Name: enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol
Uploaded: 2020-03-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل منحة تطوير العلماء (11SDG5190025) من جمعية القلب الأمريكية (إلى A.R.D.) ، والمعهد الوطني للصحة R01 يمنح AA-023764 (إلى A.N.B.) ، وHL-104631 و R37 AA-11560 (إلى A.M.D).

تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية مع الحيوانات في مركز العلوم الصحية بجامعة تينيسي (UTHSC). تم مراجعة رعاية الحيوانات والبروتوكولات التجريبية والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها التابعة لـ UTHSC ، وهي مؤسسة معتمدة من قبل جمعية تقييم واعتماد المنظمة الدولية لرعاية الحيوانا...

تشكل طرق إثراء أنسجة الثدييات والخلايا وأوسيتس زينوبوس مع الكوليسترول أداة قوية للتحقيق في تأثير مستويات الكوليسترول المرتفعة على الأنواع الجزيئية الفردية ، وعلى الأنظمة الجزيئية المعقدة (مثل البروتينات) ، وعلى وظيفة الجهاز الخلوي والجهاز. وقد وصفنا في هذه الورقة نهجين متكاملين يي...

الكوليسترول، والدهون الخلوية الرئيسية، يلعب العديد من الأدوار الوظيفية والهيكلية الحرجة1،,2،,3،,4،,5،,6،,7،,8،,9. من تنظيم الخصائص الفيزيائية لغشاء البلازما إلى ضمان بقاء الخلية والنمو والانتشار ، والعمل كجزيء إشارة وسلائف في عدد كبير من المسارات الكيميائية الحيوية ، الكوليسترول هو مكون ضروري لوظيفة الخلية والجهاز الطبيعي. ونتيجة لذلك، يؤدي نقص الكوليسترول إلى تشوهات جسدية حادة ومجموعة متنوعة من الاضطرابات. من ناحية أخرى ، حتى زيادة صغيرة في الكوليسترول فوق المستويات الفسيولوجية (2-3x) هي سامة للخلايا1،2،10 وقد ارتبطت بتطور الاضطرابات ، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية11،12،13 والأمراض العصبية التنكسية14،15،16،17. وهكذا، لاستجواب الوظائف الحرجة للكولسترول وتحديد تأثير التغيرات في مستويات الكوليسترول، تم تطوير النهج المختلفة التي تغير محتوى الكوليسترول في الأنسجة والخلايا والبويضات Xenopus.
تغير مستويات الكوليسترول في أنسجة الثدييات والخلايا يمكن تسخير العديد من النهج لتقليل مستويات الكوليسترول في الأنسجة والخلايا18. نهج واحد ينطوي على تعرضهم للستاتين الذائبة في مصل نقص البروتين الدهني لمنع اختزال HMG-CoA, الذي يتحكم في معدل تخليق الكوليسترول19,,20. ومع ذلك ، فإن هذه الأدوية المخفضة للكوليسترول تمنع أيضًا تشكيل منتجات غير ستيرول على طول مسار الميفالونات. لذلك ، يتم إضافة كمية صغيرة من الميفالونات للسماح بتشكيل هذه المنتجات21 وتعزيز خصوصية هذا النهج. نهج آخر لخفض مستويات الكوليسترول ينطوي على استخدام α-cyclodextrins. هذه مونومرات glucopyranose تمتلك تجويف الهيدروفوبيا الداخلية مع القطر الذي يطابق حجم الستيرول22، مما يسهل استخراج الكوليسترول من الخلايا ، وبالتالي استنزافها من محتواها الأصلي الكوليسترول23. مثال على ذلك هو 2-هيدروكسي بروبيل-α-cyclodextrin (HPαCD)، وهو دواء ما قبل السريرية التي يجري اختبارها حاليا لعلاج مرض نيمان بيك من النوع C، وهو اضطراب التمثيل الغذائي القاتل الموروثة وراثيا تتميز تخزين الكوليسترول الليسوسومي24. مستوى نضوب الكوليسترول يعتمد على مشتق معين المستخدمة. على سبيل المثال ، يستخرج HPαCD الكوليسترول بسعة أقل من مشتق الميثيل ، ميثيل - α - سيكلوديكسترين (MαCD)24،25، 26،27،,2828،29،30. ومع ذلك ، ومع ذلك ، يمكن أن استخراج الجزيئات الأخرى الكارهة للماء بالإضافة إلى الكوليسترول ، والتي قد تؤدي بعد ذلك إلى آثار غير محددة31. على النقيض من النضوب ، يمكن إثراء الخلايا والأنسجة على وجه التحديد مع الكوليسترول من خلال العلاج مع α-cyclodextrin التي تم تشبعها مسبقًا بالكوليسترول23. