Name: transcriptome-wide profiling of protein-rna interactions by cross-linking and immunoprecipitation mediated by flag-biotin tandem purification
Uploaded: 2020-05-18T13:00:00
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El apoyo a las subvenciones es del Programa Nacional de Investigación Básica de China (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31630095) y el Centro de Ciencias de la Vida de la Universidad de Tsinghua.

1. Construcción de líneas celulares
<ol><li>Clonar el gen de interés en un plásmido pPiggyBac-FLAG-flag-bio-[cDNA de interés]-(resistente a la higromicina) que lleva un epitótopo FLAG-biotina13,21 para expresar una etiqueta FLAG-biotina fusionada RBP (FBRBP).</li>
	<li>Cotransfect the FBRBP express vector with the pBase vector into a cell line expressing the BirA enzyme22. NOTA: En este estudio, el gen <sup...

<ol>
	<li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates.">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li><li>Guallar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-dependent+chromatin+targeting+of+TET2+for+endogenous+retrovirus+control+in+pluripotent+stem+cells.">RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells.</a> Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).</li><li>Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Maps+of+ProQ+Binding+In+Vivo+Reveal+Target+Recognition+via+RNA+Structure+and+Stability+Control+at+mRNA+3'+Ends.">Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends.</a> Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).</li><li>Wei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBFox2+Binds+Nascent+RNA+to+Globally+Regulate+Polycomb+Complex+2+Targeting+in+Mammalian+Genomes.">RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes.</a> Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PARP-1+by+snoRNAs+Controls+Ribosome+Biogenesis+and+Cell+Growth+via+the+RNA+Helicase+DDX21.">Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).</li><li>Yao, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+Pre-rRNA+Sorting+via+Phase+Separation+Drives+the+Assembly+of+Dense+Fibrillar+Components+in+the+Human+Nucleolus.">Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus.</a> Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).</li><li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing.">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li><li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Argonaute+and+conventional+RNA-binding+protein+interactions+with+RNA+at+single-nucleotide+resolution+using+HITS-CLIP+and+CIMS+analysis.">Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).</li><li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=irCLIP+platform+for+efficient+characterization+of+protein-RNA+interactions.">irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions.</a> Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).</li><li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+(eCLIP).">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins.">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).</li><li>de Boer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li><li>Bi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Targets+Ribogenesis+Factor+WDR43+to+Chromatin+for+Transcription+and+Pluripotency+Control.">RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control.</a> Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).</li><li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT4+in+concert+with+Lin28+suppresses+microRNA+biogenesis+through+pre-microRNA+uridylation.">TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation.</a> Cell. 138 (4), 696-708 (2009).</li><li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28A+Is+a+Suppressor+of+ER-Associated+Translation+in+Embryonic+Stem+Cells.">LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+roles+for+the+ribosome+biogenesis+factor+Wdr43+in+zebrafish+development.">Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development.</a> PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).</li><li>Wilbert, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28+binds+messenger+RNAs+at+GGAGA+motifs+and+regulates+splicing+factor+abundance.">LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).</li><li>Hunziker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UtpA+and+UtpB+chaperone+nascent+pre-ribosomal+RNA+and+U3+snoRNA+to+initiate+eukaryotic+ribosome+assembly.">UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly.</a> Nature Communications. 7, 12090 (2016).</li><li>Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+vivo+biotinylation+to+study+protein-protein+and+protein-DNA+interactions+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).</li><li>Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+piggyBac+transposon-based+mammalian+cell+expression+system+for+inducible+protein+production.">Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).</li><li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li><li>Aktas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHX9+suppresses+RNA+processing+defects+originating+from+the+Alu+invasion+of+the+human+genome.">DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome.</a> Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).</li><li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Crosslinking+Immunoprecipitation+(eCLIP)+Method+for+Efficient+Identification+of+Protein-bound+RNA+in+Mouse+Testis.">Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).</li></ol>

Aquí presentamos un método CLIP-seq modificado llamado FbioCLIP-seq, aprovechando el sistema de doble etiquetado FLAG-biotina para realizar la purificación en tándem de los complejos de proteína-ARN. El sistema de doble etiquetado FLAG-biotina ha demostrado ser potente en la identificación de las interacciones proteína-proteína y proteína-ADN13,21. Aquí demostramos la alta especificidad y conveniencia de este sistema en la identificación de ...

