Name: transcriptome-wide profiling of protein-rna interactions by cross-linking and immunoprecipitation mediated by flag-biotin tandem purification
Uploaded: 2020-05-18T13:00:00
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O apoio ao subsídio é do Programa Nacional de Pesquisa Básica da China (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31630095) e do Centro de Ciências da Vida da Universidade de Tsinghua.

1. Construção de linha celular
<ol><li>Clone o gene de interesse em um bitão vetorial piggybac pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA de interesse]-(Resistente à hisgromicina) plasmídeo que carrega um epítope FLAG-biotina13,21 para expressar uma tag FLAG-biotin fundida RBP(FBRBP).</li>
	<li>Cotransfecte o FBRBP expressando vetor com o vetor pBase em uma linha celular expressando a enzima BirA22. NOTA: Neste estudo, o gen...

<ol>
	<li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates.">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li><li>Guallar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-dependent+chromatin+targeting+of+TET2+for+endogenous+retrovirus+control+in+pluripotent+stem+cells.">RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells.</a> Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).</li><li>Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Maps+of+ProQ+Binding+In+Vivo+Reveal+Target+Recognition+via+RNA+Structure+and+Stability+Control+at+mRNA+3'+Ends.">Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends.</a> Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).</li><li>Wei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBFox2+Binds+Nascent+RNA+to+Globally+Regulate+Polycomb+Complex+2+Targeting+in+Mammalian+Genomes.">RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes.</a> Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PARP-1+by+snoRNAs+Controls+Ribosome+Biogenesis+and+Cell+Growth+via+the+RNA+Helicase+DDX21.">Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).</li><li>Yao, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+Pre-rRNA+Sorting+via+Phase+Separation+Drives+the+Assembly+of+Dense+Fibrillar+Components+in+the+Human+Nucleolus.">Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus.</a> Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).</li><li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing.">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li><li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Argonaute+and+conventional+RNA-binding+protein+interactions+with+RNA+at+single-nucleotide+resolution+using+HITS-CLIP+and+CIMS+analysis.">Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).</li><li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=irCLIP+platform+for+efficient+characterization+of+protein-RNA+interactions.">irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions.</a> Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).</li><li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+(eCLIP).">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins.">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).</li><li>de Boer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li><li>Bi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Targets+Ribogenesis+Factor+WDR43+to+Chromatin+for+Transcription+and+Pluripotency+Control.">RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control.</a> Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).</li><li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT4+in+concert+with+Lin28+suppresses+microRNA+biogenesis+through+pre-microRNA+uridylation.">TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation.</a> Cell. 138 (4), 696-708 (2009).</li><li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28A+Is+a+Suppressor+of+ER-Associated+Translation+in+Embryonic+Stem+Cells.">LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+roles+for+the+ribosome+biogenesis+factor+Wdr43+in+zebrafish+development.">Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development.</a> PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).</li><li>Wilbert, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28+binds+messenger+RNAs+at+GGAGA+motifs+and+regulates+splicing+factor+abundance.">LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).</li><li>Hunziker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UtpA+and+UtpB+chaperone+nascent+pre-ribosomal+RNA+and+U3+snoRNA+to+initiate+eukaryotic+ribosome+assembly.">UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly.</a> Nature Communications. 7, 12090 (2016).</li><li>Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+vivo+biotinylation+to+study+protein-protein+and+protein-DNA+interactions+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).</li><li>Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+piggyBac+transposon-based+mammalian+cell+expression+system+for+inducible+protein+production.">Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).</li><li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li><li>Aktas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHX9+suppresses+RNA+processing+defects+originating+from+the+Alu+invasion+of+the+human+genome.">DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome.</a> Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).</li><li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Crosslinking+Immunoprecipitation+(eCLIP)+Method+for+Efficient+Identification+of+Protein-bound+RNA+in+Mouse+Testis.">Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).</li></ol>

Aqui introduzimos um método clip-seq modificado chamado FbioCLIP-seq, aproveitando o sistema de marcação dupla FLAG-biotin para realizar a purificação tandem de complexos de proteína-RNA. O sistema de marcação dupla FLAG-biotina tem se mostrado poderoso na identificação de interações proteína-proteína-DNA13,21. Aqui demonstramos a alta especificidade e conveniência desse sistema na identificação das RNAs interagindo com proteínas. Atr...