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا النهج كعنصر تحكم لخصوصية α-cyclodextrins المستخدمة لاستنفاد الكوليسترول31. استنفاد الكوليسترول من الأنسجة والخلايا أمر مباشر ويمكن تحقيقه عن طريق تعريض الخلايا لمدة 30-60 دقيقة إلى 5 mm MαCD مذابة في المتوسط المستخدم لتخزين الخلايا. هذا النهج يمكن أن يؤدي إلى انخفاض بنسبة 50٪ في محتوى الكوليسترول (على سبيل المثال، في الخلايا العصبية فرس النهر32، الشرايين الدماغية الفئران33). من ناحية أخرى ، يعد مجمع الكوليسترول في الدم لتخصيب الكوليسترول في الأنسجة والخلايا أكثر تعقيدًا ، وسيتم وصفه في قسم البروتوكول.
نهج بديل لإثراء الأنسجة والخلايا باستخدام α-cyclodextrin المشبعة الكوليسترول ينطوي على استخدام LDL, الذي يعتمد على مستقبلات LDL أعرب في الأنسجة / الخلايا18. في حين أن هذا النهج يوفر ميزة استخدام آلات التوازن الكوليسترول الطبيعي في الخلية ، إلا أن لديها العديد من القيود. أولاً، لا يمكن إثراء الأنسجة والخلايا التي لا تعبر عن مستقبلات LDL باستخدام هذا النهج. ثانياً، تحتوي جزيئات LDL على دهون أخرى بالإضافة إلى الكوليسترول. على وجه التحديد، LDL يتكون من البروتين ApoB100 (25٪) والدهون التالية (75٪): ~ 6-8٪ الكوليسترول، ~ 45-50٪ استر cholesteryl، ~ 18-24٪ فوسفوليبيدات، و ~ 4-8٪ triacylglycerols34. وبالتالي ، فإن تسليم الكوليسترول عبر جزيئات LDL غير محدد. ثالثا، قد تكون نسبة الزيادة في محتوى الكوليسترول من قبل LDL في الأنسجة والخلايا التي تعبر عن مستقبلات LDL أقل بكثير من الزيادة التي لوحظت باستخدام السيكلودكسترين المشبعة بالكوليسترول. على سبيل المثال ، في دراسة سابقة ، أدى إثراء الشرايين الدماغية القوارض مع الكوليسترول عن طريق LDL إلى زيادة 10-15٪ فقط في مستويات الكوليسترول35. في المقابل، أدى إثراء هذه الشرايين مع السيكلوديكسترين المشبعة الكوليسترول كما هو موضح في قسم البروتوكول في > 50٪ زيادة في محتوى الكوليسترول (انظر قسم النتائج التمثيلية، الشكل 1).
تغيير مستويات الكوليسترول في البويضات Xenopus تشكل البويضات الزينية نظام تعبير غير يروج يستخدم عادة لدراسة وظيفة الخلية والبروتين. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن نسبة الكوليسترول إلى الفوسفوليبيد المولي في البويضات Xenopus هو 0.5 ± 0.136. بسبب هذا المستوى المرتفع الجوهري من الكوليسترول ، فإن زيادة محتوى الكوليسترول في هذا النظام أمر صعب ، ومع ذلك يمكن تحقيقه باستخدام التشتت اتّسابه من فوسفوليبيدات الغشاء والكوليسترول. الفوسفوليبيدات التي اخترناها لهذا الغرض مماثلة لتلك المستخدمة لتشكيل ثنائيات الدهون البلانية الاصطناعية وتشمل L-α-phosphatidylethanolamine (البابا) و 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS)، كما هو موضح في قسم البروتوكول. يمكن أن يؤدي هذا النهج إلى زيادة بنسبة 50٪ في محتوى الكوليسترول (انظر قسم النتائج التمثيلية، الشكل 2).
نهج بديل لإثراء البويضات Xenopus مع التشتت القائم على الفوسفوليبيد ينطوي على استخدام السيكلوديكسترين المشبعة الكوليسترول، والتي تشبه الطريقة التي يتم إثراء الأنسجة والخلايا. ومع ذلك ، وجدنا أن هذا النهج منخفض القابلية للاستنساخ والكفاءة ، مع زيادة في متوسط ~ 25٪ في محتوى الكوليسترول. وربما يرجع ذلك إلى اختلاف قدرة التحميل على هذين النهجين (انظر قسم النتائج التمثيلية، الشكل 3). في المقابل، فقد تبين أن استخدام السيكلوديكسترين لاستنفاد الكوليسترول من البويضات Xenopus يمكن أن يؤدي إلى انخفاض ~ 40٪ في محتوى الكوليسترول36.
