Name: transcriptome-wide profiling of protein-rna interactions by cross-linking and immunoprecipitation mediated by flag-biotin tandem purification
Uploaded: 2020-05-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification at JoVE.com

Bidragsstöd är från Kinas nationella grundforskningsprogram (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), National Natural Science Foundation of China (31630095) och Center for Life Sciences vid Tsinghua University.

1. Celllinjekonstruktion
<ol><li>Klona genen av intresse in i en PiggyBac vektor pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA av intresse]-(Hygromycin-resistent) plasmid som bär en FLAGGA-biotin epitope13,21 att uttrycka en FLAGGA-biotin tag smält RBP (FBRBP).</li>
	<li>Cotransfect FBRBP uttrycker vektor med pBase vektorn i en cellinje som uttrycker BirA-enzymet22. OBS: I denna studie, FBRBP genen var transfected till m...

<ol>
	<li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates.">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li><li>Guallar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-dependent+chromatin+targeting+of+TET2+for+endogenous+retrovirus+control+in+pluripotent+stem+cells.">RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells.</a> Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).</li><li>Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Maps+of+ProQ+Binding+In+Vivo+Reveal+Target+Recognition+via+RNA+Structure+and+Stability+Control+at+mRNA+3'+Ends.">Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends.</a> Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).</li><li>Wei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBFox2+Binds+Nascent+RNA+to+Globally+Regulate+Polycomb+Complex+2+Targeting+in+Mammalian+Genomes.">RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes.</a> Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PARP-1+by+snoRNAs+Controls+Ribosome+Biogenesis+and+Cell+Growth+via+the+RNA+Helicase+DDX21.">Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).</li><li>Yao, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+Pre-rRNA+Sorting+via+Phase+Separation+Drives+the+Assembly+of+Dense+Fibrillar+Components+in+the+Human+Nucleolus.">Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus.</a> Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).</li><li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing.">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li><li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Argonaute+and+conventional+RNA-binding+protein+interactions+with+RNA+at+single-nucleotide+resolution+using+HITS-CLIP+and+CIMS+analysis.">Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).</li><li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=irCLIP+platform+for+efficient+characterization+of+protein-RNA+interactions.">irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions.</a> Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).</li><li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+(eCLIP).">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins.">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).</li><li>de Boer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li><li>Bi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Targets+Ribogenesis+Factor+WDR43+to+Chromatin+for+Transcription+and+Pluripotency+Control.">RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control.</a> Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).</li><li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT4+in+concert+with+Lin28+suppresses+microRNA+biogenesis+through+pre-microRNA+uridylation.">TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation.</a> Cell. 138 (4), 696-708 (2009).</li><li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28A+Is+a+Suppressor+of+ER-Associated+Translation+in+Embryonic+Stem+Cells.">LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+roles+for+the+ribosome+biogenesis+factor+Wdr43+in+zebrafish+development.">Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development.</a> PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).</li><li>Wilbert, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28+binds+messenger+RNAs+at+GGAGA+motifs+and+regulates+splicing+factor+abundance.">LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).</li><li>Hunziker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UtpA+and+UtpB+chaperone+nascent+pre-ribosomal+RNA+and+U3+snoRNA+to+initiate+eukaryotic+ribosome+assembly.">UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly.</a> Nature Communications. 7, 12090 (2016).</li><li>Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+vivo+biotinylation+to+study+protein-protein+and+protein-DNA+interactions+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).</li><li>Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+piggyBac+transposon-based+mammalian+cell+expression+system+for+inducible+protein+production.">Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).</li><li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li><li>Aktas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHX9+suppresses+RNA+processing+defects+originating+from+the+Alu+invasion+of+the+human+genome.">DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome.</a> Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).</li><li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Crosslinking+Immunoprecipitation+(eCLIP)+Method+for+Efficient+Identification+of+Protein-bound+RNA+in+Mouse+Testis.">Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).</li></ol>

Här introducerar vi en modifierad CLIP-seq metod som kallas FBIOCLIP-seq, dra nytta av FLAG-biotin dubbelmärkning system för att utföra tandem rening av protein-RNA-komplex. Den FLAG-biotin dubbelmärkning systemet har visat sig vara kraftfull i att identifiera protein-protein och protein-DNA interaktioner13,21. Här visar vi den höga specificiteten och bekvämligheten i detta system för att identifiera RNA interagerar med proteiner. Genom tandem...