As RNAs e as proteínas de ligação de RNA (RBPs) controlam diversos processos celulares, incluindo emenda, tradução, biogênese ribossa, regulação epigenética e transição do destino celular1,2,3,4,5,6. Os mecanismos delicados desses processos dependem do arranjo espacial e temporal único das RNAs e RBPs. Portanto, um passo importante para entender a regulação do RNA no nível molecular é revelar as informações posicionais sobre os locais de vinculação de RBPs.
Uma estratégia chamada de inter-vinculação e imunoprecipitação (CLIP-seq) foi desenvolvida para capturar interações proteína-RNA com ligação UV seguida de imunoprecipitação da proteína de interesse7. A principal característica da metodologia é a indução de ligações cruzadas covalentes entre uma proteína de ligação de RNA e suas moléculas de RNA diretamente ligadas (dentro de ~1 Å) por irradiação UV8. As pegadas RBP podem ser determinadas por clustering de tag CLIP e chamada de pico, que geralmente têm uma resolução de 30-60 nt. Alternativamente, a etapa de transcrição reversa do CLIP pode levar a indels (inserções ou exclusões) ou substituições aos locais de ligação cruzada, o que permite a identificação de locais de ligação proteica nos RNAs em uma resolução de nucleotídeo único. Pipelines como Novoalign e CIMS foram desenvolvidos para a análise dos resultados de sequenciamento de alto rendimento do CLIP-seq8. Vários métodos modificados de CLIP-seq também foram propostos, incluindo a interfrontecimento e imunoprecipitação de resolução individual-nucleotídeo (iCLIP), clip aprimorado (eCLIP), irCLIP e fotoativação de ligação cruzada e imunoprecipitação (PAR-CLIP)9,10,11,12.
Apesar do amplo uso dos métodos tradicionais clip-seq no estudo de RBPs, os métodos CLIP têm várias desvantagens. Primeiro, o tedioso procedimento de eletroforese de gel desnaturado e transferência de membrana pode levar à perda de informações, e causar complexidade limitada da sequência. Em segundo lugar, o método CLIP baseado em anticorpos específicos da proteína pode puxar para baixo um complexo proteico em vez de uma proteína de destino único, o que pode levar a falsas interações proteína positiva-RNA a partir dos RBPs copurificados. Em terceiro lugar, a estratégia baseada em anticorpos requer uma grande quantidade de anticorpos de alta qualidade, o que torna a aplicação desses métodos inadequada para o estudo de RBPs sem anticorpos de alta qualidade disponíveis. Em quarto lugar, o método CLIP tradicional requer ATP radiolabeled para rotular as RNAs ligadas à proteína.
A alta afinidade de streptavidin com proteínas biotiniladas torna-se uma abordagem muito poderosa para purificar proteínas específicas ou complexos proteicos. A biotiningação eficiente de proteínas que carregam uma sequência de peptídeos artificiais por ligase de biotina bacteriana expressa em ectopicamente em células de mamíferos torna-se uma estratégia eficiente para realizar a purificação da biotina in vivo13. Desenvolvemos um método clip-seq modificado chamado FbioCLIP-seq (FLAG-Biocolorido Cross-linking e Immunoprecipitation seguido de sequenciamento de alta produtividade) usando flag-biotin tag tandem purificação14 (Figura 1). Através da purificação em tandem e condições rigorosas de lavagem, quase todos os RBPs interagindo são removidos(Figura 2). As condições rigorosas de lavagem também permitem contornar a transferência de SDS-PAGE e membrana, que é trabalhosa intensiva e tecnicamente desafiadora. E semelhante ao eCLIP e irCLIP, o método FBIOCLIP-seq é livre de isótopos. Pular o gel correndo e transferir etapas evita a perda de informações, mantém as interações autênticas proteína-RNA intactas e aumenta a complexidade da biblioteca. Além disso, a alta eficiência do sistema de marcação torna-o uma boa escolha para RBPs sem anticorpos de alta qualidade disponíveis.
Aqui fornecemos uma descrição passo-a-passo do protocolo FBIOCLIP-seq para células de mamíferos. Resumidamente, as células são cruzadas por 254 nm UV, seguidas por lise celular e imunoprecipitação flag (FLAG-IP). Em seguida, os complexos proteína-RNA são purificados pela captura de afinidade biotina e as RNAs são fragmentadas pela digestão parcial com MNase. Em seguida, o RNA ligado à proteína é desfosforilado e ligado com um linker de 3'. Um linker de RNA de 5' é adicionado depois que o RNA é fosforilado com PNK e elucido pela digestão proteinase K. Após transcrição reversa, os sinais de RNA ligados à proteína são amplificados por PCR e purificados pela purificação do gel agarose. Dois RBPs foram escolhidos para exemplificar o resultado do FBIOCLIP-seq. LIN28 é uma proteína bem caracterizada de ligação de RNA envolvida na maturação de microRNA, tradução de proteínas e reprogramação celular15,16,17. WDR43 é uma proteína contendo domínio WD40 pensada para coordenar biogênese ribossa, transcrição eucariótica e controle de pluripotência de células-tronco embrionárias14,18. Consistente com os resultados relatados anteriormente para LIN28 com CLIP-seq, o FbioCLIP-seq revela os locais de vinculação de LIN28 em motivos "GGAG" nos motivos microRNA mir-let7g e mRNAs16,19 (Figura 3). WDR43 FbioCLIP-seq também identificou a preferência vinculante de WDR43 com espaçadores transcritos externos de 5' (5'-ETS) de pré-rRNAs20 (Figura 4). Esses resultados validam a confiabilidade do método FBIOCLIP-seq.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td>HL-2000 HybrilLinker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity Purification Beads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>112.06D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOAc</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 x FLAG peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>CIP buffer is in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0247S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M158-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porteinase K</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse trancriptase (SupperScriptIII)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation reagent (Trizol)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1614363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td>PNK buffer is in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligaes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EL0021</td>
			<td>T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td>T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mESC culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (80%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS (15%)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>purified recombinant protein; 10,000 fold dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoside mix (1%)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-008-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcriptome-wide profiling of protein-rna interactions by cross-linking and immunoprecipitation mediated by flag-biotin tandem purification

