Name: transcriptome-wide profiling of protein-rna interactions by cross-linking and immunoprecipitation mediated by flag-biotin tandem purification
Uploaded: 2020-05-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification at JoVE.com

Hibe desteği Çin Ulusal Temel Araştırma Programı (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31630095) ve Tsinghua Üniversitesi Yaşam Bilimleri Merkezi'nden destek almaktadır.

1. Hücre hattı yapımı
<ol><li>Bir PiggyBac vektör pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA ilgi]-(Hygromycin-dirençli) plazmid içine ilgi gen klon bir FLAG-biotin epitop13taşıyan,21 bir FLAG-biotin etiketi rbp erimiş ifade etmek(FBRBP).</li>
	<li>BirA enzimini ifade eden bir hücre hattına pBase vektörü ile vektörü ifade eden FBRBP'yi Cotransfect22. NOT: Bu çalışmada, FBRBP geni entegre bir BirA eksp...

<ol>
	<li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates.">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li><li>Guallar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-dependent+chromatin+targeting+of+TET2+for+endogenous+retrovirus+control+in+pluripotent+stem+cells.">RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells.</a> Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).</li><li>Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Maps+of+ProQ+Binding+In+Vivo+Reveal+Target+Recognition+via+RNA+Structure+and+Stability+Control+at+mRNA+3'+Ends.">Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends.</a> Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).</li><li>Wei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBFox2+Binds+Nascent+RNA+to+Globally+Regulate+Polycomb+Complex+2+Targeting+in+Mammalian+Genomes.">RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes.</a> Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PARP-1+by+snoRNAs+Controls+Ribosome+Biogenesis+and+Cell+Growth+via+the+RNA+Helicase+DDX21.">Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).</li><li>Yao, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+Pre-rRNA+Sorting+via+Phase+Separation+Drives+the+Assembly+of+Dense+Fibrillar+Components+in+the+Human+Nucleolus.">Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus.</a> Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).</li><li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing.">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li><li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Argonaute+and+conventional+RNA-binding+protein+interactions+with+RNA+at+single-nucleotide+resolution+using+HITS-CLIP+and+CIMS+analysis.">Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).</li><li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=irCLIP+platform+for+efficient+characterization+of+protein-RNA+interactions.">irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions.</a> Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).</li><li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+(eCLIP).">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins.">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).</li><li>de Boer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li><li>Bi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Targets+Ribogenesis+Factor+WDR43+to+Chromatin+for+Transcription+and+Pluripotency+Control.">RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control.</a> Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).</li><li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT4+in+concert+with+Lin28+suppresses+microRNA+biogenesis+through+pre-microRNA+uridylation.">TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation.</a> Cell. 138 (4), 696-708 (2009).</li><li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28A+Is+a+Suppressor+of+ER-Associated+Translation+in+Embryonic+Stem+Cells.">LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+roles+for+the+ribosome+biogenesis+factor+Wdr43+in+zebrafish+development.">Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development.</a> PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).</li><li>Wilbert, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28+binds+messenger+RNAs+at+GGAGA+motifs+and+regulates+splicing+factor+abundance.">LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).</li><li>Hunziker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UtpA+and+UtpB+chaperone+nascent+pre-ribosomal+RNA+and+U3+snoRNA+to+initiate+eukaryotic+ribosome+assembly.">UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly.</a> Nature Communications. 7, 12090 (2016).</li><li>Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+vivo+biotinylation+to+study+protein-protein+and+protein-DNA+interactions+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).</li><li>Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+piggyBac+transposon-based+mammalian+cell+expression+system+for+inducible+protein+production.">Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).</li><li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li><li>Aktas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHX9+suppresses+RNA+processing+defects+originating+from+the+Alu+invasion+of+the+human+genome.">DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome.</a> Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).</li><li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Crosslinking+Immunoprecipitation+(eCLIP)+Method+for+Efficient+Identification+of+Protein-bound+RNA+in+Mouse+Testis.">Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).</li></ol>

Burada, protein-RNA komplekslerinin tandem arınmasını gerçekleştirmek için FLAG-biotin çift etiketleme sisteminden yararlanarak FbioCLIP-seq adı verilen değiştirilmiş bir CLIP-seq yöntemini tanıtıyoruz. FLAG-biotin çift etiketleme sistemi protein-protein ve protein-DNA etkileşimleri13,21belirlenmesinde güçlü olduğu gösterilmiştir. Burada, bu sistemin proteinlerle etkileşime girerken RNA'ları tanımlamada yüksek özgüllüğün?...