RNAs och RNA-bindande proteiner (RBPs) styra olika cellulära processer inklusive splitsning, översättning, ribosomen biogenes, epigenetisk reglering, och cell öde övergång1,2,3,4,5,6. De känsliga mekanismerna i dessa processer är beroende av den unika rumsliga och tidsmässiga arrangemang av RNA och RBPs. Därför är ett viktigt steg mot att förstå RNA-reglering på molekylär nivå att avslöja positionsinformationen om rbps bindningsställen.
En strategi som benämns som tvärbindning och immunoprecipitation (CLIP-seq) har utvecklats för att fånga upp protein-RNA-interaktioner med UV-tvärbindning följt av immunoprecipitation av det protein av intresse7. Det centrala inslaget i metodiken är induktion av kovalenta tvärbindningar mellan ett RNA-bindande protein och dess direktbundna RNA-molekyler (inom ~1 Å) genom UV-bestrålning8. RBP-fotavtrycken kan bestämmas av CLIP-taggen klustring och toppanrop, som vanligtvis har en upplösning på 30−60 nt. Alternativt kan clipets omvända transkriptionssteg leda till indels (infogningar eller borttagningar) eller substitutioner till tvärbindningsställena, vilket möjliggör identifiering av proteinbindningsställen på RNA vid en enda nukleotidupplösning. Pipelines som Novoalign och CIMS har utvecklats för analys av hög genomströmning sekvensering resultaten av CLIP-seq8. Flera modifierade CLIP-seq metoder har också föreslagits, inklusive individ-nukleotid upplösning tvärbindning och immunoprecipitation (iCLIP), förstärkt CLIP (eCLIP), irCLIP, och fotoaktiv ribonucleoside-förstärkt korslänkning och immunoprecipitation (PAR-CLIP)9,10,11,12.
Trots den breda användningen av traditionella CLIP-seq-metoder i studiet av RBPs har CLIP-metoderna flera nackdelar. Först, den tråkiga denaturerade gelen elektrofores och membran överföring förfarandet kan leda till förlust av information, och orsaka begränsad sekvens komplexitet. För det andra kan den proteinspecifika antikroppsbaserade CLIP-metoden dra ner ett proteinkomplex istället för ett enda målprotein, vilket kan leda till falska positiva protein-RNA-interaktioner från de copurified RBPs. För det tredje kräver den antikroppsbaserade strategin en stor mängd antikroppar av hög kvalitet, vilket gör tillämpningen av dessa metoder otillräcklig för studier av RBPs utan antikroppar av hög kvalitet tillgängliga. För det fjärde kräver den traditionella CLIP-metoden radiolabeled ATP för att märka de proteinbundna RNA.
Den höga affiniteten hos streptavidin till biotinylerade proteiner gör det till en mycket kraftfull metod för att rena specifika proteiner eller proteinkomplex. Den effektiva biotinylationen av proteiner som bär på en artificiell peptidsekvens genom ektopiskt uttryckt bakteriell BirA biotin ligase i däggdjursceller gör det till en effektiv strategi att utföra biotinrening in vivo13. Vi utvecklade en modifierad CLIP-seq metod som kallas FbioCLIP-seq (FLAG-Biotin-medierad Cross-linking och jagmmunoprecipitation följt av hög-genomströmning sekvensering) med hjälp av FLAG-biotin tag rening tandem14 (Figur 1). Genom tandemrening och stränga tvättförhållanden avlägsnas nästan alla samverkande RBPs (Bild 2). De stränga tvättförhållandena möjliggör också kringgå SDS-PAGE och membranöverföring, som är arbetsintensiv och tekniskt utmanande. Och liknar eCLIP och irCLIP, fbioCLIP-seq metoden är isotop-fri. Hoppa över gelen igång och överföring steg undviker förlust av information, håller autentiska protein-RNA interaktioner intakt, och ökar biblioteket komplexitet. Dessutom gör den höga effektiviteten i taggningssystemet det till ett bra val för RBPs utan högkvalitativa antikroppar tillgängliga.