هنا، ونحن نركز على إثراء الكوليسترول من أنسجة الثدييات والخلايا من خلال تطبيق السيكلوديكسترين المشبعة الكوليسترول، وoocytes Xenopus باستخدام الليبوزومات. ويمكن تسخير كلا النهجين لتحديد تأثير زيادة مستويات الكوليسترول في الدم على وظيفة البروتين. قد تنطوي آليات تعديل الكوليسترول في وظيفة البروتين على تفاعلات مباشرة8 و / أو تأثيرات غير مباشرة9. عندما يؤثر الكوليسترول على وظيفة البروتين من خلال التفاعلات المباشرة ، فإن تأثير زيادة مستويات الكوليسترول على نشاط البروتين من المرجح أن يكون مستقلًا عن نوع الخلية أو نظام التعبير أو نهج الإثراء. على سبيل المثال، استوعنا هذين النهجين لتحديد تأثير الكوليسترول على G-بروتين مسور ة داخليتصحيح قنوات البوتاسيوم (GIRK) أعرب في myocytesالأذين37،الخلايا العصبية فرس النهر32،38، HEK29339 الخلايا ، وأوسيتس Xenopus 32،37. وكانت النتائج التي تم الحصول عليها في هذه الدراسات متسقة: في جميع الأنواع الثلاثة من خلايا الثدييات وفي البويضات البرمائية الكولسترول upregulationed وظيفة قناة GIRK (انظر قسم النتائج التمثيلية، الشكل 4،للخلايا العصبية فرس النهر والتجارب المقابلة في oocytes Xenopus). وعلاوة على ذلك، كانت الملاحظات التي أبديت في هذه الدراسات أيضا متسقة مع نتائج الدراسات التي أجريت في myocytes الأذينية37،40 وخلايا فرس النهر32،38 معزولة حديثا عن الحيوانات التي تتعرض لنظام غذائي عالي الكوليسترول40. وتجدر الإشارة إلى أن تخصيب الكوليسترول في الخلايا العصبية فرس النهر باستخدام MαCD عكس تأثير العلاج أتورفاستاتين المستخدمة لمعالجة تأثير النظام الغذائي ارتفاع الكوليسترول على حد سواء على مستويات الكوليسترول ووظيفة GIRK38. في دراسات أخرى، قمنا بدراسة تأثير الطفرات على حساسية الكوليسترول في قناة البوتاسيوم تصحيح داخلي Kir2.1 باستخدام كل من oocytes Xenopus وHEK293 خلايا41. مرة أخرى ، كان تأثير الطفرات على حساسية القناة مماثلًا في النظامين.
تطبيقات كل من أساليب التخصيب لتحديد تأثير ارتفاع مستويات الكوليسترول في الدم على الجزيئية، الخلوية، وظيفة الجهاز عديدة. على وجه الخصوص ، فإن استخدام مجمعات الكوليسترول السيكلوديكسترين لإثراء الخلايا والأنسجة شائع جدًا ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى خصوصيته. وتشمل الأمثلة الحديثة على هذا النهج تحديد تأثير الكوليسترول على تنشيط قناة HERG والآليات الأساسية42، واكتشاف أن الكوليسترول ينشط مستقبلات البروتين G المقترنة الملساء لتعزيز القنفذ إشارة43، وتحديد دور الكوليسترول في الميكانيكا الحيوية للخلايا الجذعية وadipogenesis من خلال البروتينات الرابط المرتبطة الغشاء44. في عملنا الخاص، وأننا تستخدم إثراء أنسجة الثدييات مع MαCD: مجمع الكوليسترول لدراسة تأثير تخصيب الكوليسترول على الوظيفة الأساسية والشخصية الدوائية من قنوات الكالسيوم والجهد المسورة من التوصيلات الكبيرة (BK، MaxiK) في العضلات الملساء الأوعية الدموية35،45،46. في دراسات أخرى، استخدمنا نهج التشتت القائم على الفوسفوليبيد لإثراء oocytes Xenopus مع الكوليسترول لتحديد أدوار المناطق المختلفة في Kir2.1 وقنوات GIRK في حساسية الكوليسترول41،47،48،49، وكذلك لتحديد مواقع ربط الكوليسترول المفترضة في هذه القنوات32،50،51.47