Los ARN y las proteínas de unión al ARN (RRP) controlan diversos procesos celulares, incluyendo empalme, traducción, biogénesis ribosoma, regulación epigenética y transición del destino celular1,2,3,4,5,6. Los delicados mecanismos de estos procesos dependen de la disposición espacial y temporal única de los ARN y los RRP. Por lo tanto, un paso importante hacia la comprensión de la regulación del ARN a nivel molecular es revelar la información posicional sobre los sitios de unión de los PBP.
Se ha desarrollado una estrategia denominada reticulación e inmunoprecipitación (CLIP-seq) para capturar las interacciones proteína-ARN con la reticulación UV seguida de la inmunoprecipitación de la proteína de interés7. La característica clave de la metodología es la inducción de enlaces cruzados covalentes entre una proteína de unión al ARN y sus moléculas de ARN directamente unidas (dentro de 1o) por irradiación UV8. Las huellas de RBP se pueden determinar mediante la agrupación en clústeres de etiquetas CLIP y las llamadas de pico, que suelen tener una resolución de 30 a 60 nt. Alternativamente, el paso de transcripción inversa de CLIP puede conducir a indels (inserciones o eliminaciones) o sustituciones a los sitios de enlace cruzado, lo que permite la identificación de sitios de unión a proteínas en los ARN con una resolución de un solo nucleótido. Se han desarrollado tuberías como Novoalign y CIMS para el análisis de los resultados de secuenciación de alto rendimiento de CLIP-seq8. También se han propuesto varios métodos CLIP-seq modificados, entre ellos la transenlace y la inmunoprecipitación (iCLIP) con resolución de nucleótidos individuales, CLIP mejorado (eCLIP), irCLIP y fotoactivatable con reticulación y inmunoprecipitación (PAR-CLIP)9,10,11,12.
A pesar del amplio uso de los métodos tradicionales CLIP-seq en el estudio de los PBP, los métodos CLIP tienen varios inconvenientes. En primer lugar, la tediosa electroforesis de gel desnaturalizante y el procedimiento de transferencia de membrana pueden conducir a la pérdida de información y causar una complejidad de secuencia limitada. En segundo lugar, el método CLIP basado en anticuerpos específicos de proteínas puede derribar un complejo proteico en lugar de una sola proteína diana, lo que puede dar lugar a interacciones de ARN proteico-proteína falsos de los RBP copurificados. En tercer lugar, la estrategia basada en anticuerpos requiere una gran cantidad de anticuerpos de alta calidad, lo que hace que la aplicación de estos métodos sea inadecuada para el estudio de los RMP sin anticuerpos de alta calidad disponibles. En cuarto lugar, el método CLIP tradicional requiere ATP radiomarcado para etiquetar los ARN unidos a proteínas.
La alta afinidad de la estreptavidina con las proteínas biotiniladas hace que sea un enfoque muy potente para purificar proteínas específicas o complejos proteicos. La biotinilación eficiente de proteínas que llevan una secuencia de péptidos artificiales por ligasa de biotina birA bacteriana expresada ectópicamente en células de mamíferos hace que sea una estrategia eficiente para realizar la purificación de biotina in vivo13. Desarrollamos un método CLIP-seq modificado llamado FbioCLIP-seq (FLAG-Biotin-mediated Cross-linking and Immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing) using FLAG-biotin tag tandem purification14 (Figura 1). Mediante la purificación en tándem y las estrictas condiciones de lavado, se eliminan casi todos los PBP que interactúan(Figura 2). Las estrictas condiciones de lavado también permiten eludir la transferencia de membranas y SDS-PAGE, que es intensiva en mano de obra y técnicamente difícil. Y al igual que eCLIP e irCLIP, el método FBIoCLIP-seq está libre de isótopos. Saltarse los pasos de funcionamiento y transferencia del gel evita la pérdida de información, mantiene intactas las interacciones proteína-ARN de proteínas y aumenta la complejidad de la biblioteca. Además, la alta eficiencia del sistema de etiquetado hace que sea una buena opción para los PBP sin anticuerpos de alta calidad disponibles.
Aquí proporcionamos una descripción paso a paso del protocolo FBIoCLIP-seq para células de mamíferos. En resumen, las células están reticuladas por UV de 254 nm, seguidas de la lelisis celular y la inmunoprecipitación FLAG (FLAG-IP). A continuación, los complejos de ARN proteico se purifican aún más mediante la captura de afinidad de biotina y los ARN se fragmentan por digestión parcial con MNase. Luego, el ARN unido a proteínas se desfosforila y ligado con un vinculador de 3'. Se añade un enlace de ARN de 5' después de que el ARN se fosforila con PNK y se eluda por la digestión de la proteinasa K. Después de la transcripción inversa, las señales de ARN unidas a proteínas son amplificadas por PCR y purificadas por purificación de gel de agarosa. Dos PBP fueron elegidos para ejemplificar el resultado de FBIoCLIP-seq. LIN28 es una proteína de unión al ARN bien caracterizada implicada en la maduración del microARN, la traducción de proteínas y la reprogramación celular15,16,17. WDR43 es una proteína que contiene dominios WD40 que se cree que coordina la biogénesis ribosoma, la transcripción eucariota y el control de pluripotencia de células madre embrionarias14,18. De acuerdo con los resultados reportados previamente para LIN28 con CLIP-seq, FbioCLIP-seq revela sitios de unión de LIN28 en motivos "GGAG" en el microRNA mir-let7g y mRNAs16,19 (Figura 3). WDR43 FBIoCLIP-seq también identificó la preferencia vinculante de WDR43 con espaciadores transcritos externos de 5' (5'-ETS) de pre-rRNAs20 (Figura 4). Estos resultados validan la fiabilidad del método FBIoCLIP-seq.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td>HL-2000 HybrilLinker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity Purification Beads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>112.06D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOAc</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 x FLAG peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>CIP buffer is in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0247S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M158-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porteinase K</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse trancriptase (SupperScriptIII)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation reagent (Trizol)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1614363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td>PNK buffer is in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligaes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EL0021</td>
			<td>T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td>T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mESC culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (80%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS (15%)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>purified recombinant protein; 10,000 fold dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoside mix (1%)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-008-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcriptome-wide profiling of protein-rna interactions by cross-linking and immunoprecipitation mediated by flag-biotin tandem purification