Här ger vi en steg-för-steg-beskrivning av fbioCLIP-seq-protokollet för däggdjursceller. Kortfattat, celler är tvärbunden av 254 nm UV, följt av cell lys och FLAG immunoprecipitation (FLAG-IP). Därefter är protein-RNA-komplexen ytterligare renade av biotinaffinning och RNAs fragmenteras genom partiell matsmältning med MNase. Sedan är det proteinbundna RNA defosforylerat och ligerat med en 3'-länkare. En 5' RNA-linker tillsätts efter att RNA är fosforylerat med PNK och eluteras av proteinas K matsmältning. Efter omvänd transkription förstärks de proteinbundna RNA-signalerna av PCR och renas genom agarosgelrening. Två RBPs valdes för att exemplifiera fbioCLIP-seq resultatet. LIN28 är ett väl karakteriserat RNA-bindande protein som är involverat i mikroRNA-mognad, proteinöversättning, och cellomprogrammering15,16,17. WDR43 är en WD40 domän-innehållande protein tänkte att samordna ribosomen biogenes, eukaryota transkription, och embryonala stamceller pluripotency kontroll14,18. Överensstämmer med tidigare rapporterade resultat för LIN28 med CLIP-seq, fbioCLIP-seq avslöjar bindande platser av LIN28 på "GGAG" motiv i microRNA mir-let7g och mRNAs16,19 (Figur 3). WDR43 FbioCLIP-seq identifierade också bindande preferens för WDR43 med 5' externa transkriberade distanser (5'-ETS) av pre-rRNAs20 (Figur 4). Dessa resultat validerar tillförlitligheten hos metoden fbioCLIP-seq.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td>HL-2000 HybrilLinker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity Purification Beads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>112.06D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOAc</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 x FLAG peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>CIP buffer is in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0247S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M158-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porteinase K</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse trancriptase (SupperScriptIII)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation reagent (Trizol)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1614363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td>PNK buffer is in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligaes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EL0021</td>
			<td>T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td>T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mESC culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (80%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS (15%)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>purified recombinant protein; 10,000 fold dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoside mix (1%)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-008-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcriptome-wide profiling of protein-rna interactions by cross-linking and immunoprecipitation mediated by flag-biotin tandem purification