As proteínas de ligação de RNA e RNA (RBPs) controlam múltiplos processos biológicos. O arranjo espacial e temporal das RNAs e das RBPs fundamenta a delicada regulação desses processos. Uma estratégia chamada CLIP-seq (cross-linking e imunoprecipitação) foi desenvolvida para capturar interações proteicas endógenas-RNA com ligação UV seguida de imunoprecipitação. Apesar do amplo uso do método CLIP-seq convencional no estudo RBP, o método CLIP é limitado pela disponibilidade de anticorpos de alta qualidade, potenciais contaminantes dos RBPs copurificados, exigência de manipulação de isótopos e perda potencial de informações durante um procedimento experimental tedioso. Aqui descrevemos um método clip-seq modificado chamado FbioCLIP-seq usando a purificação de tag flag-biotin tandem. Através da purificação tandem e condições rigorosas de lavagem, quase todas as proteínas interativas de ligação de RNA são removidas. Assim, as RNAs interagindo indiretamente mediadas por esses RBPs copurificados também são reduzidas. Nosso método FbioCLIP-seq permite a detecção eficiente de RNAs vinculados à proteína direta sem procedimentos de transferência de SDS-PAGE e de transferência de membrana de forma livre de isótopos e sem proteínas.

A representação esquemática do procedimento FbioCLIP-seq é mostrada na Figura 1. Em comparação com a purificação de afinidade mediada por FLAG ou exptavidina, a purificação de tandem FLAG-biotin removeu quase todas as proteínas copurificadas, evitando a contaminação de interações proteicas indiretas-RNA(Figura 2). Os resultados representativos para FbioCLIP-seq para LIN28 e WDR43 são retratados na Figura...

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Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

Aqui apresentamos um protocolo clip-seq modificado chamado FbioCLIP-seq com purificação de tandem FLAG-biotin para determinar os alvos do RNA de proteínas de ligação de RNA (RBPs) em células de mamíferos.

Transcriome-Wide Perfil de Interações Protein-RNA por Cross-Linking e Imunoprecipitação Mediada pela Flag-Biotin Tandem Purification