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PE 25Mg in Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840022C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol 100Mg Powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-034-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>MX0070-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Tank</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S35818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight Syringe 100uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringe 25uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>8120-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support Stand</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-STAN5X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Clamp, 3-Prong</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-CLPUNIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
			<td>G112SP1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D rotator mixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D 1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR781602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beakers 40ml-1L</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Machine</td>
			<td>Scotsman</td>
			<td>CU1526MA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-136-7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bottles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-251-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Disposable Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-678-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>50-998-944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp&#8482; BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>97-990E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocytes</td>
			<td>Xenoocyte&#8482;</td>
			<td>10005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>weight 250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath incubator with shaker</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51221080</td>
			<td>Lowest shaker setting O/N 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAE0088-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4%</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI H2O</td>
			<td>University DI source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides 75x25mm Frosted</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15978A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15972B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Revlon</td>
			<td>771 Clear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Securline Lab Marker II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z648205-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10mL Syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28150-958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KimWipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Sartorus</td>
			<td>py-p112s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Denver instrument</td>
			<td>Model 225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ETOH</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>211USP/NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steno book</td>
			<td>Staples</td>
			<td>163485</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol

يمكن تحقيق إثراء الكوليسترول في أنسجة الثدييات والخلايا ، بما في ذلك البويضات Xenopus المستخدمة لدراسة وظيفة الخلية ، باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق. وهنا، نصف نهجين هامين يستخدمان لهذا الغرض. أولاً، نحن نصف كيفية إثراء الأنسجة والخلايا مع الكوليسترول باستخدام السيكلوديكسترين المشبعة الكوليسترول باستخدام الشرايين الدماغية (الأنسجة) والخلايا العصبية فرس النهر (الخلايا) كأمثلة. يمكن استخدام هذا النهج لأي نوع من الأنسجة أو الخلايا أو خطوط الخلايا. نهج بديل لتخصيب الكوليسترول ينطوي على استخدام البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL). ميزة هذا النهج هو أنه يستخدم جزءا من آلات التوازن الكوليسترول الطبيعي في الخلية. ومع ذلك، في حين يمكن تطبيق نهج السيكلوديكسترين لإثراء أي نوع من الخلايا من الفائدة مع الكوليسترول، ويقتصر نهج LDL على الخلايا التي تعبر عن مستقبلات LDL (على سبيل المثال، خلايا الكبد، والخلايا المشتقة من نخاع العظام مثل الكريات البيض الدم والبلفة الأنسجة)، ومستوى الإثراء يعتمد على تركيز وحركة مستقبلات LDL. وعلاوة على ذلك، تشمل جزيئات LDL الدهون الأخرى، لذلك تسليم الكوليسترول غير محدد. ثانياً، نحن نصف كيفية إثراء البويضات الزينية مع الكوليسترول باستخدام التشتت القائم على الفوسفوليبيد (أي الليبوزومات) التي تشمل الكوليسترول. تشكل البويضات الزينية نظام تعبير غير منطقي شائع يستخدم لدراسة وظيفة الخلية والبروتين. لكل من نهج تخصيب الكوليسترول القائم على السيكلودكسترين من أنسجة الثدييات (الشرايين الدماغية) ولنهج تخصيب الكوليسترول القائم على الفوسفوليبيد من البويضات Xenopus ، نبرهن على أن مستويات الكوليسترول تصل إلى الحد الأقصى بعد 5 دقيقة من الحضانة. يبقى هذا المستوى من الكوليسترول ثابتًا خلال فترات الحضانة الممتدة (على سبيل المثال، 60 دقيقة). معا، توفر هذه البيانات الأساس للظروف الزمنية الأمثل لإثراء الكوليسترول من الأنسجة والخلايا، وoocytes Xenopus للدراسات الوظيفية التي تهدف إلى استجواب تأثير تخصيب الكوليسترول.