RNA ve RNA bağlayıcı proteinler (RRB' ler) birleştirme, çeviri, ribozom biyogenez, epigenetik regülasyon ve hücre kaderi geçişi1,2,3,4,5,6gibi çeşitli hücresel süreçleri kontrol eder. Bu süreçlerin hassas mekanizmaları RNA'ların ve RRB'lerin eşsiz mekansal ve zamansal düzenlemesine bağlıdır. Bu nedenle, rna regülasyonunu moleküler düzeyde anlama yolunda önemli bir adım, RP'lerin bağlayıcı bölgeleri hakkındaki konumsal bilgileri ortaya çıkarmaktır.
Bir strateji çapraz bağlama ve immünoprepitasyon olarak anılacaktır (CLIP-seq)uvçapraz bağlantı ile protein-RNA etkileşimleri yakalamak için geliştirilmiştir ilgi protein immünopreside ani 7. Metodolojinin en önemli özelliği, Bir RNA bağlayıcı protein ve doğrudan bağlı RNA molekülleri arasında kovalent çapraz bağlantıların indüksiyonudur (~ 1 şiçinde) UV ışınlama8. RBP ayak izleri, genellikle 30−60 nt çözünürlüğe sahip CLIP etiket kümeleme ve tepe arama ile belirlenebilir. Alternatif olarak, CLIP'in ters transkripsiyon adımı, tek nükleotid çözünürlükte RNA'larda protein bağlama sitelerinin tanımlanmasına olanak tanıyan çapraz bağlama sitelerine indels (eklemeler veya silmeler) veya ikamelere yol açabilir. Novoalign ve CIMS gibi boru hatları CLIP-seq8yüksek iş bölümü sekanslama sonuçlarının analizi için geliştirilmiştir. Çeşitli modifiye CLIP-seq yöntemleri de önerilmiştir, bireysel nükleotit çözünürlük çapraz bağlama ve immünoprepitasyon dahil (iCLIP), gelişmiş CLIP (eCLIP), irCLIP, ve fotoaktipabl ribonükleoside gelişmiş çapraz bağlama ve immünopredi (PAR-CLIP)9,10,11,12.
RRB'lerin çalışmasında geleneksel CLIP-seq yöntemlerinin yaygın kullanımına rağmen, CLIP yöntemlerinin çeşitli dezavantajları vardır. İlk olarak, sıkıcı denatüre jel elektroforez ve membran transferi prosedürü bilgi kaybına yol açabilir, ve sınırlı dizi karmaşıklığına neden. İkinci olarak, proteine özgü antikor bazlı CLIP yöntemi tek bir hedef protein yerine bir protein kompleksini aşağı çekebilir, bu da saflaştırılmış RP'lerden yanlış pozitif protein-RNA etkileşimlerine yol açabilir. Dördüncü olarak, geleneksel CLIP yöntemi proteine bağlı RNA'ları etiketlemek için radiolabeled ATP gerektirir.
Streptavidin biyotinylated proteinlere yüksek yakınlık belirli proteinler veya protein kompleksleri arındırmak için çok güçlü bir yaklaşım yapar. Memeli hücrelerinde ektonik olarak ifade edilen bakteriyel BirA biotin ligaz ile yapay peptit dizilimini taşıyan proteinlerin verimli biyotinylation vivo biotin arıtma gerçekleştirmek için etkili bir strateji yapar13. Biz modifiye CLIP-seq yöntemi FbioCLIP-seq (FLAG-Biotin aracılı Cross-lmürekkep ve benmmuno p recipitation yüksek iş itme takip) FLAG-biotin etiket tandem arıtma14 kullanarak geliştirdi (Şekil 1). Tandem arınma ve sıkı yıkama koşulları sayesinde, hemen hemen tüm etkileşen RRB'ler çıkarılır (Şekil 2). Sıkı yıkama koşulları, emek yoğun ve teknik açıdan zorlu olan SDS-PAGE ve membran transferinin de atlatılmasına olanak sağlar. Ve eCLIP ve irCLIP benzer, FbioCLIP-seq yöntemi izotop-free. Jel çalışan ve transfer adımları atlayarak bilgi kaybını önler, otantik protein-RNA etkileşimleri bozulmadan tutar ve kütüphane karmaşıklığını artırır. Ayrıca, etiketleme sisteminin yüksek verimlilik yüksek kaliteli antikorlar mevcut olmadan RbPs için iyi bir seçim yapar.
Burada memeli hücreleri için FbioCLIP-seq protokolü adım adım açıklamasını salıyoruz. Kısaca, hücreler çapraz bağlı 254 nm UV, hücre lysis ve FLAG immünopresipitasyon takip (FLAG-IP). Daha sonra, protein-RNA kompleksleri biotin afinite yakalama ile daha da saflaştırılır ve RNA'lar MNase ile kısmi sindirim ile parçalanır. Daha sonra proteine bağlı RNA fosforilasyona ve 3' linker ile bağlanır. RNA PNK ile fosforlandırıldıktan ve proteinaz K sindirimi ile eluted sonra 5' RNA bağlayıcı eklenir. Ters transkripsiyondan sonra, proteine bağlı RNA sinyalleri PCR ile yükseltilir ve agarose jel saflaştırma ile saflaştırılır. Fbio CLIP-seq sonucunu örneklemek için iki RRB seçildi. LIN28 mikroRNA olgunlaşma, protein çevirisi ve hücre yeniden programlama15,16,17dahil iyi karakterize RNA bağlayıcı proteindir. WDR43 ribozom biyogenez, ökaryotik transkripsiyon ve embriyonik kök hücre pluripotency kontrol koordine etmek için düşünülen bir WD40 etki alanı içeren protein14,18. CLIP-seq ile LIN28 için daha önce bildirilen sonuçlarla tutarlı olarak, FbioCLIP-seq mikroRNA mir-let7g ve mRNA'larda "GGAG" motifleri üzerinde LIN28'in bağlayıcı alanlarını ortaya çıkarır16,19 (Şekil 3). WDR43 FbioCLIP-seq ayrıca WDR43'ün bağlayıcı tercihini 5' harici transkripsiyonlu spacers (5'-ETS) öncesi rRNA'lar20 (Şekil 4)ile belirlemİştir. Bu sonuçlar FbioCLIP-seq yönteminin güvenilirliğini doğrular.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td>HL-2000 HybrilLinker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity Purification Beads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>112.06D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M NaOAc</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 x FLAG peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>CIP buffer is in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0247S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M158-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porteinase K</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse trancriptase (SupperScriptIII)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation reagent (Trizol)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1614363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td>PNK buffer is in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligaes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EL0021</td>
			<td>T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td>T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mESC culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (80%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS (15%)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>purified recombinant protein; 10,000 fold dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoside mix (1%)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-008-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcriptome-wide profiling of protein-rna interactions by cross-linking and immunoprecipitation mediated by flag-biotin tandem purification