Las proteínas de unión al ARN y al ARN (RBP) controlan múltiples procesos biológicos. La disposición espacial y temporal de los ARN y los PBP subyace a la delicada regulación de estos procesos. Se ha desarrollado una estrategia llamada CLIP-seq (reticulación e inmunoprecipitación) para capturar interacciones endógenas entre proteínas y ARN con la reticulación UV seguida de inmunoprecipitación. A pesar del amplio uso del método CLIP-seq convencional en el estudio RBP, el método CLIP está limitado por la disponibilidad de anticuerpos de alta calidad, contaminantes potenciales de los PBP copurificados, requisito de manipulación de isótopos y posible pérdida de información durante un procedimiento experimental tedioso. Aquí describimos un método CLIP-seq modificado llamado FbioCLIP-seq usando la purificación en tándem de etiqueta flag-biotina. A través de la purificación en tándem y las condiciones de lavado estrictas, se eliminan casi todas las proteínas de unión al ARN que interactúan. Por lo tanto, los ARN que interactúan indirectamente mediados por estos PBP copurificados también se reducen. Nuestro método FBIoCLIP-seq permite la detección eficiente de ARN directos unidos a proteínas sin procedimientos de transferencia de membrana y SDS-PAGE de una manera libre de anticuerpos sin isótopos y específica de proteínas.