استخدام السيكلوديكسترين المشبعة بالكوليسترول كوسيلة لإثراء الأنسجة والخلايا مع الكوليسترول هو راسخ. هنا، ونحن أول من إظهار تطبيق هذا النهج المستخدمة على نطاق واسع لإثراء الشرايين الدماغية الفئران مع الكوليسترول باستخدام MβCD المشبعة الكوليسترول. يوضح الشكل...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol at JoVE.com

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

يتم تقديم طريقتين لتخصيب الكوليسترول: تطبيق السيكلوديكسترين المشبعة بالكوليسترول لإثراء أنسجة الثدييات والخلايا ، واستخدام التشتت القائم على الفوسفوليبيد التخصيب للكوليسترول (الليبوزومات) لإثراء البويضات الزينيوبوس. هذه الطرق مفيدة لتحديد تأثير ارتفاع مستويات الكوليسترول في الجسم في وظائف الجزيئية والخلوية والجهاز.

إثراء الأنسجة الثديية وأوسيتس زينوبوس مع الكوليسترول

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

ارتفاع نسبة الكوليسترول في الدم هو عامل خطر رئيسي لمرض القلب والأوعية الدموية والأمراض العصبية. توفر بروتوكولاتنا أدوات قيمة لدراسة كل من العواقب الفسيولوجية والميكانيكية لفرط الكوليسترول. يمكن تنفيذ هذه الإجراءات باستخدام معدات المختبر الأساسية، وهي قابلة للتطبيق على الخلايا والأنسجة والبويضات Xenopus.الكولسترول هو عنصر رئيسي من الأغشية الخلوية في جميع أنحاء الجسم. يمكن استخدام هذه التقنيات لدراسة تأثير ارتفاع مستويات الكوليسترول في أي نوع من الخلايا. تشريح الشرايين هو الخطوة الأكثر صعوبة.إزالة الشريان بعناية من الدماغ، دون تمديد أو إتلاف الأنسجة الوعائية. الدهون حساسة جدا، والعمل معهم هو أكثر من فن من العلم. مظاهرة الفيديو يوفر دليلا لتعلم كيفية التعامل مع الدهون بعناية.لإعداد محلول ميثيل-بيتا-cyclodextrin المشبع بالكوليسترول، أضف أولاً 064 جراماً من الميثيل بيتا-سيكليكسسترين إلى 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، مع تحريك الحل بعارضة مثيرة، لضمان أن يذوب الميثيل بيتا-سيكلويكسسترين بشكل كامل. بعد ذلك، أضف 0024 جرامًا من مسحوق الكوليسترول إلى القارورة، وحرك المحلول بقوة، باستخدام ملعقة لتفريق أكبر عدد ممكن من قطع الكوليسترول. عندما تم حل ما يقرب من كل الكوليسترول، وختم قارورة مع طبقتين على الأقل من فيلم البارافين.وهز القارورة في حوالي 30 تذبذب في الدقيقة الواحدة في حمام مائي 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد ثماني إلى 16 ساعة، تبريد الحل لدرجة حرارة الغرفة، قبل تصفية الخليط من خلال 22 ميكرومتر البولي إيثرسولفون مرشاح حقنة في زجاجة فئة. لإثراء الشريان الدماغي الثدييات، حصاد الدماغ من 250 إلى 300 غرام Sprague داولي الفئران في منقار من برنامج تلفزيوني على الجليد، قبل نقل الدماغ إلى وعاء تشريح مشمع، تحت مجهر تشريح، تحتوي على ما يكفي من برنامج تلفزيوني لغمر الأنسجة.تأمين الدماغ مع اثنين إلى ثلاثة دبابيس، والتأكد من أنها لا تخترق الأوعية الدموية. واستخدام ملقط حادة ومقص جراحي صغير لتشريح الشرايين الدماغية وأغصانها التي تشكل دائرة ويليس في قاعدة الدماغ بلطف. المقبل، شطف لفترة وجيزة تصل إلى شرائح الشريان سنتيمتر واحد طويلة في برنامج تلفزيوني، قبل احتضان شرائح مشطف في محلول ما يكفي من الكوليسترول إثراء لتغطية الأنسجة.لتحديد أي تعديلات في مستوى الكوليسترول ، استخدم زجاجة جديدة من مسحوق Filipin لإعداد محلول مخزون 10 ملليغرام لكل ملليلتر من الصبغة في سلفوكسيد الديثييل ، وغسل الأنسجة الغنية بالكوليسترول مع ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق في PBS الطازجة. بعد الغسيل الأخير، قم بإصلاح شرائح الشرايين في 4٪ شبه شكلي للدهايد لمدة 15 دقيقة على الجليد، محمية من الضوء، قبل أن يتم تحديد العينات في 5٪ تريتون في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، اغسل الأنسجة بثلاث غسلات لمدة خمس دقائق في PBS على شاكر ، قبل إضافة العينات إلى تركيز نهائي 25 ميكروغرامًا لكل ملليلتر من محلول صبغة الفيليبين ، لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء.في نهاية الحضانة ، اغسل قطع الشريان ثلاث مرات كما هو موضح ، تليها شطف قصيرة مع الماء المقطر. بعد الغسيل الأخير، استخدم نسيجاً مختبرياً لامتصاص أي سائل زائد، واركب الشرايين على شريحة باستخدام وسيلة مناسبة للتركيب. تغطية بعناية الشرايين مع زلة الغطاء، مع الحرص على تجنب المتداول أو التواء من الأنسجة، والسماح للشريحة الجافة لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة، وحمايتها من الضوء.عندما يكون متوسط التركيب جافًا، قم بختم حواف زلة الغطاء بتلميع الأظافر الواضح، والسماح للتلميع بالجفاف لمدة 10 إلى 15 دقيقة. ثم، صورة الأنسجة مع إثارة من 340 إلى 380 نانومتر، وانبعاث من 385 إلى 470 نانومتر. لإعداد التشتت القائم على الفوسفاتية ، والجمع بين 200 ميكرولترات من 10 ملليغرام لكل ملليلتر محلول الدهون المذابة ، L-ألفا - فوسفاتيديلينولامين ، 1 - Palmitoyl -2 - أوليول - sn-glycero -3 -phosphocholine ، والكوليسترول في أنبوب زجاجي 12 ملليلتر.يتبخر الكلوروفورم في غطاء محرك السيارة تحت تيار من النيتروجين، قبل تعليق الدهون في 800 ميكرولترات من كلوريد البوتاسيوم 150 ملليمولار ومخزنة 10 ملليمترات تريس هيبس الحل. ثم ختم أنبوب مع فيلم البارافين، و sonicate بلطف محتويات الأنبوب في 80 كيلوهيرتز لمدة 10 دقائق، حتى يتم تشكيل خليط حليبي. لإثراء الكوليسترول من البويضات Xenopus، استخدم ملقط حادة لتعطيل كيس المبيض من ضفدع Xenopus الإناث في مناطق متعددة، ووضع قطع المبيض في لوحة 60 ملليمتر مع خمسة ملليلتر من الكالسيوم ND96 مجانا تستكمل مع 5 ملليغرام لكل ملليلتر من الكولاجيناز.هز النسيج على شاكر مداري في 60 تذبذب في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، استخدم ماصة نقل مع طرف واسع إلى ماصة بقوة البويضة التي تحتوي على حل خمس إلى 10 مرات لعزل البويضات الفردية، وشطف بسرعة حل البويضة الداكنة مع ND96 خال من الكالسيوم الطازج حتى يصبح الحل شفافا. بعد ذلك، نقل 90 ميكرولترات من تشتت الفوسفوروليبيد المخصب بالكولسترول إلى بئر واحد من 96 بئرا، وإضافة ما يصل إلى ستة بويضات إلى البئر مع أقل متوسطة قدر الإمكان.ضع لوحة 96 بئرًا على جهاز تدوير منصة ثلاثي الأبعاد لمدة خمس إلى 10 دقائق. ثم إضافة قطرة من ND96 إلى البئر، ونقل البويضات المخصبة الكوليسترول إلى لوحة 35 ملليمتر تحتوي على ND96 لتحليلها على الفور. هنا، مثال على صورة الشريان الدماغي طبقة العضلات الملساء يوضح زيادة التركيز تعتمد في الفلورين المرتبطة filipin الحصول على على إثراء الأنسجة مع زيادة تركيزات الكوليسترول.لا سيما ثلاث ساعات بعد العلاج مع عقدة الكولسترول ميثيل بيتا-سيكلوسيكسترين انخفضت مستويات الكوليسترول بنسبة 50٪ تقريبا مقارنة بمستوىها مباشرة بعد التخصيب. في حين أن وقت الحضانة ساعة واحدة يستخدم عادة لإثراء الأنسجة والخلايا مع الكوليسترول خلال هذا النهج, خمس دقائق من الحضانة عادة ما تكون كافية لتحقيق زيادة هامة إحصائيا في محتوى الكوليسترول في الدم الشرياني الدماغي كما يحددها الكولسترول أوكسيديز القائمة على الإحصاءات الكيميائية الحيوية. في حين لم يلاحظ أي تغيير كبير في مستويات الكوليسترول في البويضات Xenopus المخصب مع تشتت الفوسفاتية التحكم على أساس تفتقر إلى الكوليسترول، مستويات الكوليسترول زيادة كبيرة بعد خمس دقائق فقط من العلاج مع تشتت الفوسفاتية القائمة التي تشمل الكوليسترول، وتبقى عند هذا المستوى عندما يتم زيادة وقت الحضانة إلى 60 دقيقة.كما أظهرت فعالية النهج القائم على السيكلوديكسترين لإثراء الخلايا في الخلايا العصبية المعزولة حديثا من منطقة CA1 من قرن آمون. في الواقع, احتضان الخلايا العصبية في ميثيل بيتا-سيكلوديكسترين المشبعة بالكوليسترول لمدة 60 دقيقة النتائج في زيادة أكثر من مرتين في مستويات الكوليسترول, كما تم تقييمها من قبل الفلوري المرتبطة filipin. عموما، فإن أهم خطوتين لهذه الإجراءات هي إعداد خليط إثراء الكوليسترول وضمان سلامة الأنسجة الشريانية.بعد التخصيب الكولسترول, يمكن للمرء أن دراسة وظيفة البروتينات التي تتأثر ارتفاع الكوليسترول. القدرة على إثراء الخلايا مع الكوليسترول في الدم سهل دراسة مستويات الكوليسترول المرتفعة في خلايا القلب والخلايا العصبية. استخدام البويضات سمح لنا للتحقيق في كيفية ربط الكوليسترول إلى قنوات الأيونات.معطف المختبر والقفازات التي ترتديها دائما لهذا البروتوكول. وينبغي استخدام الكلوروفورم وشبه الشكل دهدهيد تحت غطاء أبخرة، والتخلص منها كنفايات خطرة.