RNA ve RNA bağlayıcı proteinler (RRB' ler) birden fazla biyolojik işlemi kontrol eder. RNA'ların ve RRB'lerin mekansal ve zamansal düzenlemesi bu süreçlerin hassas bir şekilde düzenlenmesinin temelini oluşturur. ENdojen protein-RNA etkileşimlerini UV çapraz bağlanması ve ardından immünoprepitasyon ile yakalamak için CLIP-seq (çapraz bağlama ve immünopredimasyon) adı verilen bir strateji geliştirilmiştir. RBP çalışmasında konvansiyonel CLIP-seq yönteminin yaygın kullanımına rağmen, CLIP yöntemi yüksek kaliteli antikorların bulunabilirliği, saflaştırılmış RP'lerden potansiyel kirleticimaddeler, izotop manipülasyongereksinimi ve sıkıcı bir deneysel işlem sırasında potansiyel bilgi kaybı ile sınırlıdır. Burada FLAG-biotin etiketi tandem arınma kullanarak FbioCLIP-seq adlı değiştirilmiş bir CLIP-seq yöntemi ni tanımlıyoruz. Tandem arınma ve sıkı yıkama koşulları sayesinde, hemen hemen tüm etkileşen RNA bağlayıcı proteinler kaldırılır. Böylece, dolaylı olarak bu copurified RbPs aracılık rna'lar da azalır. FbioCLIP-seq metodumuz, sds-PAGE ve membran transfer prosedürleri olmadan doğrudan proteine bağlı RNA'ların izotopsuz ve proteine özgü antikorsuz bir şekilde etkin bir şekilde algılanmasını sağlar.

FbioCLIP-seq prosedürünün şematik gösterimi Şekil 1'degösterilmiştir. FLAG aracılı veya streptavidin aracılı tek adımlı arınma ile karşılaştırıldığında, FLAG-biotin tandem saflaştırma, dolaylı protein-RNA etkileşimlerinin kontaminasyonunu önleyerek hemen hemen tüm saflaştırılmış proteinleri ortadan kaldırmış(Şekil 2). LIN28 ve WDR43 için FbioCLIP-seq için temsili sonuçlar Şekil ...