RNA och RNA-bindande proteiner (RBPs) kontrollerar flera biologiska processer. Den rumsliga och tidsmässiga arrangemang av RNA och RBPs ligger till grund för den känsliga regleringen av dessa processer. En strategi som kallas CLIP-seq (tvärbindning och immunoprecipitation) har utvecklats för att fånga endogena protein-RNA interaktioner med UV-tvärbindning följt av immunoprecipitation. Trots den breda användningen av konventionella CLIP-seq metod i RBP studie, clip-metoden begränsas av tillgången till högkvalitativa antikroppar, potentiella föroreningar från den copurified RBPs, krav på isotop manipulation och potentiella förlust av information under en långtråkig experimentell förfarande. Här beskriver vi en modifierad CLIP-seq metod som kallas FBIOCLIP-seq med hjälp av FLAG-biotin tag tandem rening. Genom tandemrening och stränga tvättförhållanden avlägsnas nästan alla samverkande RNA-bindande proteiner. Således minskas de RNA som interagerar indirekt av dessa copurified rbps också. Vår FBIOCLIP-seq metod möjliggör effektiv detektion av direkt protein-bundna RNAs utan SDS-PAGE och membran överföring förfaranden i en isotop-fri och protein-specifika antikroppsfritt sätt.

Den schematiska representationen av proceduren fbioCLIP-seq visas i figur 1. Jämfört med FLAG-medierad eller streptavidin-medierad enstegs affinitet rening, FLAG-biotin tandem rening bort nästan alla de copurified proteiner, undvika kontaminering av indirekt protein-RNA interaktioner (Figur 2). Representativa resultat för FbioCLIP-seq för LIN28 och WDR43 avbildas i figur 3 och figur 4<...

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification at JoVE.com

Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

Här presenterar vi en modifierad CLIP-seq protokoll som kallas FBIOCLIP-seq med FLAG-biotin tandem rening för att fastställa RNA-mål för RNA-bindande proteiner (RBPs) i däggdjursceller.

Transkriptom-Wide Profilering av protein-RNA interaktioner genom cross-linking och immunoprecipitation medierad av FLAG-Biotin Tandem Rening

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

Endast och endast bindande proteiner styr flera biologiska processer. Denna FLAG-Biotin CLIP-seq metod, därav att globalt profil den särskilda och den tidsmässiga arrangemang av RNAs och RBPs i däggdjursceller. Denna metod möjliggör effektiv detektion av direkt proteinbundna RNAs utan SDS-PAGE och procedurerna membranöverföring.Jämfört med traditionella CLIP-seq är isotop fri och det kräver inte protein specifik antikropp. Börja med att plätera cirka 3 miljoner mus embryonala STAMCELLER i en 10 centimeter plattan och inkubera dem över natten. Nästa dag tar du bort mediet med ett vakuum och behandlar cellerna med två milliliter på 0,25%trypsin EDTA i två minuter vid rumstemperatur.Släck trypsin med fyra milliliter färskt MESC medium, och överföra cellerna till en 15 milliliter centrifugrör. Sedan centrifug dem på 300 gånger G i tre minuter vid fyra grader Celsius och ta bort supernatant. Häng upp cellerna i fyra milliliter av kall PBS och överföra dem tillbaka till 10 centimeter plattan för korslänkning.Utstråla cellerna med en 254 nanometer UV-ljus, sedan överföra korslänkade celler till en 15 milliliter rör. Snurra ner dessa celler vid 300 gånger G i tre minuter vid fyra grader Celsius, ta sedan bort supernatanten och lysa cellerna med 500 mikroliter buffert A som utarbetats enligt manuskriptriktningar. Överför cellerna till ett RNAsfritt 1,5 milliliterrör, och inkubera dem i fyra grader Celsius med skonsam rotation i 30 till 60 minuter.Behandla lysate med 30 mikroliter av DNAse 1 vid 37 grader Celsius i 10 minuter. Sedan, stoppa reaktionen genom att lägga till fyra mikroliter av 0,5 molar EDTA. Snurra ner den olösliga pelleten genom att centrifugera vid 12, 000 gånger G i 20 minuter vid fyra grader Celsius, och överför supernatanten till ett nytt färdigkylt 1,5 milliliterrör.