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

Somente e somente proteínas de ligação controlam múltiplos processos biológicos. Este método FLAG-Biotin CLIP-seq, portanto, para traçar o perfil global do arranjo especial e temporal de RNAs e RBPs em células de mamíferos. Este método permite a detecção eficiente de RNAs diretas ligadas à proteína sem SDS-PAGE e os procedimentos de transferência de membrana.Comparado com o CLIP-seq tradicional é isótopo livre e não requer anticorpo específico de proteína. Comece emplacando cerca de 3 milhões de células STEM embrionárias de camundongos em uma placa de 10 centímetros e incubando-as durante a noite. No dia seguinte, remova o meio com um vácuo e trate as células com dois mililitros de 0,25% de trippsina EDTA por dois minutos em temperatura ambiente.Sacie a trippsina com quatro mililitros de meio MESC fresco, e transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Em seguida, centrifuá-los a 300 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius e remover o supernante. Suspenda as células em quatro mililitros de PBS frios e transfira-as de volta para a placa de 10 centímetros para ligação cruzada.Irradie as células com uma luz UV de 254 nanômetros, em seguida, transfira as células transversais para um tubo de 15 mililitros. Gire essas células a 300 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius, depois remova o sobrenasci e lise as células com 500 microliters de Buffer A preparados de acordo com as instruções do manuscrito. Transfira as células para um tubo de 1,5 mililitro sem RNAse e incuba-as a quatro graus Celsius com rotação suave por 30 a 60 minutos.Trate o lise com 30 microliters de DNAse 1 a 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, pare a reação adicionando quatro microliters de 0,5 molar EDTA. Gire a pelota insolúvel centrifugando a 12.000 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius, e transfira o supernante para um novo tubo pré-refrigerado de 1,5 mililitro.Transfira a célula para contas flag pré-equilibradas e incubar a amostra a quatro graus Celsius enquanto gira por duas a quatro horas. Após a incubação, centrifufique as contas por dois minutos a 3000 vezes G e remova o supernaspe. Adicione 500 microliters de Buffer A à amostra, e incubado a 4 graus Celsius por cinco minutos, em seguida, gire as contas e remova o supernante.Repita a lavagem com buffer A, seguido por duas lavagens com buffer pré-refrigerado B.To elute com um peptídeo X FLAG, prepare a solução de elução conforme descrito no manuscrito do texto e gire as contas de BANDEIRA. Remova o supernatante com uma ponta de pipeta final estreita e adicione 200 microliters da solução de elução X FLAG para cada amostra. Incubar as amostras por 30 minutos a quatro graus Celsius com rotação suave.Em seguida, gire as contas por dois minutos a 3000 vezes G.Transfira o supernato para um tubo fresco e repita a elução duas vezes. Economize 5% dos eluentes para análise de manchas ocidentais ou coloração de prata para verificar a eficiência da imunoprecipitação flag. Transfira os eluentes puxados para contas de streptavidin preparadas e gire as amostras suavemente a quatro graus Celsius por uma a três horas ou durante a noite.Em seguida, colete as contas em um suporte magnético e remova o supernatante. Lave as contas duas vezes com 500 microliters de Buffer C com rotação suave por cinco minutos por lavagem. Em seguida, lave as contas duas vezes com 500 microliters de Buffer D, e duas vezes com 500 microliters de tampão PNK gelado, coletando as contas no suporte magnético e removendo o sobrenadante entre as lavagens.Para realizar a digestão parcial do RNA, adicione 100 microliters de solução MNA a