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification at JoVE.com

Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

Burada, memeli hücrelerinde RNA bağlayıcı proteinlerin (RRB) RNA hedeflerini belirlemek için FLAG-biotin tandem saflaştırma ile FbioCLIP-seq adı verilen değiştirilmiş bir CLIP-seq protokolü salıyoruz.

Flag-Biotin Tandem Arınma Aracılı Çapraz Bağlama ve İmmünopits Ile Protein-RNA Etkileşimlerinin Transkripsiyon-Geniş Profilleme

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

Sadece ve sadece bağlayıcı proteinler birden fazla biyolojik işlemi kontrol eder. Bu FLAG-Biotin CLIP-seq yöntemi, dolayısıyla küresel memeli hücrelerinde RNA ve RRB'lerin özel ve zamansal düzenleme profilini. Bu yöntem, SDS-PAGE ve membran transfer prosedürleri olmadan doğrudan proteine bağlı RNA'ların etkin bir şekilde algılanmasını sağlar.Geleneksel CLIP-seq ile karşılaştırıldığında izotop içermez ve proteine özgü antikor gerektirmez. Yaklaşık 3 milyon fare embriyonik KÖK hücresini 10 santimetrelik bir plakaya kapayarak ve bir gecede kuluçkaya yatarak başlayın. Ertesi gün, bir vakum ile orta çıkarın ve oda sıcaklığında iki dakika boyunca% 0.25 tripsin EDTA iki mililitre ile hücreleri tedavi.Dört mililitre taze MESC ortamı ile tripsini söndürün ve hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, onları 300 kez G'de dört santigrat derecede üç dakika santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. Hücreleri dört mililitre soğuk PBS'de askıya alın ve çapraz bağlama için 10 santimetrelik plakaya geri aktarın.Hücreleri 254 nanometreLIK UV ışığıyla yayan, sonra çapraz bağlı hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Bu hücreleri 300 kez G'de dört santigrat derecede üç dakika boyunca aşağı çevirin, sonra süpernatant'ı çıkarın ve el yazması talimatlara göre hazırlanan 500 mikrolitre Tampon A ile hücreleri inceleyin. Hücreleri RNAse içermeyen 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 30 ila 60 dakika boyunca hafif bir dönüşle dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın.10 dakika boyunca 37 santigrat derecede 30 mikrolitre DNAse 1 ile lysate tedavi edin. Daha sonra, 0,5 molar EDTA dört mikrolitre ekleyerek reaksiyonu durdurun. Çözünmez peleti 12,000 kez G'yi 4 santigrat derecede 20 dakika santrifüj ederek aşağı doğru çevirin ve süpernatant'ı soğutulmuş 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.Hücre lisatını önceden dengelenmiş BAYRAK boncuklarına aktarın ve numuneyi iki ila dört saat dönerken dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra boncukları 3000 kez G'de iki dakika santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. Örneğe 500 mikrolitre Tampon A ekleyin ve 4 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın, sonra boncukları aşağı çevirin ve süpernatantı çıkarın.Tampon A ile yıkamayı tekrarlayın, ardından önceden soğutulmuş Tampon B.To üç X FLAG peptidile elite, metin el yazmasında açıklandığı gibi elüsülasyon çözeltisini hazırlayın ve FLAG boncuklarını aşağı doğru döndürün. Supernatant'ı dar uçlu pipet ucuyla çıkarın ve her numuneye üç X FLAG elüsyon çözeltisinin 200 mikrolitresini ekleyin. Numuneleri 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca hafif bir dönüşle kuluçkaya yatırın.Sonra 3000 kez G.Transfer yeni bir tüp için boncuk iki dakika aşağı spin ve iki kez elüsyon tekrarlayın. FLAG immünopresipitenjinin verimliliğini kontrol etmek için batı leke analizi veya gümüş boyama için elüentlerin %5'ini kaydedin. Hazırlanan streptavidin boncuklar için çekilen eluents aktarın ve bir ila üç saat veya bir gecede dört derece santigrat hafifçe örnekleri döndürün.Sonra, manyetik bir stand üzerinde boncuk toplamak ve supernatant kaldırın. Boncukları 500 mikrolitre Tampon C ile iki kez yıkayın ve yıkama başına beş dakika hafif bir dönüş le yıkayın. Daha sonra, boncukları 500 mikrolitre Tampon D ile iki kez, 500 mikrolitre buz gibi PNK tamponuyla iki kez yıkayın, manyetik standdaki boncukları toplayıp yıkamalar arasındaki süpernatantı temizler.Kısmi RNA sindirimi gerçekleştirmek için, her numuneye 100 mikrolitre MNA çözeltisi ekleyin ve 10 dakika termal mikserle 37 santigrat derecede ayarlanan girdap. 