La representación esquemática del procedimiento FBIoCLIP-seq se muestra en la Figura 1. En comparación con la purificación de afinidad de un solo paso mediada por FLAG o extiptavidina, la purificación en tándem FLAG-biotina eliminó casi todas las proteínas copuradas, evitando la contaminación de las interacciones indirectas proteína-ARN (Figura 2). Los resultados representativos de FbioCLIP-seq para LIN28 y WDR43 se muestran en <s...

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Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

Aquí presentamos un protocolo CLIP-seq modificado llamado FbioCLIP-seq con purificación en tándem FLAG-biotina para determinar los objetivos de ARN de proteínas de unión al ARN (RPP) en células de mamíferos.

Perfilado en todo el transcriptoma de las interacciones entre proteínas y ARN por enlace cruzado e inmunoprecipitación mediada por la purificación en tándem FLAG-Biotin

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

Sólo y sólo proteínas de unión controlan múltiples procesos biológicos. Este método FLAG-Biotin CLIP-seq, por lo tanto, para perfilar globalmente la disposición especial y temporal de RNAs y RBP en células de mamíferos. Este método permite la detección eficiente de ARN directos unidos a proteínas sin SDS-PAGE y los procedimientos de transferencia de membrana.En comparación con el CLIP-seq tradicional es libre de isótopos y no requiere anticuerpo específico para proteínas. Comience por enchapar alrededor de 3 millones de células STEM embrionarias de ratón en una placa de 10 centímetros e incubarlas durante la noche. Al día siguiente, retire el medio con un vacío y trate las células con dos mililitros de 0,25% de trippsina EDTA durante dos minutos a temperatura ambiente.Aprieta la tripina con cuatro mililitros de medio MESC fresco, y transfiere las células a un tubo centrífugo de 15 mililitros. Luego, centrifugarlos a 300 veces G durante tres minutos a cuatro grados centígrados y quitar el sobrenadante. Suspenda las células en cuatro mililitros de PBS frío y transfiérelos de vuelta a la placa de 10 centímetros para la reticulación.Radiar las células con una luz UV de 254 nanómetros, luego transferir las células reticuladas a un tubo de 15 mililitros. Gire hacia abajo estas células a 300 veces G durante tres minutos a cuatro grados celsius, luego retire el sobrenadante ylyse las células con 500 microlitros de búfer A preparados de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Transfiera las células a un tubo de 1,5 mililitros libre de RNAse, e incubarlas a cuatro grados Celsius con rotación suave durante 30 a 60 minutos.Tratar el liso con 30 microlitros de DNAse 1 a 37 grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, detenga la reacción añadiendo cuatro microlitros de 0,5 molares EDTA. Gire hacia abajo el pellet insoluble centrifugando a 12.000 veces G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados, y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo precalentado de 1,5 mililitros.Transfiera el izado celular a cuentas FLAG preequilibadas, e incuba la muestra a cuatro grados centígrados mientras gira durante dos a cuatro horas. Después de la incubación, centrifugar las perlas durante dos minutos a 3000 veces G y retire el sobrenadante. Añadir 500 microlitros de Buffer A a la muestra, e incubar a 4 grados Celsius durante cinco minutos, luego girar hacia abajo las cuentas y quitar el sobrenadante.Repita el lavado con Buffer A, seguido de dos lavados con Tampón precaleado B.To eluido con un péptido FLAG X, prepare la solución de elución como se describe en el manuscrito de texto y gire hacia abajo las cuentas FLAG. Retire el sobrenadante con una punta de pipeta de extremo estrecho y agregue 200 microlitros de la solución de tres laución X FLAG a cada muestra. Incubar las muestras durante 30 minutos a cuatro grados centígrados con rotación suave.A continuación, gire hacia abajo las cuentas durante dos minutos a 3000 veces G.Transferir el supernado a un tubo fresco y repetir la elución dos veces. Ahorre el 5% de los eluyentes para el análisis de manchas occidentales o la tinción de plata para comprobar la eficiencia de la inmunoprecipitación FLAG. Transfiera los eluyentes tirados a las cuentas de estreptavidina preparadas y gire suavemente las muestras a cuatro grados centígrados durante una a tres horas o durante la noche.A continuación, recoger las perlas en