Överför cellen lysate till pre equilibrated FLAG pärlor, och inkubera provet på fyra grader Celsius medan roterande i två till fyra timmar. Efter inkubationen centrifugerar pärlorna i två minuter vid 3000 gånger G och avlägsna supernatanten. Tillsätt 500 mikroliter buffert A till provet, och inkuberas vid 4 grader Celsius i fem minuter, snurra sedan ner pärlorna och ta bort supernatanten.Upprepa tvätten med BufferT A, följt av två tvättar med pre kyld Buffer B.To elute med en tre X FLAG-peptid, preparera elueringslösningen enligt beskrivningen i textmanuskriptet och snurra ner FLAG-pärlorna. Ta bort supernatanten med en smal ändpipettsspets och tillsätt 200 mikroliter av den tre X FLAG-elueringslösningen till varje prov. Inkubera proverna i 30 minuter vid fyra grader Celsius med varsam rotation.Snurra sedan ner pärlorna i två minuter vid 3000 gånger G.Transfer supernate till ett nytt rör och upprepa elueringen två gånger. Spara 5%av eluents för Western blot analys eller silver färgning för att kontrollera effektiviteten i FLAG immunprecipitation. Överför de dragna eluenterna till förberedda streptavidinpärlor och rotera proverna försiktigt vid fyra grader Celsius i en till tre timmar eller över natten.Samla sedan pärlorna på ett magnetiskt stativ och ta bort supernatanten. Tvätta pärlorna två gånger med 500 mikroliter av BufferT C med skonsam rotation i fem minuter per tvätt. Därefter tvätta pärlorna två gånger med 500 mikroliter av Buffer D, och två gånger med 500 mikroliter av iskall PNK buffert, samla pärlorna på magnetstativ och ta bort supernatanten mellan tvättarna.För att utföra partiell RNA-matsmältning, tillsätt 100 mikroliter MNA-lösning till varje prov och virvel inställd på 37 grader Celsius med en termisk mixer i 10 minuter. Samla in pärlorna med ett magnetiskt stativ i 30 sekunder och ta bort supernatanten. Sedan, tvätta dem med PNK-EDTA buffert, Buffer C, och PNK buffert enligt manuskriptet riktningar.Samla in pärlorna med magnetstativ och ta bort bufferten. Tillsätt sedan CIP-reaktionsmixen och virvel pärlorna vid 37 grader Celsius med en termisk mixer i 10 minuter. Tvätta snabbt pärlorna två gånger med 500 mikroliter av iskall PNK EDTA buffert, följt av två tvättar med 500 mikroliter av iskall PNK buffert.Efter tvättarna, tillsätt 40 mikroliter av tre främsta länkare liger mix till pärlorna, och virvel dem på 16 grader Celsius med en termisk mixer i tre timmar eller över natten. Effektiv ligering av länkaren till de allierade är avgörande för detta experiment. Kontrollera reaktionsröret emellanåt för att se till att dessa inte fälls ut under ligering.Efter inkubationen, upprepa tvättarna med PNK EDTA och PNK buffertar, tillsätt 40 mikroliter PNK blandas till pärlorna, och virvel dem på 37 grader Celsius med termisk blandaren i 10 minuter. Tvätta pärlorna med PNK EDTA- och PNK-buffertar, fortsätt sedan med RNA-isolering enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Jämfört med FLAG-medierad eller streptavidin medierad ett steg affinitet rening, FLAG-Biotin tandem rening bort nästan alla kärnan renas proteiner, undvika kontaminering av indirekt protein RNA interaktioner.LIN28 och WDR43, fbio CLIP-seq utfördes med hjälp av musen embryonala STEM-celler. Totalt hämtades cirka 7,7 miljoner och 2,2 miljoner unika läsningar för LIN28 respektive WDR43. Jämförelse av spårvyerna visar olika bindningsmönster i RN45 pre-rRNA locus.De korslänkade platserna på GGA G-motivet av pre-let7-g RNA av LIN28, Fbio CLIP-seq eller identifierad. Vidare fastställdes anrikat RNA-motiv i bindningsställena, och andelen muterade nukleotider i olika typer av mutationer. Visar att LIN28 föredrar att binda till gennukleotiden.Tja, vid 10:00 PM, detta protokoll, är det viktigt att bekräfta effektiviteten i immunoprecipitation för att se till att proteinet bara komplex renades framgångsrikt.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Analys av c-KIT-ligand-promotorn med användning av kromatinimmunfällning

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Utredning av RNA-syntes med 5-Bromouridine märkning och Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Arrangören Capture-C: Högupplösta, Genome-wide profilering av promotorn interaktioner

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Kromatin Immunoprecipitation av murina Brun fettvävnad

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-Locus variabel-antal tandem-upprepa analys av den fisk-patogena bakterien yersinia ruckeri av MULTIPLEX PCR och kapillärelektrofores

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-medierad exakt gen redigering av Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Ett test för att kvantifiera protein-RNA-bindning i bakterier

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identifiering av spår av RNA: protein komplex via RNA immunoprecipitation i tandem följt av sekvensering (RIPiT-SEQ)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transformering, genom-redigering och fenotypning av kvävefixerande tropiska Cannabaceae träd Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...