR43, Fbio CLIP-seq ble utført ved hjelp av mus embryonale stamceller. Totalt ble det hentet inn om lag 7,7 millioner og 2,2 millioner unike visninger for henholdsvis LIN28 og WDR43. Sammenligning av sporvisninger viser ulike bindingsmønstre i RN45 pre-rRNA locus.De krysskoblede nettstedene på GGA G-motivet til pre-let7-g RNA av LIN28, Fbio CLIP-seq eller identifisert. Videre ble berikede RNA-motiver på bindingsstedene, og prosentandelen av muterte nukleotider i forskjellige typer mutasjoner bestemt. Viser at LIN28 foretrekker å binde seg til genkjerner.Vel, klokken 22:00, denne protokollen, er det viktig å bekrefte effektiviteten av immunoprecipitation å sørge for at proteinet bare komplekser ble renset med hell.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Analyse av c-KIT ligand-promotoren ved bruk av kromatinimmunutfelling

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Undersøkelse av RNA syntese med 5-Bromouridine merking og Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Promotoren fange Hei-C: Med høy oppløsning, genomet-bred profilering av arrangøren interaksjoner

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Chromatin Immunoprecipitation av Murine brun fettvev

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-geometrisk variabel-nummer tandem-gjenta analyse av fisk-patogene bakterien Yersinia ruckeri av multiplex PCR og kapillær elektroforese

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediert presis Genredigering av tube electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

En analyse for kvantifisere protein-RNA binding i bakterier

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identifisering av fotavtrykk av RNA: protein komplekser via RNA-Immunutfelling i tandem etterfulgt av sekvensering (RIPiT-SEQ)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transformasjon, Genova redigering og bestemmelse av fenotype av nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...