cada amostra e vórtice fixado a 37 graus Celsius com um mixer térmico por 10 minutos. Colete as contas com um suporte magnético por 30 segundos e remova o supernatante. Em seguida, lave-os com tampão PNK-EDTA, Buffer C e PNK buffer de acordo com as instruções do manuscrito.Colete as contas com o suporte magnético e remova o tampão. Em seguida, adicione a mistura de reação CIP e o vórtice das contas a 37 graus Celsius com uma batedeira térmica por 10 minutos. Lave rapidamente as contas duas vezes com 500 microliters de tampão PNK EDTA gelado, seguido por duas lavagens com 500 microliters de tampão PNK gelado.Após as lavagens, adicione 40 microliters de três misturas de ligadura de ligação prime às contas, e vórtice-os a 16 graus Celsius com uma batedeira térmica por três horas ou durante a noite. A ligadura eficiente do linker aos aliados é fundamental para este experimento. Verifique o tubo de reação ocasionalmente para ter certeza de que estes não precipitam durante a ligadura.Após a incubação, repita as lavagens com tampões PNK EDTA e PNK, adicione 40 microliters de PNK misturados às contas e o vórtice deles a 37 graus Celsius com a batedeira térmica por 10 minutos. Lave as contas com buffers PNK EDTA e PNK, em seguida, proceda com o isolamento do RNA, conforme descrito no manuscrito do texto. Em comparação com a purificação mediada por BANDEIRA ou streptavidin mediada por um passo, a purificação de tandem FLAG-Biotin removeu quase todas as proteínas purificadas do núcleo, evitando a contaminação de interações indiretas de RNA proteica.LIN28 e WDR43, Fbio CLIP-seq foi realizado usando células STEM embrionárias do rato. No total, cerca de 7,7 milhões e 2,2 milhões de leituras exclusivas foram recuperadas para LIN28 e WDR43, respectivamente. A comparação das visualizações da faixa mostra diferentes padrões de ligação no lócus pré-rRNA RN45.Os sites intercedentais no motivo GGA G de pré-let7-g RNA por LIN28, Fbio CLIP-seq ou identificados. Além disso, foram determinados motivos enriquecidos de RNA nos locais de ligação e a porcentagem de nucleotídeos mutantes em diferentes tipos de mutações. Mostrando que lin28 prefere se ligar ao nucleotídeo genético.Bem, às 22:00, este protocolo, é importante confirmar a eficiência da imunoprecipitação para garantir que os complexos da proteína fossem purificados com sucesso.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Análise do Promotor de Ligando C-KIT Usando Imunoprecipitação de Cromatina

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Genética

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Investigação da síntese do RNA usando 5-Bromouridine rotulagem e imunoprecipitação

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Promotor captura Oi-c: Alta resolução, todo o genoma caracterização das interações do promotor

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Imunoprecipitação da cromatina do tecido de adiposo marrom murino

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-Locus variável-número tandem-repita a análise do peixe-patogénico bactéria Yersinia ruckeri pela PCR multiplex e pela electroforese capilar

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteína-mediada por Gene preciso de edição por tubo Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Um ensaio para quantificar a ligação de RNA de proteína em bactérias

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identificação de pegadas de RNA: complexos proteicos via imunoprecipitação de RNA em tandem seguido de sequenciamento (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transformação, edição do genoma e fenotipagem do nitrogênio-fixação tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...