un soporte magnético y quitar el sobrenadante. Lave las perlas dos veces con 500 microlitros de Tampón C con rotación suave durante cinco minutos por lavado. A continuación, lave las perlas dos veces con 500 microlitros de Buffer D, y dos veces con 500 microlitros de tampón PNK helado, recogiendo las perlas en el soporte magnético y quitando el sobrenadante entre lavados.Para realizar la digestión parcial del ARN, añada 100 microlitros de solución de MNA a cada muestra y el vórtice se ajuste a 37 grados Centígrados con un mezclador térmico durante 10 minutos. Recoger las perlas con un soporte magnético durante 30 segundos y quitar el sobrenadante. A continuación, lávelos con el búfer PNK-EDTA, el búfer Tampón C y el búfer PNK según las instrucciones del manuscrito.Recoger las perlas con el soporte magnético y quitar el tampón. A continuación, agregue la mezcla de reacción CIP y el vórtice las perlas a 37 grados Celsius con un mezclador térmico durante 10 minutos. Lave rápidamente las cuentas dos veces con 500 microlitros de tampón PNK EDTA helado, seguidos de dos lavados con 500 microlitros de tampón PNK helado.Después de los lavados, agregue 40 microlitros de tres mezclas de ligadura de enlace principal a las perlas, y vórtice a 16 grados Celsius con un mezclador térmico durante tres horas o durante la noche. La ligadura eficiente del vinculador a los aliados es fundamental para este experimento. Compruebe el tubo de reacción ocasionalmente para asegurarse de que estos no se precipitan durante la ligadura.Después de la incubación, repita los lavados con tampones PNK EDTA y PNK, agregue 40 microlitros de PNK mezclados a las perlas, y vórquelos a 37 grados Celsius con el mezclador térmico durante 10 minutos. Lave las cuentas con los búferes PNK EDTA y PNK y, a continuación, proceda con el aislamiento de ARN como se describe en el manuscrito de texto. En comparación con la purificación de afinidad por un paso mediada por FLAG o streptavidina, la purificación en tándem FLAG-Biotin eliminó casi todas las proteínas purificadas principales, evitando la contaminación de las interacciones indirectas del ARN proteico.LIN28 y WDR43, Fbio CLIP-seq se realizó utilizando células STEM embrionarias de ratón. En total, se recuperaron alrededor de 7,7 millones y 2,2 millones de lecturas únicas para LIN28 y WDR43 respectivamente. La comparación de las vistas de pista muestra diferentes patrones de encuadernación en el locus de RN45 pre-rRNA.Los sitios reticulados en el motivo GGA G de ARN pre-let7-g de LIN28, Fbio CLIP-seq o identificados. Además, se determinaron motivos de ARN enriquecido en los sitios de unión y el porcentaje de nucleótidos mutados en diferentes tipos de mutaciones. Mostrando que LIN28 prefiere unirse al nucleótido genético.Bueno, a las 10:00 PM, este protocolo, es importante confirmar la eficiencia de la inmunoprecipitación para asegurarse de que los complejos de proteínas sólo se purificaron con éxito.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Análisis del promotor de ligandos c-KIT usando inmunoprecipitación de cromatina

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Investigación

Genética

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Investigación de la síntesis de RNA utilizando 5-Bromouridine etiquetado e inmunoprecipitación

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Promotor captura Hola-C: Perfiles de alta resolución, genoma de interacciones promotor

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Inmunoprecipitación de cromatina del tejido adiposo marrón murino

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Variable-número Tándel-repetir Análisis de la Bacteria Patógena de Peces Yersinia ruckeri por Multiplex PCR y Electroforesis Capilar

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Edición génica precisa mediada por Ribonucleoproteína por electroporación de tubo

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Un ensayo para cuantificar la unión de proteínas y ARN en bacterias

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identificación de Huellas de ARN:Complejos proteicos a través de la inmunoprecipitación de ARN en tándem seguido de secuenciación (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transformando, Edición del Genoma y Fenotipando el árbol tropical de cannabaceae de fijación de nitrógeno Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...