enrichment-of-mammalian-tissues-and-xenopus-oocytes-with-cholesterol

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

الجهد المشبك فلوروميتري في<em&gt; القيطم</em&gt; البويضات باستخدام الفلورسنت الأحماض الأمينية غير طبيعية

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain. The ionic detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) effectively solubilizes natively folded proteins in brain tissue allowing the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from a wide range of neurodegenerative proteinopathies, such as Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease and amyotrophic lateral sclerosis, and prion diseases. Human control and AD postmortem brain tissues were homogenized and sedimented by ultracentrifugation in the presence of sarkosyl to enrich detergent-insoluble protein aggregates including pathologic phosphorylated tau, the core component of neurofibrillary tangles in AD. Western blotting demonstrated the differential solubility of aggregated phosphorylated-tau and the detergent-soluble protein, Early Endosome Antigen 1 (EEA1) in control and AD brain. Proteomic analysis also revealed enrichment of &#946;-amyloid (A&#946;), tau, snRNP70 (U1-70K), and apolipoprotein E (APOE) in the sarkosyl-insoluble fractions of AD brain compared to those of control, consistent with previous tissue fractionation strategies. Thus, this simple enrichment protocol is ideal for a wide range of experimental applications ranging from Western blotting and functional protein co-aggregation assays to mass spectrometry-based proteomics.

An abbreviated fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain is described.