30 saniye boyunca bir manyetik stand ile boncuk toplamak ve supernatant kaldırın. Daha sonra, el yazması yönergelerine göre PNK-EDTA arabelleği, Arabellek C ve PNK arabelleği ile yıkayın.Manyetik stand ile boncuk toplamak ve tampon kaldırın. Daha sonra, CIP reaksiyon karışımı ekleyin ve 10 dakika boyunca bir termal karıştırıcı ile 37 santigrat derece boncuk girdap. Boncukları 500 mikrolitre buz gibi PNK EDTA tamponuyla iki kez hızlıca yıkayın ve ardından 500 mikrolitre buz gibi PNK tamponu ile iki yıkama yapın.Yıkar sonra, boncuk üç prime linker ligation karışımı 40 mikrolitre ekleyin ve üç saat veya bir gecede bir termal karıştırıcı ile 16 derece santigrat onları girdap. Bağlantının müttefiklere verimli bir şekilde bağlanması bu deney için çok önemlidir. Bunlar ligasyon sırasında çökelti olmadığından emin olmak için zaman zaman reaksiyon tüpü kontrol edin.Kuluçkadan sonra, PNK EDTA ve PNK tamponları ile yıkar, boncukkarışık PNK 40 mikrolitre ekleyin ve 10 dakika termal karıştırıcı ile 37 santigrat derece onları girdap. Boncukları PNK EDTA ve PNK arabellekleriyle yıkayın, ardından metin el yazmasında açıklandığı gibi RNA yalıtımı ile devam edin. FLAG aracılı veya streptavidin aracılı bir adım afinite saflaştırma ile karşılaştırıldığında, FLAG-Biotin tandem arıtma hemen hemen tüm çekirdek saflaştırılmış proteinler kaldırıldı, dolaylı protein RNA etkileşimlerinin kontaminasyon kaçınarak.LIN28 ve WDR43, Fbio CLIP-seq fare embriyonik KÖK hücreleri kullanılarak yapıldı. Lin28 ve WDR43 için toplamda yaklaşık 7,7 milyon ve 2,2 milyon benzersiz okuma alındı. Parça görünümlerinin karşılaştırılması RN45 öncesi rRNA locusundaki farklı bağlama desenleri gösterir.LIN28, Fbio CLIP-seq tarafından pre-let7-g RNA GGA G motifi üzerinde çapraz bağlantılı siteler veya tanımlanır. Ayrıca bağlayıcı bölgelerde zenginleştirilmiş RNA motifleri ve mutasyona uğramış nükleotitlerin farklı mutasyon türlerindeki yüzdesi belirlendi. LIN28'in gen nükleotitine bağlanmayı tercih ettiğini gösteriyor.Saat 22:00'de, bu protokol, immünopresidasyonun verimliliğini doğrulamak ve proteinin sadece komplekslerinin başarıyla saflaştırıldığından emin olmak için önemlidir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Kromatin İmmunopresipitasyon Yöntemi Kullanılarak c-KIT Ligand Promotör Analizi

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Genetik

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

RNA sentezi 5-Bromouridine etiketleme ve Immunoprecipitation kullanarak incelenmesi

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Organizatörü yakalama Merhaba-C: Yüksek çözünürlüklü, genom çapında organizatörü etkileşimlerin profil oluşturma

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Kromatin Immunoprecipitation fare kahverengi yağ dokusunun

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multiplex PCR ve kapiller Elektroforez tarafından çok-Locus değişken-sayı tandem-balık tekrar Analizi-patojen Bakterium Yersinia ruckeri

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-boru Elektroporasyon tarafından aracılı hassas gen düzenleme

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

RNA 'nın ayak Izleri tanımlaması: proteinli kompleksleri RNA Immunoprecipitation ile tandem sonra sıralamayı (RIPiT-seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Dönüşüm, Genom Düzenleme ve Fenotipleme Azot sabitleme Tropikal Cannabaceae Ağaç Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...