إثراء مجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من الدماغ البشري تشريح الجثة

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s disease afflicting primarily the central nervous system, and systemic amyloidosis where serum amyloid A, transthyretin and IgG light chains deposit as amyloid in liver, carpal tunnel, spleen, kidney, heart, and other peripheral tissues. Amyloid has been known and studied for more than a century, often using amyloid specific dyes such as Congo red and Thioflavin T (ThT) or Thioflavin (ThS). In this paper, we present heptamer-formyl thiophene acetic acid (hFTAA) as an example of recently developed complements to these dyes called luminescent conjugated oligothiophenes (LCOs). hFTAA is easy to use and is compatible with co-staining in immunofluorescence or with other cellular markers. Extensive research has proven that hFTAA detects a wider range of disease associated protein aggregates than conventional amyloid dyes. In addition, hFTAA can also be applied for optical assignment of distinct aggregated morphotypes to allow studies of amyloid fibril polymorphism. While the imaging methodology applied is optional, we here demonstrate hyperspectral imaging (HIS), laser scanning confocal microscopy and fluorescence lifetime imaging (FLIM). These examples show some of the imaging techniques where LCOs can be used as tools to gain more detailed knowledge of the formation and structural properties of amyloids. An important limitation to the technique is, as for all conventional optical microscopy techniques, the requirement for microscopic size of aggregates to allow detection. Furthermore, the aggregate should comprise a repetitive &#946;-sheet structure to allow for hFTAA binding. Excessive fixation and/or epitope exposure that modify the aggregate structure or conformation can render poor hFTAA binding and hence pose limitations to accurate imaging.

Amyloid deposition is a hallmark of different diseases and afflicts many different organs. This paper describes the application of luminescent conjugated oligothiophene fluorescence staining in combination with fluorescence microscopy techniques. This staining method represents a powerful tool for detection and exploration of protein aggregates in both clinical and scientific setups.

تصوير الأنسجة اميلويد ملطخة بالانارة أوليجوثيوفينيس مترافق بالفائقة الطيفية [كنفوكل] مجهرية والأسفار تصوير مدى الحياة

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

تحليل توبرينتينج "الترجمة بدء تشكيل معقدة" في مرناس الثدييات

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

التعبير وتنقية قنوات أيون بيستروفين الثدييات

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

دراسة التمثيلات الحمض النووي الريبي للبروتين كيناز المنشط الجيش الملكي النيبالي خلال دورة الخلية الثديية

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of noncoding microRNA (miRNA). In general, miRNA alters the protein expression profile due to interactions with messenger-RNA (mRNA). Thus, knowledge of the relative and absolute miRNA content of lipoprotein particles is essential to estimate the biological effect of cellular particle uptake. Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR)-based protocol is presented to determine the absolute miRNA content of lipoprotein particles&#8212;exemplified shown for native and miRNA-enriched lipoprotein particles. The relative miRNA content is quantified using multiwell microfluidic array cards. Furthermore, this protocol allows scientists to estimate the cellular miRNA and, thus, the lipoprotein particle uptake rate. A significant increase of the cellular miRNA level is observable when using high-density lipoprotein (HDL) particles artificially loaded with miRNA, whereas incubation with native HDL particles yields no significant effect due to their rather low miRNA content. In contrast, the cellular uptake of low-density lipoprotein (LDL) particles&#8212;neither with native miRNA nor artificially loaded with it&#8212;did not alter the cellular miRNA level.

Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction-based protocol is presented for the determination of the native micro-RNA content (absolute/relative) of lipoprotein particles. In addition, a method for increasing the micro-RNA level, as well as a method for determining the cellular uptake rate of lipoprotein particles, is demonstrated.

إثراء جزيئات البروتين الدهني الأصلي مع ميكرورنا والتحديد اللاحق لمحتوياتها المطلقة/النسبية ميكرورنا ومعدل نقلها الخلوي

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. Measurement of cellular CoA is a challenge due to its relatively low abundance and the dynamic conversion of free CoA to CoA thioesters that, in turn, participate in numerous metabolic reactions. A method is described that navigates through potential pitfalls during sample preparation to yield an assay with a broad linear range of detection that is suitable for use in many biomedical laboratories.

This method describes sample preparation from cultured cells and animal tissues, extraction and derivatization of coenzyme A in the samples, followed by high pressure liquid chromatography for purification and quantification of the derivatized coenzyme A by absorbance or fluorescence detection.

القياس الكمي لانزيم A في الخلايا والانسجه

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...